DNA analýza genu CFTR Molekulární postata choroby porucha v transportu iontů chlóru, sodíku a vody přes apikální membránu specializovaných epiteliálních buněk chloridový kanál regulující transport iontů přes buněčnou membránu lokalizovaný v apikální membráně epiteliálních buněk 575918 •Tvořen 5ti doménami: 2 membrane spanning domains 2 nucleotide binding domains 1 regulatory domain 490^^6^52192118201 Organs Affected by Cystic Fibrosis The genetic defect underlying cystic fibrosis disrupts Hie functioning of several organs by causing ducts or other tubes to become clogged, usually be thick, sticky mucus or other secretions. AIRWAYS Clogging and infection of bronchial passages impede breathing. The infections progressively destroy the lungs. Lung disease accounts for most deaths from cyslic fibrosis. LIVER Plugging of small bile ducts impedes digestion and disrupts liver function in perhaps 5% of patients. PANCREAS .-^Occlusion of ducts prevents the . i pancreas from delivering critical ■ digestive enzymes to the bowel in 65% of patients. Diabetes can result as well. SHALL INTESTINE Obstruction of the gut by thick stool necessitates surgery in about 10% of newborns. REPRODUCTIVE TRACT /^hsence of fine duds, such as ttie the vas deferans, renders 95% of males infertile. Occasionally, women are made infertile by a dense plug of mucus ttiat blocks sperm from entering the uterus. SKIN Malfunctioning of sweat glands causes perspiration to contain excessive salt (NaCI). Measurement of chloride in sweat is a mainstay of diagnosis. CFTR exprese ve všech tkáních (vyjma nervové) \7 multiotgánové onemocnění CF plíce - molekulární podstata Plíce normální plíce plíce z CF pacienta CF pancreas — molekulární podstata A Normal pancreas B Chronic pancreatitis Numerous differences (defines pathalogic stage) Apical iCFTflt Pankreas Pankreas normální pankreas pankreas z CF pacienta CF potní Žlázy — molekulární podstata Fertilita nemocných CF Muži •Sterilní v 95% •Porucha vývoje vas diferentia (CBVAD) epididymis a vesiculi seminalis Obstruktivníazoospermie může být zcela izolovaným příznakem Nej častější mutace asociované s CBVAD: 5T vatianta v intronu 8 R117H Zeny •Plodnost snížena pro viskozitu cervikálního hlenu •Častá primární nebo sekundární amenorrhea v důsledku poruch výživy a plicních změn ill I8! A IS II I ■ I Chromosome 7 CFgene 050 kb] 7 8 14*1517*18 23 \\ I II lili I-H—("DNA 4^910 11121314b1G17b 19 20 21 22 24 TranAption ft Glycosylation, foldBj, and membrane insertion TMD-1 TMD-2 AAAAAAAA m RNA (8129 nucleotides) ]COOH Protein (1480 amino acids] Domain MEF1 ^JV__^-/ i i Jv NEF 2 Exnn 1 a 3 4 ,5.6a6h í S 9 10 11 1Ě_13_mi4b 15 161*117b1B 19 WJMip-ii JL 1 # "O i v P5 ů"0 o# ■■ ■ ¥ *■ ■ TUTO ■ ŮO«# ■ ■ Oü TEi I IS?" ' ™í"n = tanfme^ran^ d™a1ina mutation types NBF-1, NBF-2 = nucleotide*inding folds . = m^me . = missense R = regulatory domain t , %} . = nonsense ,:, = farrie.2hift ■"'V-il^^tím^cystic fibrosis cell membrane vv^Cf'^-/t^vA ■ K\ a.' L T*i transmembrane ^ conductance w^t^W re9u'3lnr [CFTRJ ' protein fii \ u Ig •lokalizován na chromozomu 7 (7q31) •250 kb dlouhý •27 exonů •cDNA sekvence dlouhá 6129 bp kóduje 1480 aminokyselin CFTR proteinu 1 2 3 4 5 6a 6b 7 8 9 101112 13 14a14b1S 16 17a 17b 18 19 20 21 22 23 24 Exons 5'"-0tHXXH H'F" .;-H H.._i>..H ' h HH HUJCTOC H H K FPH......* i approx. 230 kb (Introns not to scale) 1. CF gene 123 4 5 6a 6b 7 8 9 10 11 12 13 14a14b 15 16 17a 17b 18 IS SO 21 22 23 24 Exons ~1 i"! 1! i i ii i ICOOH L J L J L J L transmembrane Nucleotide Regula- 2. CDNA binding tory (R) xpooooooc ooo oco transmembrane Nucleotide Domains binding CHO outside Cell membrane AF508 3. CFTR protein "™ NBD1 C. CF gene and CFTR protein 00oo:^ocx>cq Oooo°occcoocc COOH inside • 1500 CFTR mutací bylo nalezeno v CFTR genu (CFTR Mutation Table; http://www.genet.sickkids.on.ca./cftr-cgi-bin/FullTable • Většina z nich je raritní, „privátní" nebo jejich vztah k CF nebyl prokázán • pouze 7 mutací vyskytuje na více než 1% CF patologických alel • Je pozorováno široké rozpětí ve frekvenci jednotlivých mutací u různých populací • nejčastější mutatace F508del je detekována u cca 66% CF pacientů Exon # 1 2 3 4 5 6a 6b 7 8 9 10 11 12 13 14a 14bl5 16 17a 17b 18 19 20 21 22 23 24 Missense in mi ■■ in mi ii i huh mi ni ii mini in u mi n n n in in n mi mihu m urn ■ii in mi ii mi in nm m n n Nonsense m im m i n i m i i i m i n n mi ii m i nim mi im im 111 i ii n m n nm i im i 11 n n Frameshift 1 iii UN ii II iii 1 ii i m m ii in 1 ii iii 1 iii iii 1 1 ini 1 nun ni i nun in in mu i m nm mi n m m n In frame in/del i i n i i i iii 1 11 n n Splicing m i n 1 ii iii 1 ni i i n n n n m i Promoter Sequence Variatllibh n n i m n i m n Nil ii ii ii 1 ii iiiii ii 1 iii 1 11 ii1 Mill iii 1 1 mi n n n n mi i mu i i m n Legend Exon Region Intron RegionCnot to scale) Exon Mutation 1 Intron/Promotor Mutation 1 delece od 1 bp po kilobáze inzerce včetně duplikací jednobázové substitutce missense transverze nonsense tranzice splice site posunové (frameshift) v důsledku delecí, inzercí, poruch splicingu Exon # 1 2 3 4 5 6a 6b 7 8 9 10 11 12 13 14a 14bl5 16 17a 17b 18 19 20 21 22 23 24 Missense in mi ■■ in mi ii i huh mi ni ii mim in ii mi ii ii ii in in ii mi mihu in urn ■ii in mi ii mi in inn in mi Nonsense in mi ill i ii i in i i i ni i ii ii mi ii hi i nim mi mi mi 111 i ii n in ii um i mi i 11ii ii Frameshift 1 III llll ii ii iii 1 ii i in in ii in i ii hi i in in i i mi i nun ni i nun in hi mu i in inn mi 11 m m n In frame in/del i i ii i i i in i 11 ii ii Splicing ii i ii i n ni i ni i i ii ii ii ii ni i Promoter Sequence Variatlhbh ii ii i hi ii i in n Nil ii ii ii i n inn n i in i 11 ii1 Mill iii 1 1 mi ii ii ii ii mi i mu i i hi ii Legend Exon Region Intron RegionCnot to scale) Exon Mutation 1 Intron/Promotor Mutation 1 ^k>rlh ArnrriĽa. I¥u|*řrlíun uľtír ĽlirtiinuM9mi!h ßfc) • delF508 71,57% • CFTRdele2,3(21kb) 4,64% • G551D 4,03% • N1303K 3,02 % • G542X 2,22% • 1898+lGtoA 2,02% • 2143delT 1,21% • R347P 0,81% • W1282X 0,60% • 4374+lGtoA, 1717-lGtoA, R1162X, E92X, 2184insA, 3849+lOkb každá 0,4% • R334W, R553X, 621+lGtoT,........ každá 0,2% Normální CFTR Nucleus Endoplasmic Reticulum Golgi Apparatus Cell Membrane chromosome 7 •CFTR gen - přepsán (transkribce) do messenger RNA • mRNA CFTR - přeložena (translace) do proteinu •CFTR protein - postranslační modifikace (glycosylace) •CFTR maturovaný protein - umístěn v buněčné membráně CF mutace: třída I Nucleus Endoplasmic Reticulum omopome 7 TrUllidlLrl mRNA Golgi Apparatus Cell Membrane c •CFTR gen - stop kodón \zkrácená , nefunkční messenger RNA CF mutace: třída II Endoplasmic Gol& CeU Nucleus Reticulum Apparatus Membrane •CFTR gen - přepsán (transkribce) do messenger RNA • mRNA CFTR - přeložena (translace) do proteinu •CFTR protein - selhání maturace ■: f mutace F508del dává CFTR nesprávný tvar degradován proteolýzou CF mutace: třída III Nucleus Endoplasmic Reticulum Golgi Apparatus Cell Membrane Liiuc-inui^ik-CFTR •CFTR gen - přepsán (transkribce) do messenger RNA • mRNA CFTR - přeložena (translace) do proteinu •CFTR protein - postranslační modifikace (glycosylace) •CFTR maturovaný protein - umístěn v buněčné membráně •CFTR protein není aktivní mutace G551D — nefukční NBD1 doména CF mutace: třída IV Nucleus Endoplasmic Reticulum Golgi Apparatus Cell Membrane < > CFTR (liji-ni--l 1 I i / •CFTR gen - přepsán (transkribce) do messenger RNA • mRNA CFTR - přeložena (translace) do proteinu •CFTR protein - postranslační modifikace (glycosylace) •CFTR maturovaný protein - umístěn v buněčné membráně • maturovaný CFTR protein je defektní mutace R347P - snižuje chloridovou konduktanci CF mutace: třída V Endoplasmic GolS1 Nucleus Reticulum Apparatus chromo •CFTR gen - sestřihová mutace hkst mRNAs defektní snížené množství CFTR proteinu mutace 3849+lOkb setřihová (splicing) mutace i? n (P n 196 sekvenčních variací v genu CFTR Poly-T alelické varianty (Tn) v intronu 8 genu CFTR 3 konfigurace polypyrimidinového traktu: 9 tymidinů - účinné akceptorové místo sestřihu 7 tymidinů - účinné akceptorové místo sestřihu tymidinů - neúčinné akceptorové místo sestřihu chybí exon 8 u 90% syntetizovaného CFTR chybná funkce CFTR 5T alela považována 2a mutaci asociavanou s širokým spektrem příznaků Zena: zdravá -----------------atypická CF -------typická CF Muž: CBVAD------------------#typická CF -----------typ-kkáCF Kongenitální bilaterální absence vas deferns (CBVAD) popsáno 25 mutací asociovaných s CBVAD v exonech missense v intronech mRNA splicing defekt IVS8 Molekulárně genetická diagnostika CF Kaskádovitá*4 strategie rutinní molekulárně genetické diagnostiky CF suspektní CF pacient nebo přenašeČ If "ŕ* i coring 6 nejčastějších CFTR mutací jedna nebo obě alely neidentifikovány Scorins: 36 CFTR mutací M JI obě CF alely identifikovány CF diagnóza potvrzena jedna nebo obě alely neidentifikovány Detekce mutace F508del Chromosome 7 CF7TR GENE Sequence of nuceloťdes in cftr gene Anino acid sequence of CFTR protein -isoleucine 506 T — isoleucine 507 c-1 ^phenylalanine 506 T T T -1 G G - glycine 509 T ——— G ■ T - valine 510 deleted in many patients with cystic fibrosis delece ďínukleotidů CTTv CFexonulO ztráta jedné aminokyseliny — fenylalaninu v pozici 508 v CFTR proteinu Polyacrylamidová gelová elektroforéza PCR produktu exonu 10 H— 95 98^ 95 □ Proužky značené 95,98 jsou 95- a 98-párU bazí dlouhé PCR produkty □ Proužky značené H jsou heteroduplexy formované chybné spárovanými jednořetézci DNA (95/98 a 98/95) ELFO - 5% PAGE, 200 V, 20 °C, 2hod 1. non dF508 / non dF508 2. dF508 / dF508 3. dF508 / non dF508 4. marker pBR322/Alul Detekce mutace CFTRdele2,3(21kb) ELFO: 5% PAGE, 200 V, 20°C, 2hours 1. CFTRdele2,3(21kb) / non 2. wt 3. CFTRdele2,3(21kb) / non Polyacrylamidová gelová elektroforéza duplex PCR produktu: 1. Primery 2,3F a 2,3R -ohraničují deleční bod zlomu amplifikace 207bp dlouhého produktu p řítomno s t ^cSx: e 2. Kontrolní primery 3i-5 a 3i-3 amplifikace 309bp dlouhého produktu obsahujícího exon 3 nepřítomnost delece Duplex PCR z a jist u/e in terni amplifikaCní kon trolu a umožňuje rozlišit mezi homozygtem a heterozygotem pro deleci Test založený na analýze bodu tání fluorescenčně značených prob po vysokorychlostní PCR na přístroji LightCycler • rychlý • bezpečný • snadno interpretovatelný PCR: jeden pár primerů Analýza bodu tání: dva systémy prob Fluorescenční monitoring G551D/R553X lokusu Fluorescenční monitoring G542X lokusu G542X G551D, R553X according to Burgraf, 2001 Spektrum analyzovaných CF mutací je rozšířeno použitím INNO-LiPA CFTR 19 INNO-LiPA CFTR 17 + Tn 19 a 17 CF mutatcí a jejich wild-type sekvence Identifikuje polymorfní Tn místo(intron 8) asociované s CBVAD Mutace INNO-LiPA CFRT12 INNO-LiPA CFTR17+Tn Delta F508 X G542X X N1303K X 1717-1G>A X W 1282X X G551D X R553X X Delta 1507 X R560T X 390 insT X Q552X X S1251N X 394delTT m. m G85E 621 + 1G>T R117H 1078delT X \ R347P X R334W X E60X X 711+5G>A X R1162X X 3659delC X 3849+10kbC>T X 2143delT X A455E X 2183AA>G X 2184delA X Alkaline Pho$[ j0 Chromogen Purple (NBT/BCIP) precipitate INNO-LiPA Reverse Hybridization prindptl INNO-LiPA CFTR19 INNO-LiPA CFTR17 + Tn Jeden vzorek Jedna amplifikace Dva stripy Výsledek multihybridizace do 3 hodin po amplifikaci Elucigene CF-EU Metoda fluorescenční multiplex ARMS (amplification refractory mutation system) Mutations detected by CF-EU1 CFTRdele 2,3 E60X P67L G85E R117H 621+1G>T 711+1G>T 1078delT R334W R347P A455E I507del F508del 1717-1G>A G542X S549RT>G G551D R553X R560T 1898+1 G>A 2184delA 2789+5G>A 3120+1G>A M1101K D1152H R1162X 3659delC 3849+1 OkbC>T S1251N 3905insT W1282X N1303K 700 600 500 400 300 200 100 0 |PT7T|jIiÖaiitlH|PT9Tl F508dtlWT| 545 LlJ § § I [iol [ill luHŮl ĚHsIíítI íisi [RlĚoirail Ěl |Ž1 lat: is:3f:3? ššää >ó~ YICVY I UUli I ICI|J ! Samples Plot File Edit View Tools Alleles Help bee Plot Setting: |Micľosatellite Default ■ Ml" ryl (HMyJ lülir. D4- ^(gfr |U|j,. 4141 Suiple Kit Sample Nunt Find SQD OS ■ CFEU2_2010-«í-29_F«7_S3íl_l«A.ffi S361_1(IA CFEU2 Audi P0P7 200 300 400 500 CFEU2_2010-«í-29_A(l9_S3ŕl_l(lBífi |S361_1(IB | CFEU2 B ndi EsyyyyB yyj y b qq yy ebb □□□□ bb bb bbqeh yryyay y b yyyyyy yyyy 200 300 400 500 < r >f\&N i oois neip ! Samples Plot File Edit View Tools Alleles Help Plot Setting: Micro satellite Default _3H Panes: 2 IM AjLi-i- iy)i.+i4) Sample Hie S Uiiplt Name Fand sqo os sq CFEVTÍ_í(lll) lll-ll_F«3_lJ9S_l(lAfii |1993_1«A |CFEU2 Audi FOP7 ctx^nroanpi^x^ gg ggg&g[&.gggg ggß. gggEgggygggg g gggggg ySBB 200 300 400 500 4000 A lá A 1 iHi.li.Jáiii.lMá Í.111H1.1.1Í1 l.ll.lMil4.11H.M.Ii^iiilü tli i 1- Al 11 Al A. d F508del Mfr íz 16537 B3.5J ar 43563 B65 ht 4346 pS CFElIÍ_2(il(l|i-12_GIiT_lí J3JIIB f f i ICFEU2 B nit gggsggg g g] g g] bö gy eh g gyggi yg gg yy beh ggyyg b y gggBQ g g b g g < 199JJÍA CFEU2 Amis POP7 ■ ■ 711+1 IR334W 1 IKOTdel I |F£08del I3849+1... I |1677delTA |1078delT | IV520F L206 150 160 170 180 190 200 210 |l99J_10B j CFEUI B mix ■ !