Fragmentace molekul DNA, reštrikční enzymy doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2013 Obsah přednášky 1) Definice restrikčních endonukleáz, jejich přirozená funkce 2) Typy restrikčních endonukleáz 3) Reštrikční místa pro restriktázy typu II 4) Rozložení restrikčních míst na genomu 5) Využití restriktáz k mapování 6) Využití restriktáz v diagnostice mikroorganismů I- Doporučená literatura GENE CLONING & DNA ANALYSIS Sixth coriON Brown (2010): Gene Cloning & DNA Analysis. Wiley-Blackwell, Sixth edition katalog firmy New England Biolabs, USA, www.neb.com T.A.BROWN Co to jsou reštrikční endonukleázy Enzymy, které štěpí dsDNA ve specifických místech, specifických sekvencích > součást reštrikčné modifikačních systémů bakterií > omezují propagaci bakteriofágů v různých bakteriálních kmenech > DNA hostitelské buňky je před účinkem vlastní RE chráněna metylací > původní význam RE: ochrana před cizorodým genetickým materiálem chromozóm Qfá9 chromozóm je metylován — O RE ničí | vstupující 'dna degradovaná fágová DNA A jak se brání bakterie proti RNA Tágům ? Prý existuje něco jako eukaryotický siRNA mechanismus, u bakterií tomu ale říkají CRISPR Navštivte přednášky z Molekulární biologie, kde se o siRNA a CRISPR systémech Defense in Prokaryotes, Science 321, 960-964 2) Horvath et al., Science 327,167-170(2010) Dělení restrikčních endonukleáz Typ I - rozpoznávají specifickou sekvenci, štěpí v nahodilém místě Typ II - přísně specifické, rozpoznávají a štěpí sekvence s rotační symetrií (palindrom) Typ III - rozpoznávají nesymetrické sekvence a štěpí v jiném místě v definované vzdálenosti Typ IV - štěpí mimo rozpoznávanou sekvenci, která musí být modifikována Restriktázy typu I Rozpoznávají specifickou sekvenci, štěpí v nahodilém místě EcoK, EcoB > vážou se na specifické nukleotidové sekvence > katalyzují náhodné štěpení v místech vzdálených až několik 1 000 bp od místa vazby > molekulová hmotnost dosahuje cca 300 000 > zajišťují modifikaci (metylaci) i štěpení DNA > vyžadují kofaktory: ATP, Mg2+ a S-adenosylmetionin > jsou nevhodné pro analýzu sekvencí DNA nebo genové inženýrství Restriktázy typu III Rozpoznávají dvě nepalidromatické sekvence inverzně orientované EcoP15 > Rozpoznávají sekvence dlouhé 5-6 nukleotidů > Štěpí 20-30 bp za místem rozpoznání > Obsahují dvě proteinové podjednotky > Vyžadují kofaktory: AdoMet a ATP > Metyl ují jen jeden z řetězců dsDNA v pozici N-6 adenosinu 5... CAG CAG (N)257.. 3' 3... GTCGTC(N)27 ...5' t Restriktázy typu IV Štěpí metylované sekvence mimo rozpoznávané místo Eco57\, Bce83\, HaelV, Mme\, SspLUHlII, BseM II > mají obě funkce - methyltransferázovou i restriktázovou > kofaktorem je Ad o Met (S-adenosyl-L-metionin) > kofaktorem není ATP ^ Sekvence pro Hae IV ^ NNNNNNNNNNNNN GAYNNNNNRTCNNNNNNNNNNNNNN 3' NNNNNNNNNNNNNGAYNNNNNRTCNNNNNNNNNNNNNN 3' 5 3 Restriktázy typu II Rozpoznávají palindromy a štěpí ve stejném místě > vážou se na specifické (4-8 bp) sekvence nukleotidů > katalyzují štěpení obou řetězců molekuly DNA uvnitř vazebného místa nebo v jeho bezprostředním sousedství > štěpení se podrobují všechna cílová místa v dané molekule DNA > molekulová hmotnost: 20 000 až 100 000 > kofaktor: pouze ATP Jak vypadá palindrom? Přilehlá obrácená repetice 5'.....ATGC/GCAT.....3' 3'.....TACG/CGTA.....5' Vlásenka ATGCGCAT Jak funguje RE typu // 5' 3'... CT 5' . . ATTC ... 