Metody analýzy mikroorganismů doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. Přírodovědecká fakulta MU, 2013 bartosm@vfu.cz Obsah přednášky 1) Přímý průkaz v bakteriologii 2) Nepřímý průkaz v bakteriologii 3) Přímý průkaz virů 4) Nepřímý průkaz virů 5) Vyšetřovací metody v parazitologii 6) Mykologické vyšetřovací metody Doporučená literatura Votava et al. (2010): Lékařská mikrobiologie vyšetřovací metody. Neptun, Brno Účel mikrobiologického vyšetření Zjistit, který mikroorganismus je příčinou onemocnění, tedy prokázat etiologické agens infekce.  průkaz přímý  průkaz nepřímý Přímý průkaz spočívá v nalezení mikroorganismu nebo jeho komponent ve vyšetřovaném vzorku Nepřímý důkaz je založen na průkazu specifických stop zanechaných mikroorganismem v organismu (nejčastěji protilátky) Metody přímého průkazu Klasické postupy  Mikroskopický průkaz  Kultivace (izolace)  identifikace  stanovení citlivosti na antibiotika Moderní (nekultivační) postupy  Průkaz antigenů  Průkaz nukleových kyselin  Průkaz jiných chemických složek Metody nepřímého průkazu  Precipitace  Aglutinace Aglutinace na nosičích  Vazba komplementu  Neutralizace  Metody se značenými složkami Imunofluorescence ELISA Western blot, aj. Mikroskopie  Světelný  Fluorescenční  Elektronový  Transmisní  Skenovací (rastrovací, konfokální)  … Jaké znáte typy mikroskopů? Podívejte se například sem: http://www.fzu.cz/popularizace/elektronovym-mikroskopem-do- nitra-materialu-aneb-jak-vypada-jejich-struktura Mikroskopický preparát Nativní Jaké znáte typy mikroskopických preparátů? Zjistěte 1) Co to je „louhový preparát? 2) Kde se používá? Fixovaný  Mikroorganismy v nativním stavu – živé  Fyziologický roztok nebo růstové médium  Mikroorganismy jsou umrtveny a zafixovány k podložnímu sklíčku  Tyto preparáty se barví Příprava fixovaného preparátu 1) Nátěr 2) Fixace nátěru  nesmí být ani tlustý ani tenký  lze připravit podobně jako krevní nátěr  vzácně tzv. otisk 3) Barvení preparátu  Šetrná denaturace bakteriálních proteinů  Fixace teplem  Chemická fixace dle Labranky impregnace stříbrem negativní dle Burriho Zopakujme si druhy barvení velikost, tvar, uspořádání JEDNODUCHÁ odlišení jednotlivých skupin DIAGNOSTICKÁ Gram+, Gram-, gramlabilní GRAMOVO nepřijímají běžná barviva, Mycobacterium ACIDOREZISTENTNÍ Prvoci, riketsie, chlamydie GIEMSA-ROMANOVSKI dle Fleminga endospóry pouzdra granule bičíky Jak byste znázornili polysacharidovou matrix u biofilmů ? Barvení biofilmů? Buněčnou část standardními postupy Kultivace bakterií Co s narostlou bakteriální kulturou? Metody další diagnostiky mikroorganismu  Mikroskopické určení  Další kultivace a získání více materiálu  Biochemická charakteristika  Antigenní analýza  Fagotypizace  Analýza nukleových kyselin  Stanovení citlivosti na antibiotika  Hmotnostní spektrofotometrie Biochemická charakteristika mikroorganismus substrát produkt enzym indikátor produkt reakce pozitivní reakce negativní ? Komerční diagnostické testy Prohlédněte si informace o ENTEROtestu od frimy Lachema na https://www.lachema.com/attachments/ENTEROtest%2016- CZ+SK+EN+RU+PL.pdf Stanovení citlivosti na antibiotika Kvalitativní Jaké znáte typy testů citlivosti na ATB? Kvantitativní  Diskový difuzní test  Stanovení MIC  E-testy Diskový difuzní test Vysvětlení testu najdete na http://old.lf3.cuni.cz/mikrobiologie/bak/uceb/obsah/disktest/disktest.htm Stanovení MIC Suspenze bakterií se nanese do komůrek destičky s rostoucí koncentrací antibiotika Minimální inhibiční koncentrace Co to je MBC? Minimální baktericidní koncentrace E-testy  E-test je proužek papíru napuštěný stoupající koncentrací antibiotika  Má vyznačené koncentrace antimikrobiální látky  Klade se na misku s naočkovanou suspenzí mikroorganismu  MIC se odečítá v místě protnutí proužku s inhibiční zónou  Inhibiční zóna má vejčitý tvar Průkaz antigenů Protilátku Co k průkazu antigenu potřebujeme?  