■ 1 711+1 |R334W 1 IKOTdel | I3849+1... |1677delTA |1078delT 1 IV520F I 150 160 -1-1-1-1- 170 H-1-1- 180 -1- -1- 190 200 —i-1-1- 210 -1-1-1-1 JUL al5 Í16 EZ 14 5.26 si 151.47 419 d 10 El 175.57 ei 182.06 al 11 d 12 ei 196.84 ei 207.92 S Samples Plot File Edit View Tools Alleles Help Plot Setting: Micro satellite Default _3H Panes: 2 y |H|liy lulď. itl-l- ^(0)* lffllJL-V-141 K Sample lilt S u iplt u it Faid SQO OS SQ CFEU2_2«l|i-l(i-ll_GHJ_lííi_l«Aďíi 19MJCA | CFEU2 Auiii P0P7 n^nroTOCTTTO Q0 B BQ&affl-SBBB BBE-BBBE3BE 200 300 3000 BB00BBBQEEB B B B E] 400 500 alTT OíidelM T sz 1+8.43 3.39 .J>9 ar 11129 es3 9 ta 1148 ss al41-CFDe]2_3 si 437.(53 ar 23540 ht 2117 CFEU2_2«l|i-l(i-12_H|iT_199i_l«Bďfi 1»M_UB |CFEU2Biľiis EHBEBBB BEI B Q BSBBEBB 0SBB BBBB BBQQB BEBB0 B B BBQBQB B B B B 200 300 400 500 5000 U.ÜUÜM < [X 214.79 Y3104] [Peak: Data Point 5220 Size 437.63 Height 2117 Allele 41-CFDel2_3] [Bin: 13-L20BW Marker L20BW] view I cos neip 2! Samples Plot ebb 1 File Edit View Tools Alleles Help Plot Setting: |Microsatellite Default ,v | El Panes: |2 v \ Ml H II lltf . ill 4- IBI.L-V-i4i Ö S Illicit Nil \tr SQO OS SQ CFEU2JC1« 10-ll_G«J_lJJi_HAfii CFEU2 Audi F0P7 >| IP6TL |2143 dill" 423 430 431 432 433 434 435 433 437 43S 433 440 441 442 443 444 445 446 447 1 1 ll41-CFDsD_3 si 437.63 sr 23540 1H2117 CFEU2 2(11(1 1(1 12 HIT lt'U MBfsi CFEU2 B iidi CFDel2 3 " IP6TL |2143delT 423 430 431 432 433 434 435 433 437 43S 433 440 441 442 443 444 445 440 447 1141 si 435.73 ar83!>6 lit 422 1142 £Z 443.48 IT 8222 lit 490 [K 142.72 Y7129] Start r, E g !g] Service Console ^J^-®£ 12:03 Model 310 59A>2mht/u9F S13 Signal G:140 A:162 T:155 C:139 Page 1 of 2 Version 3.3 DT310POPS{BDv3}v1 .mob Tue. Apr 22, 2003 9:36 ABI-CE2 59/02mht/u9F Seq Mtx v3 E Sat, Apr 19. 2003 20:17 Version 3.3.2 Lane 13 Points 1282 to 10200 Pk1Loc:1282 Spacing: 12 19{12.19) CGGCCG AGOiAT TCCTOfcGCTCTGGGCATGG A CCTGGC CA CACTAGAGATCACAGCCC A CAATGAGCG CAAGCCCAAC CCGCCG 10 7 (A 3ft 40 50 60 70 80 ;CCAGGGCTGCTGAC CTGGCTCATG TCCATCGATG TCAAGTACCA GATCTGGAAG TTCGGGGTCA TCTTCACAGA CAACT 90 100 110 120 130 140 150 160 TCCTTC CTGTACCTGG GCTGGTATAT GGTGATGTCC CTCTTGGGAC ACTACAACAA CTTCTTCTTT GCTGCCCATC TC 170 180 190 200 210 220 230 240 CTGGACAT CGCCATGGGG GTCAAGACGC TGCGCACCAT CCTGTCCTCT GTCACCCACA ATGGGAAACA GCT 7S0 260 270 2ftft 290 300 310 Uvedenými postupy však nejsme schopni detekovat raritní a neznámé CF mutace, k jejichž odhalení musí být využívány rozličné vyhledávací metody Analýza celé CFTR kódující sekvence a přilehlých oblastí 1 2 3 4 S 6a 6b T 8 9 10 11 12 13 14a 14b 1S 16 17a 17b 18 19 20 21 22 23 24 Exons 5--fH>TrrWľH HlPOflTH H~tf}TWir~rfK~ H r - H h i3' i---------1 1. CF gene approx. 230 kb (Introns not to scale) NH. 12 3 4 5 6a 6b 7 8 9 10 11 12 13 14a14t>15 16 17a 17b 18 19 20 SI 22 23 24 ExonS ni n COOH i i Denaturační ctroforéza hexonú ční změnou Rodokmen rodiny P Pacient J.F. SuspektníCF Věk: 30 let f Detekována mutace dF508 na obou alelách genu CFTR jenotyp F508del / FSOSČI^I Cjotvrzena dg. CF 50% CF pacientů diagnostikováno do 3 let života 90% CF pacientů diagnostikováno do 10 let života Rodina M. F508del / non non / non F508del / G542X Rodina E.,K o ô ô □ ô ô mutace de novo vznikla při transimisi gamety CFTRdele2,3 / non _CZ) non / non Hemofile A • incidence : 1/10.000 novorozených chlapců • deficience koagulačního faktoru VIII • X-vázaná choroba Factor VIII activity Hemophilia A under 2% 2-10% 10-30% Severity Spontaneous bleeding Bleeding after Bleeding into joints, muscle, light trauma, after trauma internal organs sometimes spontaneously Proportion of patients 48% 31% 21% C. Severity of hemophilia A and factor VIII activity •gen pro faktor VIII: -lokalizace Xp28 -26 exonů -186 kb (0,1 % celého X chromozomu) -9kb mRNA mutace v genu pro f VIII: susbstituce, inzerce, delece,duplikace 30% de novo 50 000 43 000 1. Activated factor VIII i A1 A2 Ca2© A3 C1 | Č2 | 73O00 NH2 -2. Factor VIII Ť Activation by thrombin 2332 Amino acids A1 A2 B A3 C1 C2hCOOH I IF I II 1 ! 1 / 1 3. Gene 10 kb RFLP near exons 17 and 18 Hemophilia A '- 17 18 Bel I 4. RFLP ■ 879 bp ■ »286 bp 4 Bel I Bel I Variant reslriction site B. Blood coagulation factor VIII 1165 bp — - — Mutation-carrying fragment 5. RFLP diagnosis Inverze v genu F8: najčastejší příčina hemofílie A qter [ UF8A I I ...........................íá....~..:..!..........:........~....................................................^ 1 1 -22 23-26 1 J cen =500kb ► F8A F8B F8A 23-26 II cen intróny 1 - 22 UF8A v intronu 22 jsou geny F8A a F8B\ 500kb před genem je homologní F8A (hF8A) +- orientace genů interchromatidová rekombinace mezi F8A a \\F8A qter [ 22 111 II 23.26 | | cen inverze časti F8 génu inverze přibližně 45% všech mutací F8genu při hemofílii A představuje tato inverze Ill IV Prince Albert von Sachsen-Coburg-Gotha a Alice D a o Queen Victona ODO Ludwig v. Hessen Heinrich von Preussen Irene Alexandra Frederick W-Š Or-D Leopold Duke of Albany Beatrice Prince Heinrich von Battenberg Nikolaus II ó Alice i L Ó /? 4P •& •$* •& CT # ^ - -44 * -51 - • «~45 m m42 > o g 55 5> t- v K+ K- o o K+ K g o K+ K- u, K m g o K+ K- > S S ? ¥ « en potvrzena DMD: delece DMD exonů 45, 47, 48 4 sety multiplex PCR Zkumavka 1 Pm 535 pb exon 3 410 pb exon 43 357 pb exon 13 238 pb exon 6 207 pb Zkumavka 3 exon 19 459 pb exon 8 360 pb exon 4 196 pb Zkumavka 2 exon 49 439 pb exon 50 271 pb exon 47 181 pb exon 60 139 pb exon 52 113 pb Zkumavka 4 exon 48 506 pb exon 44 426 pb exon 51 388 pb exon 45 307 pb exon 53 212 pb exon 42 155 pb Duchennova svalová dystrofie Multiplex PCR neodhalí Ženu přenašečku JMIUHÍÍWnW. Zena Zena přenašečka nepřenašečka vždy PRC produkt "SET Duchennova svalová dystrofie MLPA MLPA® Multiplex Ligation Probe Amplification Duchennova svalová _MLEA_ "Multiplex gene dosage analysis made easy" Poprvé popsána: Schouten JP et al. (2002) -Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. Jun 15;30(12):e57. •detekce aberantních DNA sekvencí jednoduchým provedením na základě PCR reakce •minimum pouze 20 ng DNA •Lze analyzovat degradovanou DNA - extrahovanou z tkání v parafínových bločcích - extrahovanou z tkání ve formalínu - volnou fetální DNA získnou z maternální plasmy •diskriminuje sekvence lišící se pouze v jednom nukleotidu •determinuje metylační status promotrů •detekce známých mutací a SNP dystrofie Duchennova svalová dystrofie MLPA Přístroje termocykler DNA analyzátor Duchennova svalová dystrofie MLPA MLPA techniky 1. Denaturace 2. Hybridizace 3. Ligace 4. Amplifikace Duchennova svalová dystrofie MLPA SALSA MLPA próby Synthetic oligonucleotide 50-60 bp PCR primer sequence Y M13-derived oligonucleotide 60-450 bp PCR primer sequence X Hybridization sequence Stuffer sequence (different for each probe) Hybridization sequence Duchennova svalová dystrofie MLPA Hybridizace 1. MLPA probemix je přidán k denaturované genomické DNA 2. Dvě Části každé próby