Izolace nukleových kyselin doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. Přírodovědecká fakulta MU, 2012 bartosm@vfu.cz Obsah přednášky 1) Základní informace o izolaci nukleových kyselin 2) Sled kroků při izolaci nukleových kyselin 3) Principy centrifugace 4) Specifické postupy ve zvláštních případech 5) Izolace nukleových kyselin z fágů 6) Spektrofotometrická analýza nukleových kyselin 7) Fluorometrické a kolorimetrické stanovení koncentrace DNA Doporučená literatura 1) Šmarda et al. (2005): Metody molekulární biologie, MU Brno 2) Brown (2007): Klonování genů a analýza DNA. Univerzita Palackého v Olomouci (1. české vydání, překlad 5. vydání) (vyšlo už 6. vydání v angličtině) Brown (2010): Gene Cloning and DNA Analysis. 6th edition, Wiley-Blackwell Izolace nukleových kyselin Nezbytná podmínka další práce … Izolace nukleových kyselin  izolace NA v nativním stavu z přirozeného materiálu v dostatečném množství a čistotě  zbavit NA všech látek po lyzi bakterií, virů nebo eukaryotických buněk (kvasinky, prvoci)  základ tvoří fenolová extrakce  výchozí materiálem jsou buňky Proč ??? Pro analýzu - genetické informace mikroorganismu … vůbec potřebujeme izolovat nukleové kyseliny z mikroorganismů? Pro syntézu – klonování a expresi genů  Potvrzení přítomnosti mikroorganismu ve vzorku  Klasifikaci druhu  Celkovou buněčnou DNA  Chromozomální nebo plasmidovou DNA  Fágovou DNA Poprvé izoloval nukleovou kyselinu … … Švýcarský vědec Friedrich Miescher v roce 1869  izoloval ji z hnisu v obvazech pacientů z nemocnice v Tübingenu  pojmenoval ji nuklein  obsahovala velké množství fosforu  později ji našel také ve spermatu lososů DNA (nukleoprotein) byla tedy poprvé izolována z eukaryotických buněk Čtyři jednoduché věci potřebujeme 1) Růst kultury a sedimentace buněk 2) Rozbití buněk a jejich obsahu 3) Zpracování buněčného extraktu – odstranění všeho kromě NA 4) Zahuštění výsledného roztoku Růst bakteriální kultury Zpravidla tekuté médium (suspenzní kultura) Pevná půda méně vhodná – nižší výtěžky Jak izolovat DNA z přirozeně rostoucích bakterií? Média pro kultivaci Definovaná a minimální média Nedefinovaná (komplexní) média Směs anorganických látek Všechny komponenty známy Zdroje uhlíku a energie Stopové prvky a vitamíny Luria-Bertani Složení není přesně známo Trypton nebo pepton Dostačující pro izolaci NA Namnožení Escherichia coli Podmínky  LB médium, 37°C  aerobní podmínky = rotační třepačka 150-250 rpm Čeho dosáhneme?  Zdvojení počtu buněk každých 20 minut  Maximální hustota 2-3 x 109 buněk/ml Jak to měřit?  Optická hustota při 600 nm  OD600 = 1  8 x 108 buněk/ml Množení fágů  Vnitrobuněční parazité  Nutno nechat narůst do vysokého titru  Izolovat z objemu kultury do 50 l  Vždy zajistit lytický cyklus Rovnováha mezi stářím kultury a velikostí inokula u lyzogenního fága Hustota kultury nízká Rychlá lyze buněk = nízká koncentrace fága Rovnováha mezi stářím kultury a velikostí inokula u lyzogenního fága Hustota kultury vysoká Kultura není úplně zlyzována = nízká koncentrace fága Rovnováha mezi stářím kultury a velikostí inokula u lyzogenního fága Hustota kultury optimální Kultura stále roste a lyzuje = vysoká koncentrace fága Sedimentace buněk Usazování buněk v gravitačním poli - centrifugace  Sedimentací při nízké rychlosti oddělíme buněčnou biomasu od média  Buňky se usadí na dně zkumavky  Bakterie z 1 litru kultury můžeme