polyklonální  monoklonální Jak průkaz provedeme?  aglutinací na pevném nosiči (latexová aglutinace)  koaglutinací na proteinu A z usmrcených stafylokoků Průkaz antigenu lze provést taky metodou ELISA nebo imunofluorescenčně Průkaz nukleových kyselin Genová sonda Metody amplifikační  Polymerázová řetězová reakce  Ligázová řetězová reakce  … Průkaz RNA Průkaz jiných chemických složek Průkaz toxinů  Botulotoxin  Stafylokokový enterotoxin  Endotoxin gramnegativních bakterií Průkaz dalších produktů metabolismu  Mastné kyseliny u anaerobů  Kyselina tuberkulostearová u M. tuberculosis  Značený CO2 u Helicobacter pylori Nepřímý průkaz Nepřímý důkaz je založen na průkazu specifických stop zanechaných mikroorganismem v organismu (nejčastěji protilátky) Zopakujme si, co to je … Nepřímý průkaz je většinou průkaz protilátek neboli průkaz serologický Metody nepřímého průkazu  Precipitace  Aglutinace Aglutinace na nosičích  Vazba komplementu  Neutralizace  Metody se značenými složkami Imunofluorescence ELISA Western blot, aj. Precipitace Precipitace prstencová antisérum antigen precipitát  sérologická reakce - antigen je koloidní povahy  precipitát vzniká vazbou antigenu a protilátky Flokulace rostoucí koncentrace antigenu flokulace v zóně ekvivalence Ouchterlonyho technika  precipitace využívající difúze v gelu vrstva agaru antisérum A A B C D C´ antigeny precipitační proužky Radiální imunodifúze dle Manciniové, imunoelektroforéza, vstřícná imunoelektroforéza, … Aglutinace Podívejte se na animaci aglutinace na http://labmet.zshk.cz/media.aspx?id=ALM007&TB_iframe=true&height =750&width=820  sérologická reakce - antigen je korpuskulární povahy  aglutinát vzniká vzájemným pospojováním částic antigenu molekulami protilátky NEG POZ Aglutinace na nosičích  Precipitace převedená na aglutinaci  Antigen koloidního charakteru nebo protilátka jsou navázány na povrch částice (latex) NEG POZ Podívejte se na animaci aglutinace na nosičích na http://labmet.zshk.cz/media.aspx?id=ALM007&TB_iframe=true&height =750&width=820 Vazba komplementu Komplement fixační reakce  Komplement se váže na komplex antigenprotilátka a dojde k jeho vyčerpání ze systému  Není-li antigen nebo protilátka přítomen, komplement se nevyčerpá  Komplement lyzuje erytrocyty  Vyčerpání komplementu = zábrana hemolýzy  Nevyčerpání komplementu = hemolýza Vyhodnocení komplement fixační reakce Co je tedy pozitivní reakce? Zábrana hemolýzy Protože je přítomna protilátka a komplement se vyčerpá vazbou na komplex antigen-protilátka A co je negativní reakce? Hemolýza Protilátka je nepřítomna a nevyčerpaný komplement lyzuje erytrocyty Neutralizace Sérologické reakce, při níž protilátka brání biologickým účinkům antigenu  ASLO (průkaz antistreptolyzinu), indikátorem jsou králičí erytrocyty  Virusneutralizační test  Hemaglutinačně inhibiční test  Průkaz antipneumolyzinu  Průkaz antistafylolyzinů  Test inhibice metabolismu  … Reakce se značenými složkami Imunofluorescence Sérologická reakce v níž je jedna složka označena