hybridizují k odpovídající sekvenci 3" Torget A 5" 3" Torget B Duchennova svalová dystrofie MLPA Ligace 3. Próby jsou ligovány termostabilní ligásou e> Termos t oble lioose 3" Torget A 5' e> Termos to b le liqose Torget B 5" Duchennova svalová dystrofie MLPA Amplifikace 4. Pár univerzálních přimetŮ je použit k amplifikaci všech ligovaných ptób. AmplifikaČní produkt každé próby má unikátní délku (130 -480 bp) Duchennova svalová dystrofie MLPA Separace a kvantifikace kapilární elektroforézou Každý pík je amlifikační produkt specifické proby Vzorky jsou porovnávány s kontrolním vzorkem 1A I B Rozdíl v relativní výšce nebo ploše píku v cílové sekvenci próby Duchennova svalová _MLPA_ Salsa MLPA Kit P034/P035 DMD/Becker Detekuje delece a duplikace všech exonů DMD genu DMD muž delece probě odpovídající sekvence se projevuje absencí ampliíikačního produktu proby DMD Žena přenašečka - heterozygot 30- 35% redukovaná plocha píku amplifikačního produktu příslušné proby Mutace/polymorfismy ležících v místech dosedání prob mohou také způsobit redukci plochy píku - deleci jednoho exonu nutné ověřit jinou metodou dystrofie Duchennova svalová dystrofie MLPA Kontrola P34 i 2..0 40.0 (0.0 80.0 100.0.14.0.0 140.0 1(0.0 180.0 200.0:14.0.0 240.0 0.00.0 280.0 300.0:14.0.0 340.0 3(0.0 380.0 400.0-14.0.0 440.0 4(0.» 480.0 (00.0 Duchennova svalová dystrofie MLPA Kontrola P34 i PľenašeCka delece ilLil l1lllliJá>i^ exonu 8-41 P34 Pře našečka delece exonu 8-41 P35 Duchennova svalová dystrofie FISH Metodou fluorescenční in situ hybridizace lze lokalizovat cílové nukleotidové sekvence přímo v buňkách (in siru). Metoda FISH založena na schopnosti jedno řetězcové DNA sondy vázat komplementární úsek cílové DNA fixované na mikroskopickém skle. Duchennova svalová dystrofie FISH Přenašečka delece exonu 46-47 v genu pro dystrofin na chr.X Lymfocyty periferní krve Kuglík, Slámová Laboratoř molekulární cytogenetiky, OLG, FN Brno Duchennova svalová dystrofie Život s dystrofií se podobá temnému tunelu, kde je lepší nevidět konec. Světýlek naděje na léčbu v něm bliká málo. Ale nyní se z temnoty tunelu ozvývá veselý psí štěkot. proband Na Žádnou z podob svalové dystrofie nebyl zatím nalezen účinný lék.........ale!!! otec Duchennova svalová _Léčba_ Mesengioblasty - kmenové buňky získané ze stěn cév krevního oběhu - schopné diferenciace na svalová vlákna a produkce dystrofinu ~ ~ . proband - Ctyľi z peti psU se postavili na nohy - transplantované buňky pronikly do svalů v různých Částech těla, zapojily se do nich a pomohly k nápravě - v některých svalech až 70% vláken dárcovského původu Giulio Cossa, Na ture, listopad2006 sestra Exoti skipping - AON (antisense oligonukleotid) -zabraňuje transkripci poškozených exonů - vzniká zkrácený funkční protein dystrofie Srpkovita anemic Erythrocyte Malaria infection ■ •■ • Malaria l w * \ -* V 1 ^ Release Homozygote HbA/HbA Multiplication of parasites Malaria infection \ No or slight malaria Heterozygote HbS/HbA Little or no multiplication of parasites No sickle cell anemia No malaria Sickle cell anemia Homozygote HbS/HbS Sickle cells C. Selective advantage of HbS heterozygotes in areas of malaria 1. Malaria 3. Sickle-cell anemia Domena:Eukaryota Rise:Chromalveolata Nadkmen:Alveolata Kmen:wtrusovci (Apicomplexa) Trida:kfvinkovky (Haematozoea) Rad:Haemosporida Celed':Plasmodiidae Rod:Plasinodiuin DNA sequence r C A C 6TG Staff of coding sequence Amino acid sequence QTG C A C G A C CTG T G A ACT SGA COT Histidme Leucine — Threonine - Proline I_:_I i_i I_i i_'_ C T C (■ A Ů Glutamic acid Normal C T C GAG Glutamic sc Id I Nu -mal red blood eel's □MA soquofico Amino acid soquonco C A C GTS G T G C A C GAG CTG T G A ACT G G A C C T Valine = Hlstldine = Leucine = Threonine — Proline c G Mutant C T C G A □ G ulu-mC acid Sicklod rod blood colls The change in amino acid sequence causes hemoglobin molecules to crystallize when oxygen levels in the blood are- low. As a result, red blood cells sickle and get stuck in small blood vessels. Expanze trinukleotidových repetic trin ucleo tide repeat expanze nový typ mutace, popsán 1991 Expanding 1WW rVofnal" al ele ľ t p tli C e Původ nestability Fragilní X (FRAX-A) 1/2500 mentální retardace Xq27.3 FMR-1 (FRAXA) RNA binding 5az 54 200 až 4000 Hungtigtonova chorea AD 1/5000 až 15000 demence 4pl6.3 IT15 huntigtin 1lQ ORF CAG 11 až 34 35 až 121 Myotonická dystrofie 1 Kenedyho choroba Spinicelebrální ataxie 1 AD 1/8000 svalová slabost 14ql3.3 DMPK proteinkin á za 3'UTR I 5 až 35 50 až 2000 M XR 1/50 000 atrofie svalů Xqll AR androgen. receptor — ORF H CAG 12 až 34 40 až 62 - AD postižení míšních provazců a mozečku 6p22 SCA1 ataxin 1 ORF »1 CAG 6 až 39 40 až 80 Myotonická dvs/rofie typu 1 (MD1) •autozomálně dominantní neuromuskulární choroba •nejčastější forma svalové dystrofie ► celosvětová frekvence výskytu 1:8000 •polysystémová manifestace Jtl* ^ •Idinicky extrémně variabilní % r .r n£ patri mezi onemocnení příčina expandované trinukleotidové repetice (TREs) DMPK om/ální produkt Ir 'DMVK protein expanzivní mutace V lit lili lílliílí^t ÍD iVIPix DlDíťlllíl mnií píi roi iy vzniku MlJff "\ nt piicmy yz mi ''mn^jp ort íí upni víi nu JLtpt [lil VSUTU [JLílKCtlU pOTLlpflžl tJWJt lokíiUzovíiných v okolí vy&yctiil'DNA vzíztbnýc xúl-1 Lity^ cfiroiiiíiíiiiiii ftj^ppQ a ovžifiyfíi ILlIlkct Pdžll ■ vzíztanyc okolí ^ tu li Ul h proi »U U iVIDl 35 - cca. 49 normální klinická formä\nyotonické dystrofie remutace počet CTG trinukleotidu propuknutí choroby ve věku průměrná délka života klinické projevy žádné postižení katarakta výjimečně mírná myotoni katarakta klasická 21 - 40 let 64 let 48 - 55 let neonatální 1000 až cca. 3000 od narození do cca. 10 let přežije neonatální těžká hypotonie respirační problém postižení srdce OThritální retardace další typický výraz obličeje "maska" Klinické vyšetrení neurologické vyšetření EMG, EEG kardiologické vyšetření Histologické vyšetrení postižených svalů histochemie elektrón, mikroskopie Molekulárne genetické vyšetření PCÍL TP PCR Triplet Primed PCR detekce 2 alel genu DMPK detekce/1 alely genu DMPK vyloučení diagnózy TP PCR I zdravý homozygot. I 1 heterozygot s expandující alelou vyloučení diagnózy I potvrzení diagnózy [13] + [expanze] - genotyp (CTG)n prokázána expanze trinukleotidových repetic na jedné alele genu DMPK [5-13]+ [13-21] - genotyp (CTG)n velikost repetic je na obou alelách ve fyziologickém rozhraní 13] + [21] t21l+ [expanze] ázana MD1 Průkaz expanze CTG repetice v genu DMPK metodou TP-PCR •nemUZe být stanoven vek nástupu nemoci a její závaznost 4* -expanze CTG repeticí asociována se 3 fenotypy -možnost somatického mozaicismu •presné urCení délky expanze:730-1000 a více repetic velmi pravděpodobná asociace s CMD •ultrazvukové vyšetření ve 2. a 3. trimestru může odhalit CMD: -zmenšený fetální pohyb -polyhydroamnion RNA v diagnostice • přímá RNA diagnostika - skrínování celé kódující oblasti příslušného genu • gene - expresní analýza: — diferenciační diagnostika některých typů nádorů (NB) — detekce cirkulujících nádorových buněk v krvi, kostní dřeni pacienta — monitorování průběhu léčby a detekce reziduálni choroby — kontrola štěpu před autologní transplantací — differential display, PTT test, funkční testy.... RNA savčí buňka: • 10 - 30 pg celkové RNA • tRNA (28S,18S, 5S) 80-85% • tRNA, snRNA 15-20% • mRNA 1-5% 360 000 mRNA molekul/buňku , tj. 12 000 rozdílných ttanskriptíl typická délka 1 ttanskriptů cca 2kb Nestabilita RNA • přítomnost ribonukleáz (RNázy) v buňce • RNázy — velmi stabilní — nevyžadují kofaktory — účinné v nízkých koncentracích — obtížná inaktivace — kontaminace RNázami: lidská pokožka prachové Částice (bakterie,plísně) • izolace a analýza RNA : speciální přístup i techniky Stabilizace RNA a uložení gene-expresní analýza: analyzovaná RNA musí reprezentovat in vivo expresi vzorku komplikace během odběru a zpracování biologického vzorku: — v okamžiku odběru RNA se stává extréme nestabilní — dva hlavní typy artefaktů: 1) redukce specifických i nespecifických druhů mRNA (downregulace genů a enzymatická degradace RNA) 2) indukce exprese určitých genů stabilizace RNA ve vzorku při odběru : — okamžité zmrazení v tekutém dusíku a uložit při -80 °C - stabilizační roztoky: RNAlater (tkáně), RNAprotect (bakterie), PAXgene (krev, kostní dřeň) kontaminace DNA — PCR primery překrývající hranici intron/exon — štěpení DNázami — cílená izolace mRNA izolovaná RNA může být uložena při -20 nebo -70 °C (bez degradace RNA po 1 uložení) RNA v diagnostice • přímá RNA diagnostika - skrínování celé kódující oblasti příslušného genu • gene - expresní analýza: — diferenciační diagnostika některých typů nádorů (NB) — detekce cirkulujících nádorových buněk v krvi, kostní dřeni pacienta — monitorování průběhu léčby a detekce reziduálni choroby — kontrola štěpu před autologní transplantací — differential display, PTT test, funkční testy.... Přímá RNA diagnostika Extrakce RNA RNA RT-PCR cDNA TI TI TI TI TI TI TI TTTTTTŤ primer oligo(dT) genově specifický primer PCR RNA diagnostika NF1 genu Struktura NF1 genu - 350 kb - 60 exonů -11 -13kbmRNA E E + I E E = EcoR\ restriction sites E I I Exon 1 N 0.7« 1.7 r 2 3 4.0 3.8 kb 433 341 203 B. NF1 gene on chromosome 17 193 5 6 7 69 _ 141 282 216 62120 bp 50C B40 1200 NF1 peptide C Human GAPa (GT Pase-act ivati n g protein) Yeast IRA1 700 1047 1150 1500 1680 C C. NF1 gene product (neurofibromin) GAP homology protein neurofibromin - 2818 aminokyselin - zřejmě tumor supresor 2060 2485 Amino acid 2725 2933 Homologous gene producls Neurofibromatoza typu 1 von Recklinhausen disease Autosomálně dominantní Frekvence 1:3000 Lokus17q 50% mutací de novo Predispozice k tumorům nervového systému Neurofibromy Café-au- lait spots Komplikace při molekulární diagnostice NF1 - problematická klinická diagnostika - až 50 % případů de novo - vysoká mutační rychlost - velikost genu (350 kb, 60 exonů) - absence hot spot oblastí - nutnost vyhledávání v celém genu - nejasná korelace mezi typem mutace a formou postižení - neurofibromin - známa funkce pouze jeho centrální domény - různé klinické projevy i u pacientů nesoucích stejnou mutaci Strategie molekulárně-genetického testování NF1 pacientů DNA / RNA NF1 pacienta I Vazebná DNA analýza I Mutační analýza intragenový DNA polymorfismus IVS27AAAT2.1, IVS27AC28.4 IVS38GT53.0 - i 38 DNA/RNA vyhledávací metody DGGE, SSCP cDNA/SSCP TTÖf Prenatální diagnostika ■=> —=f 1 Přímé sekvenování ] cDNA - SSCP analýza celková RNA cDNA RT ty PCR ty NF1 cDNA ( 60 ex6iiu; = P1 P3 P5 P7 P9 P2 P4 P6 P8 P10 SSCP ty (~ 1000 - 1200bp) Sekvenační analýza cDNA SSCP semi-nested PCR cDNA (segment P7) P7A(560bp) P7B(614bp) mt C5242T wt C62 wt C62 podmínky elektroforetické separace : 12% PAGE (60:1) / 150V /16 hod. / r.t. Sekvenace cDNA segmentu P7 NF1 genu (exony 28 -32/33) standardní cDNA cDNA NF1 pacienta, mt C5839T ( Arg > STOP) 5 Sekvenace vzorku DNA s odlišnou elektroforetickou mobilitou GEN NF1 - exon 37 standard DNA 1200/01 mt 6789 delTTAC: Thr>Thr, delece Tyr, posun ct. rámce 5SO, ŕ. OLI, 154 Oj &SCI, C C T G GB A C A C T T IM C N N C A G G N A m ä Tí ÍT i á Výhody a nevýhody RNA diagnostiky genů - jednodušší a rychlejší skríning multiexonického genu (10 segmentů cDNA místo 60 exonů), mRNA je bez intronů - záchyt sestřihových mutací v intronech - záchyt delece celého exonu na jedné alele genu - nižší ekonomické náklady - složitější odběr krve pro izolaci RNA - nižší stabilita RNA - dlouhé úseky genu obtížnější elektroforetická separace a sekvenace - nejasný efekt mutace na fenotypové úrovni (stejné u DNA diagnostiky!) Molekulární analýza Rb1 genu u dětí s retinoblastomem Retinoblastom • zhoubný nádor oka, pocházející z primitivních buněk sítnice • incidence 1/5 000 až 1/20 000 živě narozených dětí • manifestace do 5-ti let věku • projevy: ztráta zrakové ostrosti, strabismus, leukokorie, slepota, zvětšování oka, zarudnutí, otok • postižení: OkO, mozek, mícha (může se šířit do CNS přes opticus) • léčba: chemoterapie, lokální terapie (kryoterapie, nitrooční podání cytostatik), enukleace oka (oko je už většinou slepé, jde o život zachraňující výkon) • úspěšnost léčby při zahájení: nádor uvnitř oka - 95% mimo oblast oka - 10% Gen RB1 • jediný známý gen asociovaný se vznikem retinoblastomu (RBL) • lokalizace - 13q14.1-14.2 • 27 exonů, >180kb genomické DNA • kóduje retinoblastomový tumor-supresorový protein,(pRb,928 aa). významný negativní regulátor buněčného cyklu • tumor-supresorová aktivita IIIJIIIIII llll> ■*_v" *.\) *.\) *jO ľj í.0 í.0 *.