resuspendovat v 10 ml (100 násobné zahuštění) Metoda centrifugace  separační metoda  izolace, purifikace a charakterizace částic, včetně makromolekul PRINCIP  pohyb částic v tekutém prostředí pod vlivem odstředivého pole, které vzniká otáčením rotoru centrifugy  chování částic je dáno jejich vlastnostmi a povahou prostředí Princip centrifugace Osa rotoru Rotace Poloměr otáčení Centrifugy Diferenciální centrifugace  homogenní roztok  částice lišící se podstatně velikostí, hmotností nebo hustotou  sedimentace různou rychlostí supernatant sediment Rovněž separace jader, ribozómů, mitochondrií, buněčných membrán, nukleových kyselin, proteinů Sedimentace virionů Viry sedimentují velmi pomalu, mají nízké hodnoty sedimentačních koeficientů Virus/fág Sedimentační koeficient Virus vakcínie 92S Influenzavirus 18-21S Fág T2 60S Sedimentace virionů  Diferenciální centrifugace při vysokých otáčkách  Vysrážení virových částic hydrofilním polyethylenglykolem (PEG) – stačí nižší otáčky Jaký je princip účinku PEG?  V přítomnosti soli pohlcuje vodu  Tím vyloučí z vody virové částice - srážení Centrifugace – praktický vzorec RCF = relative centrifugal force (hodnota g) rpm = repeats per minute r = poloměr otáčení RCF = 1,119 x 10-5 x rpm2 x r Příprava extraktu z buněk Podstatou je odstranění buněčných obalů Odstranění obalů chemicky  Chemická činidla narušující integritu buněčných stěn  Rozhoduje chemické složení buněčné stěny  Druhé činidlo musí narušit buněčnou membránu U Escherichia coli a příbuzných bakterií lysozym a etyléndiamin tetraacetát (EDTA) + dodecylsulfát sodný Jaký je mechanismus účinku? Mechanismus účinku lysozymu Muramidáza, N-acetylmuramid glykanhydroláza  EC 3.2.1.17  patří mezi glykanhydrolázy  katalyzuje hydrolýzu vazeb 1,4-beta mezi N-acetylmuramovou kyselinou a N-acetyl-D-glukózaminem v peptidoglykanu Peptidoglykan a lysozym NAM NAG peptidový můstek Peptidoglykan a lysozym O O NAG NH O CH2OH O COCH3 O NH OH CH2OH O COCH3 Ala NAM NAG ... CH CH3 AK AK AK AK ... AK AK AKAK AK Je možné lysozymem odbourat buněčnou stěnu Archae? Mechanismus účinku EDTA etylendiamin tetraacetát (EDTA)  Odstraňuje ionty hořčíku, které ochraňují strukturu buněčných obalů  Inhibuje buněčné enzymy, které by mohly degradovat DNA chelát Mg Mechanismus účinku SDS dodecylsulfát sodný  aniontový detergent detergent  narušuje nekovalentní vazby proteinů, denaturuje je a ničí jejich přirozenou strukturu (konformaci)  odstraňuje molekuly lipidů před SDS po SDS polární skupiny nepolární skupiny Odstranění obalů fyzikálně I Kuličkami Bead beating  Třepání biologického materiálu v nádobce se zirkoniovými nebo skleněnými kuličkami  Velikost 0,5 až 1,0 mm Bead beater  Metoda vhodná na vzorky půdy  Může ale rozbít DNA na malé kousky  Snižuje kvalitu extrakce u tkáňových vzorků Odstranění obalů fyzikálně II Osmotický šok Sonikace Kombinace chemické a fyzikální metody Aplikace ultrazvukových vln za účelem rozrušení částic v roztoku Používají se ultrazvukové lázně a sonda Účinky fyzikální i chemické Porušení mezimolekulárních interakcí Jak odstranit jiné typy buněčných stěn? Vybrané bakterie Kvasinky a houby Staphylococcus - lysostafin Mykobakterie – směs více enzymů Celuláza, směsi enzymů Vnitrobuněční parazité ??? Co se děje po odstranění obalů? Nerozpustné buněčné zbytky jsou odstraněny centrifugací V supernatantu se nachází buněčný extrakt obsahující