Preimplantační genetická
diagnostika
Oddělení lékařské genetiky FN Brno
Gynekologicko - porodnická klinika
Masarykovy univerzity v Brně
PGD
• alternativa k prenatální diagnostice
• alternativní prevence potratů indikovaných
po amniocentéze
• preventivní a cílená diagnostika dané
geneticky dědičné nemoci
• selekce embryí pro IVF u párů s rizikem
transmitující genetické choroby
Co předchází provedení PGD ?
• Genetické poradenství před cyklem IVF
- konzultace s párem včetně genetického
vyšetření
• Poradenství s gynekologem a embryologem
• Informovaný souhlas pacientky
Genetická analýza
• oocyt/zygota (polární tělísko)
• blastomera (embryo)
• blastocysta
Biopsie polárního tělíska
(PB biopsie)
• původně preferováno z etických
důvodů (manipulace s oocyty , genetický materiál
použitý k analýze není částí vyvíjejíciho se embrya)
• komplikace: možnost rekombinace
genotyp paternální alely zůstává
neznámý
• možnosti PB analýzy : detekce numerických
chromozomálních abnormalit maternálního původu
– “age related” aneuploidie
– žena nositelka translokace
• většina center PGD toto vyšetření
nepreferuje
Biopsie blastocyst
• blastocysta:
– opouzdřená struktura obsahující přibližně 100 buněk
– vyvíjí se 5-6 den po inseminaci
– trofoektodermální buňky - odvozeny z placenty a jiných
extra-embryonálních tkání
– odběr 10 buněk nepostihuje časný vývoj embryí, ale
neví se jaký efekt ná na pozdější vývoj fetu
– pouze asi 40-50% preimplantovaných embryí se vyvine
do tohoto stádia in vitro
• výhoda:
– menší technická náročnost biopsie
– možnost více buněk k analýze
Biopsie blastomer
• 3.den fertilizované embryo: 6-8 totipotentních buněk
• hlavní nevýhoda:
– limitované množství materiálu, doporučována biopsie a analýza
dvou blastomer z každého embrya
• většina center PGD preferuje biopsii blastomer
Princip biopsie blastomer
• Odběr blastomery z rýhujícího se embrya
• Testování blastomery metodami
molekulární biologie
• Eliminace embryí se specifikovanou
genetickou vadou
Technika provedení biopsie blastomer
• Fertilizace metodou ICSI
• Biopsie po 72 hod. kultivace
• Narušení zona pellucida
• Odběr blastomer v EB mediu
• Fixace blastomery na podložní sklo
• Kultivace embryí po biopsii (48 hod.)
• Oplach a transport blastomer v dest. vodě
pro PCR vyšetření
Diagnostika PGD
• chromozomální abnormality:
– aneuploidie chromozomů X,Y, 13, 18, 21
– určení pohlaví
– FISH metoda
• nevýhoda: častý výskyt chromosomálního
mozaicismu
• monogenní choroby
– pro jakoukoli genetickou chorobu u které
je dostatečná sekvenční informace
– PCR
• fenomén: allelic drop out (ADO)
PGD chromozomálních abnormalit
• chromozomy v interfázním jádře buňky
• první PGD : FISH na X-vázané choroby (stanovení pohlaví)
• většina chromozomálních abnormalit je maternálního původu
- častá aplikace biopsie pólového tělíska (PB)
• limitace:
– starší ženy nebo ženy s opakovaným IVF: limitovaný počet kvalitních
embryí/oocytů (aneuplodie!)
– maximální počet chromozomů analyzovaných z jedné buňky je 7 - 9
– chybné stanovení aneuploidie dosahuje až 15%, nejčastější příčinou
chyb:
• „background“ fluorescence, slabý signál, ztráta jádra při aplikaci
blastomery na podložní sklíčko
• nyní zavádění CGH v PGD
PGD monogenních chorob
• genotypování jedné buňky založeno
na metodě PCR
– komplikace :
• možná kontaminace vzorku
– cumulus buňky, obklopující oocyt/maternální původ kontaminace
– spermie, zapuštěná do zony pelucidy pro fertilizaci/paternální
kontaminace
• ADO (alelic drop out) - amplifikace jedné alely pod úrovní
detekovatelnosti
– optimalizace PCR (výskyt ADO <10%)
– příčina ADO: obecně neznámá, avšak je ovlivněna :
» metodou buněčné lyse před PCR
» PCR podmínkami
» sekvencí cílové DNA
» velikostí PCR produktu
Minimalizace ADO
• protokol monitorující výskyt ADO:
– multiplex PCR (dva a více lokusů vztažených
ke genotypu)
– SSCP nebo DGGE analýzy ( detekující obě
alely současně, potvrdí genotyp)
– fluorescenční PCR - redukuje výskyt ADO,
detekce DNA fragmentu je až 1000x citlivější
ve srovnání s konvenční PCR technikou
Nevýhody PGD
• Limitovaný počet buněk dostupných
genetické analýze
• Možné riziko narušení vývoje
vyšetřovaného embrya
• Není vyloučená jiná genetická vada
• Doplnění PGD amniocentézou
PGD u Cystické fibrózy
• CF představuje nejčastější žádost o PGD
– incidence 1/4000 novorozenců
• minoritní forma CF je způsobena kongenitální bilaterální absencí vas deferens
(CBAVD)
– CBAVD nepostihuje spermatogenezi IVF + intracytoplasmická injekce
testikulárních spermií (ICSI)
– jestliže partnerka je také nositelkou některé z mutací CFTR genu, pak ICSI procedura
je následována PGD
• 70% mutací CFTR genu v Evropské populaci : F508del
– oba partneři nositelé F508del (49%)
– jeden partner :F508del a druhý jiná mutace (42%) (PGD zaměřena na eliminaci
embryí nesoucích F508del
– oba partneři nesou jinou mutaci než F508del (9%) (specifický test na detekci mutací
nebo nepřímá DNA dignostika)
Identifikace alel
• nepřímá DNA diagnostika: užití polymorfních míst
v genu (haplotyp)
– jednoduchý a universální test pro všechny páry, jakmile
je nalezena heterozygozyta polymorfního místa
– interní kontrola kontaminace vzorku
– dva a více polymorfních markerů snižuje riziko chybné
interpretace (ADO)
– vyhodnotí status ploidie testované blastomery
Fragmentační analýza F508del z jedné
buňky