fluorescenčním barvivem Nepřímá imunofluorescence  univerzální metoda  průkaz protilátek proti jakémukoli agens Antikomplementová imunofluorescence  vazba komplementu proběhlá na podložním sklíčku s fixovaným antigenem  k průkazu protilátek proti viru varicella-zoster a CMV ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Sérologická reakce v níž je jedna složka označena enzymem  Využívá kombinace enzymaticky značené protilátky se sorpcí některé složky na pevný povrch  Nekompetitivní (sendvičová) ELISA  Kompetitivní ELISA Typy metody ELISA Nekompetitivní (sendvičová) ELISA Primární Ab - sérum Sekundární Ab - konjugát Značka Kompetitivní ELISA Sekundární Ab - konjugát Značka Western blot  Imunoblot – varianta metody ELISA  Charakterizuje protilátkovou odpověď proti mnohočetným antigenům Jak se prokazují viry?  Průkaz přímý  Průkaz nepřímý Přímý průkaz virů  Mikroskopický průkaz  Průkaz virových antigenů sérologicky  Průkaz typických chemických substancí (průkaz nukleových kyselin)  Průkaz infekčního agens (izolace viru) Mikroskopický průkaz virů Elektronový mikroskop  Negativní kontrast Světelný mikroskopie  Barvení dle Giemsy – poxviry, rickettsie a chlamydie  Cytologický průkaz inkluzí (rabies virus) Průkaz virových antigenů Imunoenzymatická stanovení  Metoda ELISA v sendvičovém uspořádání Imunofluorescence  Rutinní diagnostika vztekliny, chřipky, aj. Radioimunologická analýza Precipitace a příbuzné techniky  Nahrazuje se imunometodami  Rotaviry, noroviry a adenoviry Imunní elektronová mikroskopie Průkaz nukleových kyselin Genová sonda Metody amplifikace DNA viry RNA viry Izolace viru Pěstování na kuřecích zárodcích Buněčné kultury Pokusná zvířata  Myši  Sající myšata  Morčata Produkce vakcíny proti chřipce HeLa buňky infikované adenovirem Nepřímý průkaz virů Komplement fixační reakce  Respirační virózy, neuroinfekce, … Reakce se značenými protilátkami  Imunofluorescence, ELISA, Western blot Neutralizační test Hemaglutinačně inhibiční test  Vysoce specifický, pracný a nákladný  Bližší určení virových izolátů  Druhá nejčastěji užívaná sérologická reakce ve virologii Se kterými bakteriemi se pracuje virologickými technikami? S rickettsiemi a chlamydiemi Vyšetřovací metody v parazitologii Přímý průkaz parazitů Žádná kultivace, ale morfologický průkaz Makroskopický Mikroskopický v nativním, otiskovém nebo barveném preparátu Průkaz parazitárních antigenů Ojediněle (u prvoků) průkaz nukleových kyselin Kultivace Trichomonas vaginalis Pokus na zvířeti u trypanosom, leishmanií a Toxoplasma gondii Nepřímý průkaz parazitů Prokazují se pouze protilátky  Diagnostika protozoóz a helmintóz  U nás především toxoplasmóza a larvární toxokaróza  Většinou se vzorky stolice, perianálních otisků a krve odesílají do spádových nebo referenčních laboratoří Znáte referenční laboratoř pro průkaz parazitů? Mykologické vyšetřovací metody Podobné metodám bakteriologickým  Mikroskopické vyšetření klinického materiálu  Kultivace vedoucí k identifikaci etiologického agens  Stanovení citlivosti k antimykotikům  Průkaz přítomnosti faktorů virulence  Méně často se využívá antigenní analýza a imunochemické metody  Nepřímý důkaz pro rychlou diagnostiku invazívních mykóz  Metody molekulárně-biologické pro identifikaci a typizaci agens Shrnutí 1) Přímý průkaz v bakteriologii 2) Nepřímý průkaz v bakteriologii 3) Přímý průkaz virů 4) Nepřímý průkaz virů 5) Vyšetřovací metody v parazitologii 6) Mykologické vyšetřovací metody