nukleové kyseliny, proteiny, lipidy, polysacharidy a nízkomolekulární látky Centrifugace při nízkých otáčkách (do 1 000 g) sediment (buněčné zbytky) supernatant Izolace DNA z buněčného extraktu 1) Degradace kontaminujících látek 2) Oddělení směsi na dvě frakce, DNA zůstává v jedné z nich degradace separace + Extrakce Extrakce je čistící a dělící operace, při které přechází složka ze směsi látek v kapalné či tuhé fázi do jiné kapalné fáze - rozpouštědla. Extrakce je velmi výhodná pro izolaci tepelně nestálých látek, protože se může provádět i za laboratorní teploty nebo za chladu. Extrakce proteinů směsí fenol- chlorofom Fenolová extrakce podle Marmur 1961 mezifáze s denaturovanými proteiny na rozhraní K separaci proteinů dojde po centrifugaci a vytvoření lehké vodné fáze těžší organické fáze Postup při fenolové extrakci - I 1) Rozrušení buněčných stěn nebo virových kapsidů – enzymy (lysozym, celulázy) a detergenty (laurylsulfát sodný) 3) Oddělení fází centrifugací – vrstva organická (fenol), mezifáze (proteiny a zbytky buněk), vodná (NA) 2) Denaturace proteinů a tuků – fenol, chloroform DNA a RNA proteiny fenol Postup při fenolové extrakci - II 5) Precipitace NA – soli, etanol, izopropylalkohol, nízká teplota 8) Rozpuštění sedimentu ve vhodném médiu – voda, TE- pufr 6) Shromáždění precipitátu centrifugací DNA a RNA 4) Odběr DNA a RNA frakce 7) Odběr etanolové frakce Modifikace fenolové extrakce Fenol ekvilibrovaný neutrálním nebo alkalickým pufrem DNA a RNA proteiny fenol RNA proteiny Fenol a DNA Pro vyšší efektivitu může extrakci předcházet degradace (např. odstranění proteinů proteinázou) Jiné způsoby odstranění kontaminant Detergent cetyltrimetylamonium bromid, CTAB  S nukleovými kyselinami tvoří nerozpustný komplex  Po centrifugaci v supernatantu proteiny a jiné …  Sedimentovanou DNA rozpustíme v 1M NaCl a dočistíme Guanidium thiokyanát  Denaturuje vše kromě nukleových kyselin  V jeho přítomnosti se DNA váže na oxid křemičitý – chromatografická kolona Separace DNA a RNA DNáza odstraní z roztoku DNA RNáza odstraní z roztoku RNA Specifické nukleázy  chlorid lithný sráží RNA Diferenciální precipitace Zahuštění DNA a RNA precipitací  Precipitace (srážení), jedna ze základních metod izolace a koncentrace biologických makromolekul.  Do roztoku, obsahujícího požadovanou makromolekulu, se přidá určité množství precipitačního činidla (síran amonný, ethanol, aceton apod.)  Makromolekuly se vysráží, aniž obvykle dojde k denaturaci. Může se proto následně znovu rozpustit a použít ve své nativní, biologicky aktivní podobě. Postup při precipitaci 1) Přidání etanolu, případně izopropanolu 3) Koncentrování vzorku centrifugací (roztok zchlazený na -70ºC) 2) Přidání jednomocných kationtů (K+, Na+…) 4) Promytí sedimentu NA 70% ethanolem 5) Rozpuštění NA ve vodě Jaká je rozpustnost DNA ve vodě? DNA JE HYDROFILNÍ Obecný postup precipitace etanolem NaCl Na+ Cl- C2H5OH Nízká dielektrická konstanta Neutralizace PO3Snížení hydrofility DNA VYSRÁŽENÍ DNA ve vodném prostředí Přidání NaCl + C2H5OH Postup při precipitaci - dokončení 6) Koncentrování vzorku centrifugací (roztok zchlazený na -70ºC) 7) Promytí sedimentu NA od zbytků solí 70% ethanolem a odpaření ethanolu teplem 8) Rozpuštění NA ve vodě (přídavek EDTA, případně Tris-HCl) Nativní NA koncentrovaná v malém objemu vodného roztoku Výsledek? Jednoduchá příprava DNA pro PCR Zpravidla stačí