3 3'... CTTA AG ... 5 Je známo přes 3 500 RE, rozpoznávají asi 160 různých sekvencí Rozřezání genomu endonukleázami Reštrikční fragmenty Různé typy konců lepkavé (kohezní) úseky přečnívající na 5'- koncích, EcoR I 5'... GA 3' 5' ATTC ... 3' 3' . . . CTTA 5' 3' AG ... 5' lepkavé (kohezní) úseky přečnívající na 3'- koncích, Pvu II 5' . . . CGAT 3' 5' CG ... 3' 3'... GC 5' 3' TAGC ... 5' zarovnané (tupé) konce, Stu I 5 ' . . . AGG 3 ' 3 ' . . . CTT 5' 5' 3' CCT ... 3' GGA ... 5' Podívejte se na animace http://www.dnalc.org/ddnalc/resource s/animations.html http://highered.mcgraw- hill.com/sites/0072437316/student_view0/chap terl 6/animations.html Nebo si vyžádejte staženou prezentaci Existuje i procvičovací pps soubor Pro štěpení je důležitá orientace! 5 ' NGAATTCN 3 ' + EcoR\ 3 NCTTAAGN 5' 5 ' NCTTAAGN 3 ' + ^COR\ -> 3'NGAATTCN 5' 5 NCTTAAGN 3' + Affl -> 3'NGAATTCN 5' 5'NGA ATTCN 3' 3'NCTTA AGN 5' žádné štěpeni 5'NC TTAAGN 3' 3'NGAATT CN 5' Izoschisomery Restriktázy se stejným rozpoznávacím místem > různí producenti > mohou být odlišně citlivé k metylaci Isoschizomers Products + Kasl 5 ...GGCGCC... 3' ...CCGCGG... ...G pGCGCC... '...CCGCGp 1 G... + Narl 5 ...GG 3'...CCGCp pCGCC... |GG... Izokaudamery > Restriktázy s odlišným rozpoznávacím místem > Výsledné produkty jsou ale stejné fíamHI G/GAATCC -N-N-G G-A-T-C-C-N-N--N-N-C-C-T-A-G G-N-N- BgH\ A/GATCT -N-N-A G-A-T-C-T-N-N--N-N-T-C-T-A-G A-N-N- Sau3A /GATC -N-N-N G-A-T-C-N-N-N -N-N-N-C-T-A-G N-N-N Relaxovaná specifičnost Star activity Některé restriktázy za určitých reakčních podmínek štěpí blízce příbuzné sekvence EcoR\ 5'... G AATTC ... 3' 5'... G G ATTC ... 3 5...GGATTT...3 5...AGATTT...3 Důsledky relaxované specifičnosti > nespecifické produkty > často za neoptimálních reakčních podmínek PvuII PvuH PvuO-HF II 1 Ihr oln " 1 hr ofn " 1 hr o/n ' M nerozštěpené fragmenty DNA Citlivost k metylaci Izoschisomery, které se liší v citlivosti k metylaci, lze využít při studiu metylace nukleotidových sekvencí Metylace je způsobena prokaryotickými metylázami Dam, Dcm a Eco Kl a eukaryotickými CpG MTázami Po izolaci DNA z buněk, které mají tyto metylázy nemusí restriktáza fungovat správně! Definice jednotky Množství restriktázy, které zcela rozštěpí 1 pg DNA fága A (lambda) za 1 hodinu při optimální teplotě a v optimálním prostředí Pozor na počet restrikčních míst v dané molekule! Zkuste vypočítat Jedna jednotka reštrikční endonukleázy BamH\ je množství enzymu, které rozštěpí 1 |jg DNA fága A za optimálních reakčních podmínek při 37°C za 1 hodinu. Na molekule DNA fága A je celkem 5 štěpných míst pro restriktázu BamHL Chceme-li linearizovat