\) jj ij j3 j3 j3 j3 mutace ztráta RB1 gen inaktivace deregulace buněčného cyklu vznik retinoblastomu Funkce retinoblastomového proteinu (pRb) Mňdsfiapeo www.medscape.com SďuHjů: C6rCůr ČDflIrůl S 2004 H. lnů Múlftl Canůůr CůnlSr Ěnd Rea&afcti Irtsliluts, Irtc. v,brzda" buněčného cyklu - kontrolní bod přestupu z G1 do S fáze: - pRb v aktivní formě váže transkripční faktor E2F - CyklinD- a CyklinE-dependentní kinázy fosforylují - a tím inaktivují - pRb - inaktivovaný pRb uvolňuje E2F transkripční faktory, které stimulují expresi cyklinů a dalších genů potřebných pro syntézu DNA a vstup do S fáze Formy retinoblastomu • vznik RBL vysvětluje Knudsonova teorie dvou zásahů: Alfred G. Knudson Knudson's hypothesis Non-hereditary Retinoblastoma First &. Second Mutation ®®^G>® RBRB rb rb Hereditary Retinoblastoma First Second Mutation Mutation J o —- ® ® ® ® rb R B Germline rb Constitutional rb rb Retinoblastoma sporadicky retinoblastom - 60% pacientů - dvě somatické mutace - pozdější rozvoj RBL (24.měsíc věku) - unilaterální forma retinoblastomu hereditární retinoblastom - 40% pacientů - první mutace germinální - „druhý zásah" - mutace somatická - časnější rozvoj RBL (8.měsíc) - bilaterální/multifokální forma - vyšší riziko vzniku dalších nádorů (Osteosarkom, sarkomy měkkých tkání,...) Ztráta vrozené heterozygotnosti • „druhým zásahem" vedoucím ke vzniku retinoblastomu bývá často ztráta vrozené heterozygotnosti (LOH - loss of heterozygosity) Retinoblastoma tumour development: loss of heterozygosity Expert Reviews in Molecular Medicines2003 Cambridge University Press * mechanismy LOH: - delece - nondisjunkce a reduplikace - mitotická rekombinace - uniparentální disomie Molekulárně genetická analýza genu RB1 v genu RB1 bylo popsáno více než 500 mutací rozmístěny po celé kódující oblasti genu a zahrnují všechny typy změn dále byla u retinoblastomu popsána hypermetylace cytosinu v CpG dinukleotidech promotoru různé formy inaktivace Rb1 genu vedou k rozdílné penetranci a expresivite genu, a tudíž rozdílným klinickým projevům onemocnění rozlišení hereditární a nehereditární formy onemocnění Hlavní typy mutací zapříčiňující vznik RBL Typ mutace výskyt metoda detekce cytogenetické aberace (delece a přestavby 13q14) 8% bilaterálních RBL 1-5% sporadických RBL (+ mozaiky) FISH testy heterozygozity MLPA velké delece a přestavby 10% familiárních RBL kvantitativní multiplex PCR jednonukleotidové substituce 40-50% RBL sekvenční analýza small length mutations 25-30% RBL sekvenční analýza hypermetylace promotorové oblasti RB1 10% RBL metylační analýza Materiál • periferní krev, tkáň RBL • DNA, RNA • pacienti s RBL a rodinní příslušníci Metody •sekvenace cDNA •sekvenace DNA •MLPA •metylační analýza promotoru Strategie molekulární analýzy genu RB1 vzorek tumoru / periferní krve izolace RNA RT-PCR sekvenace cDNA negativní výsledek metylační analýza promotorové oblasti izolace DNA nález sekvenční změny ~* (substituce, delece, inzerce) nález rozsáhlé delece MLPA sekvenace DNA MLPA Sekvenace cDNA a DNA Sekvenace cDNA izolace RNA z tkáně / lymfocytŮ periferní krve i RT-PCR (reverzní transkripce do cDNA) 1 PCR amplifikace 6-ti překrývajících se úseků 1 sekvenační PCR 1 sekvenační analýza (ABI 310, ABI 3130) A T T T G G AC C ?. A N 1 A '■. G A A fi :'. T Sekvenace DNA izolace DNA z tkáně / lymfocytŮ periferní krve 1 PCR amplifikace příslušných exonů (1-27) a přilehlých intronových oblastí 1 sekvenační PCR 1 sekvenační analýza (ABI 310, ABI 3130) T T TA A C T T AC TAAAAH AAAT T C-A TA C Metylační analýza promotoru nemetylovaná DNA metylovaná DNA 5'-A GT-3' 5'-A GT-3' modifikace bisulfidem sodným 5'-A GT-3' 5'-A GT-3 PCR s primery specifickými pro metylovanou a nemetylovanou DNA 5'-A GA-3' 3'-TACT-5' 5'-A GA-3' 3'-TACT-5' 1 .cyklus PCR 5'-A GT-3' 3'-TG CA -5' PCR amplifikace 5'-A GT-3' 3'-TGCA-5' detekce metylačního statusu pomocí PAG elektroforézy / sekvenování • hypermetylace CpG ostrůvků promotorové oblasti vede k represi transkripce - umlčování genu • u TSG (RB1, BRCA1, p15, p16..) představuje hypermetylace promotorů jeden z mechanismů onkogeneze • hypermetylace promotorové oblasti popsána u sporadických i hereditárních retinoblastomů Detekované mutace A T T T G G AC CA ANT A AGA A A A T : g. 156768-156769insAT/non TT TA A C T T AC T A A A A H A A A T T GATAC 61 71 - 1 g.41954G>T (E137X)/non G G NN C NMN N G G HNU NNG 6e Zk&HQ^AtL^cj g.150038delG/non RNA v diagnostice • přímá RNA diagnostika - skrínování celé kódující oblasti příslušného genu • gene - expresní analýza: — diferenciační diagnostika některých typů nádorů (NB) — detekce cirkulujících nádorových buněk v krvi, kostní dřeni pacienta — monitorování průběhu léčby a detekce reziduálni choroby — kontrola štěpu před autologní transplantací — differential display, PTT test, funkční testy.... Expresní analýza Metoda Real-time PCR • Spolehlivá • Presná • Rychlá • Univerzální • Variabilita použitých sond • Možnost detekce více mutací během jedné analýzy Real-time PCR • KVALITATIVNÍ ANALÝZA detekce snp • KVANTITATIVNÍ ANALÝZA detekce množství amplikonu Metody detekce Pro detekci produktu v průběhu PCR existují následující metody: - Na DNA se vázající interkalaČní barviva • SYBRgreenl - Na menší žlábek dsDNA se vázající barviva • BEBO - Technologie využívající fluorescenční výměny • dvakrát fluorescenčně značené sondy vázající se na střední Část amplif ikovaného produktu - TaqMan - Molekulární majáky - QZyme • jedenkrát fluorescenčně značené sondy nebo primery - FRET - LUX - PNA • dvakrát fluorescenčně značené primery - AmpliFluor - Scorpions Polytymidinové varianty v intronu 8 genu CFTR DNA varianty v intronu 8 CFTR genu a jejich efektu na hladinu mRNA . GTGTG T7777T777A A A C A G ST GTGTG7777777AAACAG 77 GTGTG TTTTTA A A CA G 57 Ewon Exon Ewon 7 Intron 8 Intron 9 Inirun 10 Intron CFTR gene E_Hon Ewon E non E non ľ 8 10 Normal CFTR mRNA Ewon Ewon Ewon 8 10 CFTR mRNA without exon 9 CFTR genotype 9T/3T 9T/7T 77/77 QT/5T 7T/5T 5T/5T Percentage of normal CFTR 100 50 10 Porovnání podílu normální CFTR mRNA, klinických fenotypu a CFTR genotypů. Percentage of Normal CFTRmRNA Clinical P he noty P e Normal C BAV D Cystic fibres is-P 3 Cystic fbrosis-PI 1 CFTR Genotype 91/91 91/71 71/71 91/51 71/51 51/51 OF/51 OF/OF™ CF/CF PCR analýza alel polyT sequencí v intronu 8 CFTR genu •nested PCR •reštrikční štěpení •ELFO (5% PAG, silver stained) 5T,5T 5T,7T 5T,9T 7T,7T 7T,9T 7T,7T M Kvantifikace cDNA PCR produktu CFTR exoti 9 na LightCycler Transcripty byly izolovány z leukocytu perifrní krve. File: C:\LightCycler3\UsersWJministrator\Data\CFTR\2005\050-120-5T QPCR.ABT Program: amplifikace Run By: Administrator Run Date: Jan -19, 2005 14:32 Print Date: January 26, 2005 1 b2MG 1 0 6 -- 2 b2MG10 5 -- 3 b2MG 1 0 4 4 b2MG10 3 - 5 b2MG 1 0 2 -- 6C127/04 b2MG 7C128/04 b2MG 8 C11/05 Ď2MG 3 C28I03 b2MG 10 K- b2MG 11 CI 27/04 12 C1 28/04 13 C11/05 14 C28/03 wt 0> c o 9 0 2 4 6 10 12 14 16 13 20 22 24 26 23 30 32 34 36 40 42 44 46 Cycle Number Reakce monitorována pomocí SYBR Green I. Koncentrace vybraných transkriptŮ exonu 3 je vyjádřena v relaci ke koncentraci referenčního (housekeeping) genu. l.Case (patient C127/04) 2.Case (patient C128/04) 3.Case (patient Cil/05) wt (C28/03) Kvantifikace cDNA PCR produktu CFTR exon 9 na LightCyclet Transcripty byly izolovány z buněk bukální sliznice File: C:\LightCycler3\Users\Administrator\Data\CFTR\2005\050606-5T QPCR.ABT Program: amplifikace Run By: Administrator Run Date: Jun 05, 2005 03:43 Print Date: June 14, 2005 2 01 45/05 b2MG 3 01 46/05 b2MG 4 01 47/05 b2MG 5wtb2MG 6 K- b2M0 7 01 45/05 8 01 46/05 9 01 47/05 I 0 wt (021 6/05) II K- 0 2 4 6 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 Cycle Number Reakce monitorována pomocí SYBR Green I. Koncentrace vybraných transkriptŮ exonu 3 je vyjádřena v relaci ke koncentraci referenčního (housekeeping) genu. l.Case (patient C145/05) .Case (patient C146/05) 3.Case (patient C147/05) Expresní analýza v onkológii Nádorové buňky se od normálních zdravých buněk liší na molekulární úrovni svým expresním profilem nádorová buňka exprimuje jiné geny ze své výbavy projeví se změnou množství Pspektra exprimované mRNA využití metody real-timeQ^T-PCR - studium genové expresy hledaným znakem epiteliálních nádorových buněk je mRNA. Onkomarkery Nádorové markery jsou látky produkované maligními buňkami, nebo organismem jako odpověď na nádorové bujení. Od látek produkovaných normálními buňkami se liší kvalitativně -normální buňky je neprodukují, ci kvantitativně - produkované i normálními buňkami. Jaký mají onkomarkery klinický význam Klinický význam jednotlivých markerů je i u samotných odborníků, zabývajících se problematikou onkomarkerů značně diskutovaným problémem. I jejich stanoviska se postupem času měnila. Od původního přeceňování až k úplnému zatracení a novému uznání. Verifikace významu onkologických markerů a jejich využití v ambulantní praxi neustále probíhá. Statistické pojmy pro klinické hodnocení 1. Cut off - referenční hladina je definována jako hladina markem, pod kterou leží většina hodnot zdravé populace, či pacientů s benigním onemocněním, nebo hladina pod kterou leží většina hodnot pacientů v kompletní remisi 2. Senzitivita markeru Udává procento správně pozitivních výsledků z daného souboru 3. Specificita markeru Udává procento správně negativních výsledků z daného souboru 4. PV+ pozitivní prediktivní hodnota - udává v procentech s jakou pravděpodobností bude mít pacient hledanou chorobu, bude-li test pozitivní 5. PV- negativní prediktivní hodnota - udává v procentech s jakou pravděpodobností nebude mít pacient hledanou chorobu, bude-li test negativní Kritéria ideálního onkomarkeru • je produkován pouze u maligních onemocnění • je orgánově specifický • vyskytuje se ve vysokých koncentracích v biologických tekutinách • hladina koreluje s velikostí nádoru • hladina koreluje se stádiem onemocnění • hladina koreluje s prognózou • hladina koreluje s efektem léčby • umožňuje průkaz zbytkové nádorové tkáně Rozdělení onkomarkerů podle chemické struktury, nebo biologické funkce • onkofetální antigény • enzymy • hormony • intracelulární onkomarkery • ostatní blíže nespecifikovatelné látky Indikace a interpretace laboratorního vyšetření Indikace a interpretace laboratorního vyšetření má svá pravidla a též určitá úskalí. Pro jejich využití v diagnostickém postupu je třeba mít na paměti následující pravidla. • volba vyšetření • preanalytická fáze • analytická fáze • fáze klinického zhodnocení (vyloučení falešné pozitivity) Onkomarkery: indikace podle orgánů Zvýšení některých onkomarkerů za fyziologických, nebo nemaligních podmínek Podmínka Fyziologicky zvýšené onkomarkery gravidita menstruační cyklus kouření ethylismus katetrizace moč. měch. AFP, hCG, Cal25, TPS, TG Cal25 CEA, TPS, TG CEA, TPS PAP, PSA Podmínka zvýšení onkomarkerů u jiných chorob Chron. onemocněni jater Endometrióza Pankreatitida Hypertrofie prostaty cukrovka CEA, TPS, Ca 15-3, Ca 19-9, Ca 125 Ca 125 Ca 19-9, Ca 125 PAP, PSA Ca 19-9 Co z toho plyne Nádorové on koma r ke ry by se měly stanovovat jednou metodou v jediné laboratoři. Hodnoty onkomarkerů mohou být ovlivněny celou řadou procesů. Pro kvalitní zhodnocení je nutná úzká spolupráce laboratoře a klinického pracoviště. ALE. ... diagnostický práh onkomarkerů umožňuje v příznivých případech odhalit nádor o hmotnosti 1 mg, tedy asi 106 maligních buněk, zatímco klinická diagnóza bývá určena většinou až u nádoru, který obsahuje nejméně 109 buněk, tedy nádor v průměru 1 cm. Aplikace a využití v onkologické praxi Screening Primární diagnostika Staging Sledování účinnosti terapie Sledování průběhu choroby Prognóza Predikce Analýza exprese molekulárních onkomarkerů Biologický materiál (tkáň tumoru, kostní dreň, periferní krev) _i Izolace RNA — RT- PCR (cDNA) I Relativní kvantifikace exprese k housekeeping genu (LightCycler) Pozitivní exprese markeru (např. TH, TrKC, c-myc.) může upřesnit diagnózu nebo poukáže na remisi/ progresi či na odpovídavost na léčbu. Odběry chodí opakovaně —► umožní sledovat minimální reziduálni nemoc v čase. Detekce minimální reziudiální choroby Detekujeme přítomnost izolovaných nádorových buněk v krvi, kostní dřeni a lymfatickém systému - možné prekurzory metastáz Detekce MRĎ (minimal residual disease) - detekce znaků epiteliálních buněk v kompartmentech mesenchmálního původu Imunohistochemie - citlivost 1 : 10 000 Průtoková cytometrie - citlivost 1 : 100 000 PCR- citlivost 1: 1000 000 Real- time PCR - citlivost až 1 : 10 000 000 Princip detekce mimimalni reziduálni choroby metodou RT-PCR - studium genové exprese Epiteliální (nádorová) buňka hledaný mRNA znak Mezenchymální (nenádorová) buňka mRNA cDNA DNA amplikoi detekce arnpl ikonu na gelu Izolace RNA—možná jen ze živých buněk >?000a I Reverzní transkripce s náhodnými (random) primery PCR reakce se specifickými primery I I Real time RT-PCR, detekce fluorescenčně označeného amplikonu v reálném čase v průběhu PCR reakce, fluorescenční značení je buď nespecifické (DNA interkalátory) nebo specifické (sondy), diky standardům je detekce kvantitativní Využití detekce minimální reziduálni choroby v klinické onkológii Detekce MRĎ a rozhodnutí o adjuvantní léčbě • Monitoring MRĎ v čase - relaps vs. remise • Včasný záchyt recidivy • Hodnocení léčebné odpovědi • Diferenciální diagnostika • Autologní transplantace při HĎ chemoterapii V LightCycler Data Analysis (Administrator) - [Quantification: 070516-TH; F2/F1; ampLifikace seg 2] C5 Cestina ^ File Quantification Report Window Help _ g X Analysis— Baseline Adjustment Analysis Notes C Fit Points C None (* Arithmetic Í* Second Derivative Maximum C Proportional C Normalised Name Standard Calculat... Cro.. 1 h-GSPDH10S 2 C31/07 h-GGPDH 3 C232/07 h-G6PDH 4 C233/07 h-GGPDH 5 C234/07 h-GGPDH S K- h-GGPDH 7 C23iy07 T H tkán 8 C231/07 T H tkán S C232/07 T H KD-L 10 C232/Ü7TH KD-L 11 C233/07TH KD-P C233>07TH KD-P 3 C234/07TH krev 14 C234/Ü7 T H krev 15 K+ TH 1G K- TH 1.000E+0G 1.000E+OG 22.15 