bakterie povařit 5-10 min. ve vlastní šťávě a zcentrifugovat sediment buněčných zbytků v supernatantu dost DNA k amplifikaci Specifický postup u kvasinek BURDYCHOVA, R. - RUZICKA, V. - BARTOS, M. (2002): PCR-based method for identification of integration events in the Pichia pastoris genome. BioTechniques 33: 1214-1218. Rozbití buněk inkubací po dobu 10 minut při 80°C Dej pozor, abys nepřevařil nebo nedovařil …! Prodloužení nebo zkrácení času, zvýšení nebo snížení teploty mělo fatální důsledky na výsledek PCR Izolace plasmidové DNA Zásadní problém je oddělení plasmidové a chromozómové DNA  Na základě velikosti (největší plasmidy dosahují jen 8% velikosti chromozómu Escherichia coli)  Na základě konformace – chromozómová DNA se při purifikaci linearizuje!  Alkalická denaturace  Centrifugace v gradientu CsCl Separace na základě velikosti Velké kusy chromozómové DNA lze odstranit diferenciální centrifugací spolu se zbytky buněk  Šetrné porušení buněk – vytvoření sféroplastů  Lyze buněk neiontovým detergentem (Triton X-100) – SDS by chromozómovou DNA rozbil  Centrifugací vzniká přečištěný lyzát I přečištěný lyzát ale obsahuje zbytky chromozómové DNA Příprava vyčištěného lyzátu Brown 2007, obr. 3.11 Izolace plasmidů alkalickou denaturací  Je založena na skutečnosti, že linearizovaná DNA po denaturaci a následné renaturaci nedokáže reasociovat, na rozdíl od kružnicové DNA  Denaturace se provádí při pH = 12,0 až 12,5 (ideální je 12,45)  Následuje rychlá renaturace při které lineární molekuly vytvoří agregáty, kdežto plasmidové molekuly reasociují  Kromě toho v prostředí SDS a neutralizaci acetátem sodný se nerozpustí ani proteiny a RNA (není třeba fenolové extrakce ani ribonukleáz) Birnboim a Doly(1979): Nucleic Acids Research 7, 1513-1523. Izolace plasmidů alkalickou denaturací pH 12,45 Směs plasmidů a chromozomové DNA Částečná denaturace plasmidové DNA Úplná denaturace chromozomové DNA Snížení pH + SDS + C2H3KO2 Renaturace DNA Precipitace Neutralizace Centifugace SedimentSupernatant Zonální centrifugace  částice podobných fyzikálních vlastností  typy nukleových kyselin, podjednotky ribozómů, apod.  koncentrační gradient sacharózy, glycerolu vzrůstající hustota a viskozita gradient eliminuje vliv zvyšujícího se odstředivého zrychlení částice se rozvrství podle velikosti, tvaru a hustoty vzorek Zonální izokinetická centrifugace vzorek nanesený na povrch gradientu (5-20% sacharóza) centrifugace frakcionace obsahu zkumavky Parametry zonální izokinetické centrifugace  používá se k podrobnější charakterizaci částic – přesné stanovení jejich velikosti  monitorování lze i v průběhu centrifugace Rychlost sedimentace závisí na - velikosti - tvaru - hustotě Rychlost sedimentace je ovlivňována - vlastnostmi prostředí - podmínkami centrifugace Sedimentační koeficient Charakterizuje rychlost pohybu částice při centrifugaci dr/dt = S . a = S . ω2 . r r = vzdálenost od osy otáčení t = doba centrifugace S = sedimentační koeficient a = ostředivé zrychlení ω = úhlová rychlost 1 Svedberg = 10-13 sekundy 23S-rRNA, 16S-rRNA, rib. podjednotky 30S, 50S Izopyknická centrifugace roztok CsCl obsahující směs částic centrifugace frakcionace obsahu zkumavky nižší hustota vyšší hustota Parametry izopyknické centrifugace  centrifugace do rovnováhy  vznášivá hustota – ovlivněna interakcí s ionty roztoku Využití - analytické = stanovení velikosti nebo hustoty