plasmid, který obsahuje jediné reštrikční místo pro tuto restriktázu, jaké podmínky štěpení použijeme? Máme linearizovat 1010 molekul plasmidu. Řešení je zde Dokument ikace řvícrosoft W< Názvosloví restrikčních endonukleáz např. Eco I > 1. písmeno: počáteční písmeno rodu produkční bakterie > 2. a 3. písmeno: první dvě písmena druhu produkční bakterie > označení kmene (serotypu produkční bakterie (ne vždy) > římská číslice vyjadřuje pořadové číslo endonukleázy izolované z dané bakterie Příklad odvození názvu restriktázy EcoR\ Označení Význam Vysvětlení E Escherichia rod co coli druh R RY13 kmen 1 pořadí ■-i f?rYni - identifikace v identifikovaná . .. bakterii Počet rozpoznávaných sekvencí pro určitou reštrikční endonukleázu na DNA o známé délce můžeme vypočítat Jak často se vyskytuje čtveřice? Předpokládáme, že .... > máme nekonečně dlouhou molekulu > sekvence nukleotidů je naprosto nahodilá Máme 4 nukleotidy a děláme z nich čtveřice 44 = 256 bp Restriktázy štěpí nejčastěji čtveřice nebo šestice nukleotidů Jaká je frekvence výskytu štěpícího místa pro restriktázu EcoR I (štěpí sekvenci GAATTC) ? Frekvence výskytu štěpícího místa pro restriktázu EcoR I je 1 ku 46 46 = 4 096 (bp) Šedivá je teorie a zelený strom života Reálná situace DNA fága A -> 49 kbp -> 12 míst pro RE štěpící hexamery 10 20 30 40 49 _I Bgl\\ BamHl Sal\ BgH\ 22 010 13 286 9 698 2 392, 651,415, 60 BamHl 7 233 6 770 6 527, 5 626, 5 505 Sa/l 32 745 15 258 16 841 499 Počet restrikčních míst pro daný enzym v molekule DNA klesá s jejich velikostí Number of restriction sites DNA Genome source size (kb) 4bp 6bp 8bp 1 pUC19 3 10 0-1 0-1 2 SV40 5 20 1 0-1 3 Bacteriophage X 48 190 12 0-1 4 Bacteriophage T4 165 660 40 2-3 5 Bacteria 4700 18400 1100 70 6 Yeast* 16000 62500 390Ó 250 7 Fruit fly* 120000 470000 30000 1800 8 Mammals* 3000000 11700000 730000 46000 * Haploid values (most somatic cells have twice as much DNA) Homing endonucleases Nukleázy, které štěpí dsDNA a rozpoznávají dlouhé nesymetrické sekvence (12-40 nukleotidů) a kódující sekvence intronů a inteinů > Názvosloví jako u restriktáz s prefixem I- nebo Pl- > Štěpí s extrémně nízkou četností > Nejsou příliš specifické, proto je průměrná frekvence štěpení jako by rozpoznávaly 10-12 bp l-Ceul, l-Scel, Pl-Pspl Vypočítejte Jestliže je počet nukleotidů v diploidním genomu člověka roven přibližně 3 miliardy párů bází, jaká je nejmenší délka sekvence, která se v takovém genomu bude vyskytovat pouze jedenkrát? Řešení je zde Dokument ikace Microsoft W< Význam restrikčních endonukleáz > nástroj pro přípravu rekombinantních molekul DNA > prostředek pro studium struktury, organizace, exprese a evoluce genomu > základ pro genové inženýrství > fyzikální mapování DNA > analýza populačních polymorfizmu > změny v uspořádání molekul DNA > příprava molekulárních sond > příprava mutantů > analýza modifikací DNA Mnoho dalších informací k restriktázám najdete na http:rebase.neb.com/rebase/ A ještě jednou... Rozřezání genomu endonukleázamí dsDNA Reštrikční