částic - preparativní = izolace dvou druhů DNA Izopyknická centrifugace a purifikace proteiny DNA RNA Hustota CsCl (g/cm3) 1,60 1,75 1,80 Separace s ethidiumbromidem  Lyzát je „obarven“ ethidium bromidem  Vmezeřením EtBr se sníží vznášivá hustota linerární DNA až o 0,125 g/cm3  U kružnicové plasmidové DNA jen o 0,085 g/cm3 Vytvoří se dvě zóny s DNA Výsledek po CsCl-EtBr  Lyzát je „obarven“ ethidium bromidem proteiny DNA RNA lineární a OC CCC Purifikace po CsCl-EtBr  Lyzát je „obarven“ ethidium bromidem EtBr v organické fázi DNA ve vodné fázi DIALÝZA Hledání univerzálního protokolu Vyzkoušel jsem leccos, ale takový protokol neexistuje Nespoléhejte se na komerční kity, ale zvažujte, experimentujte, opakujte a porovnávejte různé procedury Protokoly pro bakteriální společenstva  Je vhodné kombinovat fyzikální a chemickou cestu odstranění buněčných stěn  Koktejly různých enzymů lepší než enzym jediný  Neexistuje významný vztah mezi výtěžkem a reprezentativností vzorku  Můžeme mít protokol, který lyzuje ze 100% jeden druh a druhý vůbec!  Jak potom poznáme, co je ve vzorku za mikroorganismy? Weaver J. (2012): DNA extraction: Overcoming obstacles in microbial studies. Biotechniques10/03/2012  Přemýšlejte o použité metodě, neberte to, co je snadno dostupné nebo levné! Izolace fágové DNA (RNA)  Výchozí materiál není buněčný extrakt  Většinou stačí deproteinovat Základní kroky 1) Získání fága o vysokém titru (alespoň 1010/ml) 2) Zahuštění částic v polyethylenglykolu + NaCl 3) Purifikace v gradientu CsCl (fág λ - zóna při hustotě 1,45-1,50 g/cm3) 4) Dialýza 5) Izolace DNA/RNA fenolem nebo proteinázami Stanovení koncentrace a čistoty 1) Spektrofotometricky 2) Fluorescenčně Spektrofotometrická metoda  čisté vzorky bez většího množství kontaminant  NA absorbují UV záření  maximum absorbance bazí v oblasti 260 nm  optická hustota odpovídá koncentraci  podíl absorbancí = čistota vzorku Spektrum DNA 230 až 320 nm vlnová délka a b s o r b a n c e maximum minimum Kterou částí nukleové kyseliny absorbují UV záření? Koncentrace nukleových kyselin OD260 = 1,0 dsDNA ~ 50 μg/ml ssDNA ~ 33 μg/ml ssRNA ~ 40 μg/ml Čistota DNA Stanovuje se na základě poměrů absorbancí při různých vlnových délkách Čistota DNA OD260/A280 = 1,8 < 1,8 = kontaminace proteiny > 1,8 = kontaminace RNA OD260/A230 > 2,0 < 2,0 = kontaminace látkami, které jsou součástí izolačních souprav Prohlédněte si naši výukovou prezentaci, která vám pomůže pochopit problematiku hlouběji Fluorescenční metoda  vzorky s nízkou koncentrací NA nebo znečištěné jinými látkami  porovnání se standardem Klesající koncentrace DNA DNA RNA Kolorimetrie  využívají specifické reakce nukleových kyselin s jinými sloučeninami  vzorky porovnáváme se standardy o známé koncentraci  Po reakci NA s cysteinem a 70% kyselinou sírovou vzniká růžové zbarvení (490 nm) – metoda pochází z roku 1944  Hydrolýza DNA trichloroctovou kyselinou a reakce s nitrofenylhydrazinem za vzniku hydrazonu (560 nm)  Nové metody využívají značení luminiscentních barviv a dosahují citlivostí až 1 pg DNA ve vzorku Shrnutí 1) Základní informace o izolaci nukleových kyselin 2) Sled kroků při izolaci nukleových kyselin 3) Principy centrifugace 4) Specifické postupy ve zvláštních případech 5) Izolace nukleových kyselin z fágů 6) Spektrofotometrická analýza nukleových kyselin 7) Fluorometrické a kolorimetrické stanovení koncentrace DNA