fragmenty Fragmenty vzniklé restrikčním štěpením lze rozdělit elektroforézou 1) O elektroforéze budeme hovořit na příští přednášce 2) Nyní stačí si jen říci, že jejím prostřednictvím můžeme stanovit velikost jednotlivých fragmentů 3) Jednotlivé fragmenty můžeme poskládat a vytvořit tzv. reštrikční mapu ^ j Skládání reštrikční mapy Reštrikční štěpení lokusu reštrikční místa X (nebo delece) X -h Získané fragmenty lze uspořádat více způsoby Původní pořadí = A-B-C Další možnosti A-C-B C-A-C-B- Mapy se skládají po štěpení více restriktázami >po štěpení restriktázou Xba I jste získali fragmenty o velikosti 300, 500 a 900 bp >po štěpení restriktázou Ava I fragmenty o velikosti 700 a 1 000 bp >po štěpení oběma restriktázami současně fragmenty o velikosti 100, 300, 400 a 900 bp Mapy se skládají po štěpení více restriktázami Ava I Xbal 700 300 500 10C 300 400 1 000 900 900 700 1 000 400 300 100 900 300 500 900 700 1 000 300 400 100 900 300 500 900 Výsledná mapa Ava 1 700 1 000 300 400 100 900 Xbal 300 500 900 Xbal Xbal Ava I 300 500 900 300 400 100 900 700 1 000 Vytvoření reštrikční mapy po parciálním štěpení Co je to parciální štěpení B 12 A , I B I I C 11 10 B A B ■ A i 1 Příklad parciálního štěpení 1) Po částečném štěpení DNA bakteriofága A restriktázou Kpn\ jste získali fragmenty o velikosti 1,5; 17,0; 18,5; 30,0; 31,5 a 48,5 kbp. 2) Úplným štěpením jste získali fragmenty 1,5; 17,0 a 30,0 kbp. 3) Sestavte reštrikční mapu. Z daných výsledků lze odvodit 1) Fragment 48,5 odpovídá neštěpené molekule fága 2) Fragmenty 1,5; 17,0; a 30,0 jsou produkty kompletního stepem 3) Fragmenty 18,5 a 31,5 kbp jsou produkty částečného stepem Reštrikční mapa pro Kpn\ musí být 30,0 1,5 17,0 A teď si to ještě procvičte Jestliže z předchozího příkladu znáte reštrikční mapu pro Kpn\, pak vytvořte reštrikční mapu pro Kpn\, Xba\ a Xho\ podle výsledků shrnutých v tabulce Enzym Počet fragmentů Velikosti (kbp) Xba\ 24,0; 24,5 Xho\ 2 15,0; 33,5 Kpn\ 3 1,5; 17,0; 30,0 Xba\ + Xho\ 3 9,0; 15,0; 24,5 Xba\ + Kpn\ 4 1,5; 6,0;17,0; 24,0 Postup řešení 1) DNA fága A je lineární, proto jsou počty restrikčních míst pro jednotlivé restriktázy rovny: Xba\ = 1, Xho\ = 1, Kpn\ = 2 2) Fragmenty pro Xba\ a Xho\ jsou následující: Xba\ Xba\-Xho\ Xho\ MAPA 24,0 24,5 9,0 15,0 24,5 15,0 33,5 Xho\ Xba\ 15,0 + 9,0 24,5 3) Všechna místa pro Kpn\ jsou ve fragmentu Xba\ (24,5), protože se tento fragment po štěpení Xba\-Kpn\ neštěpí. Pořadí míst Kpn\ je určeno z částečného štěpení. Výsledná mapa Xho\ Xba\ Kprú H- 15,0 9,0 "6,0 1,5 17,0 Využití restriktáz k diagnostice mikroorganism ů > Krátké fragmenty = RFLP - polymorfismus délky restrikčních fragmentů > Dlouhé fragmenty = PFGE - pulsní gelová elektroforéza > Analýza produktů PCR = PCR-REA Shrnutí 1) Definice restrikčních endonukleáz, jejich přirozená funkce 2) Typy restrikčních endonukleáz 3) Reštrikční místa pro restriktázy typu II 4) Rozložení restrikčních míst na genomu 5) Využití restriktáz k mapování 6) Využití restriktáz v diagnostice mikroorganismů