2.445E+04 27.27 4.777E+05 23.17 3.315E+05 23.67 1.533E+05 24.74 2.190E+0G 21.07 2.193E+0G 21.07 4.415E+01 35.98 5.808E+01 35.G0 7.100E+05 22. G2 Stepi: Baseline Step 2: Analysis .0,16 í ž Start * Front ■ LCDA Bez názvu - Malování ■«,- V LightCycler Data Analysis (Administrator) - [Quantification: 070917-TH; F2/F1; amplifikace seg 2] C5 Čeština " ™ File Quantification Report Window Help _ 3 X Analysis C Fit Points (* Second Derivative Maximum -Baseline Adjustment None (* Arithmetic Proportional Normalized Name Standard Calculat... Cro.. 1 h-GSPDH10 5 2 50% NB h-GGPDH 3 10% NB h-GSPDH 4 1%NB h-GGPDH 5]JI HB h-GGPDH GXCHÍNB h-GEPCH 7 0,001% NB h-GGPDH 8 0,0001 Si N B h-GGPDH 5 K- h-GGPDH 10 50% NB TH 11 10% NB TH 12 1%NB TH 13 0,1% NB TH 14 0,01% NB TH 15 0,001 %NBTH 1G 0,0001 %NBTH 17 K+TH 18 K- TH 1.000E+05 1.000E+05 24.94 9.144E+02 31.41 1.70GE+05 24.20 2.421 E+05 23.72 Í.9G5E+0524 01 '2I79Ě+O523.74" 2.581 E+05 23. G2 5.373E+04 25.78 3.059E+03 28.75 G.409E+02 31.90 G.823E+01 34.98 5.189E+00 38.55 3.959E+00 38.92 2.8G0E+05 23.44 -Analysis Notes I 1 I 20 25 Cycle Number USING EXTERNAL STANDARD: F2-F1-2nd-040427 TH G6PDH transcriptor - Linear Regression ■ Crossing Points Slope = -3.17G Intercept = 40.82 I 1 I 3 4 Log Concentration L TH Iveta - Malování Z průběžných výsledků vyplývá detekce molekulárního relabsu onemocnění s měsíčním předstihem od klinicky diagnostikovaného relapsu Kazuistika R.E. s dg. neuroblastom IV. stadia datum odběru BM 1. 3. 07 exprese TH genu KD pozitivní PK pozitivní FISH N my c -lp36- klinický stav KD, metastázy v obratlech bederní páteře l.blok CHT 30.4.07 PK KD(PS,LS, sternum) slabě pozitivní 0 před 2. Blokem CHT 26.6.07 KD (LS,PS slabě pozitivní) 0 plánovaná separace PBSC 17.10.07 PK, KD negativní lok. amp. N-myc gainl7q - před 2. PBSC (1-4.11.01) VGPR 5.11.07 0 N-myc - 1 11 m n N-my~ - 22.11.07 ABCD štěpy negativní KD,PK negativní 0 25.1.08 PK negativní 0 před vysoce dávkovanou CHT s transplantací PBSC 27.2.08 PK negativní 0 kontrola po transplantaci 29.3.08 KD-LS negativní KD-PS pozitivní molekulární relabs 26.4.08 klinický relabs Onkomarkery Vyšetřování onkomarkerů je obrovským pokrokem při diagnóze a sledování efektu léčby nádorových onemocnění, jejichž počet se nejen v České republice, ale i v celé Evropě každoročně výrazně zvyšuje. Vzhledem k výše uvedeným podmínkám, pravidlům použití a značné finanční nákladnosti patří jejich využití v klinické praxi spíše do ordinací odborných lékařů než do ordinací praktických lékařů. Výjimku mohou tvořit skupiny s vysokým rizikem vzniku nádorového onemocnění, obecně skupiny s profesním rizikem vzniku karcinomu, nebo případy familiárních výskytů nádorových onemocnění, tedy skupiny kontrolované praktickými lékaři. Molekulárně genetická diagnostika strategie Přímá DNA diagnostika: • zjistí, zda analyzovaná DNA nese či nenese mutaci • detekce mutací v genech asociovaných s chorobou Nepřímá DNA diagnostika • užitím vazebních markem v rodinných studiích odhalí alelu genu v asociaci s nemocí v rodině • využití polymorfních míst lidského genomu 01 1000100011001 31 001 OC 00010001100011 3C 11 001 K 1 11 011001001010 1 011 OC •MM»ir»TÍ»l!M 1 0f)f 1 i l 1,1«! l mmi \mlM 1 | ,iL _ T CCATTATGGCC ATTATGG CC ATT T XATTA r Nepřímá molekulárně genetická diagnostika Nepřímá diagnostika byla daleko více používána v minulosti, kdy u většiny chorob nebyla známa přesná molekulární povaha poškození genu, popř. ani který gen přesně je u dané choroby poškozen. U nepřímé diagnostiky postačuje, je-li známa jen jeho přibližná poloha v genomu. Dnes se tento typ vyšetření používá tehdy, kdy sice víme, porucha kterého genu je zodpovědná za daný patologický fenotyp, ale nevíme, jaké konkrétní poškození genu chorobu u vyšetřovaného jedince vyvolá. Nepřímá molekulárně genetická diagnostika nezkoumá se přímo přítomnost nebo nepřítomnost určité poruchy v genu, ale segregace markeru, který je ve vazbě na gen, jehož porucha vyvolá vadný fenotyp. Marker, jehož segregace v rodokmenu se sleduje, se dědí totiž společně s genem, protože je v genomu v jeho těsné blízkosti, sám ale s chorobou nemá žádnou příčinnou souvislost. Ve zkoumaném rodokmenu se porovnává segregace markeru se segregací choroby Jako markery se používají DNA polymorfismy . DNA polymorfismy Sekvence DNA se liší mezi jednotlivci. Přítomnost několika alel v určitém místě. tjako místo v sekvenci DNA, v němž jsou jedinci rozdílní. •jednobodový polymorfismus (single nucleotide polymorphism - SNP) • minisatelitové polymorfismy VNTR - variable number tandem repeats •mikrosatelitové polymorfismy {STR - short tandem repeats,) TGCATljfcKM *»rc rflfc *Uf. 'MM. t t SNP Microsatellite I i I II MHIIIII B. SNR, microsatellite. min isa t d lite Minisateilite -100.000 bp - DNA strand | Micro satellites SNPs ■ II II II II I I I Mil I I III I C. Genetic variabilty along a stretch of 100 000 bp Jednobodový polymorfismus (single nucleotide polymorphism - SNP) •rozdíly v jednom nukleotidu v určitém místě •vyskytuje se asi jedenkrát na 1000 párů bazí. •celý lidský genom obsahuje více než 1,5 milionu SNPs •vyskytují se v intronech, v extragenových oblastech •jen asi 50 000 SNP v kódujících sekvencích genů •přítomnost/nepřítomnost restrikč. místa, vznik RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Jednobodový polymorfismus (single nucleotide polymorphism - SNP) Detekce RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) reštrikční štěpení genomické DNA s následným Southern blottingem PCR amplifikace s následným restrikčním štěpením PCR amplifikace s následnou sekvenací DNA array (čipy) analýza až 100 tisíc SNP v jedné analýze Mikrosatelity - krátké tandemové repetice STR (Short Tandem Repeats) délka základní repetice 2 - 6 bp počet opakování repetice 2 - 100 bp Rozptýlené rovnoměrně v lidské genomu Vyskytují se běžně v populaci Nejsou přepisovány do proteinu leží v intronech Nejsou příčinou choroby Tvoří vzorce bez vztahu s fenotypem Mezi jednotlivci se velmi liší Odlišují jednoho člověka od druhého TCCCAAGCTCTTCCTCTTCCCTAGATCAATACAGACAGAAGACA GGTGGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGA TAGATAGATATCATTGAAAGACAAAACAGAGATGGATGATAGAT ACATGCTTACAGATGCACAC 7 repeats........ ° repeats........ 9 repeats........ 1 0 repeats........ 11 repeats........ 1 2 repeats........ 1 3 mpftats........ * Target region (shorttandem repeat) Využití polymorfních míst lidského genomu □ Identifikace osob/vzorků DNA (A. Jeffreys 1985) (lidé obvinění z kriminálních Činů, oběti katastrof) □ Určování paternity (VNTR, STR) □ Nepřímá diagnostika monogénních chorob □ Hledání nových genů (poziční klonování genů) □ SNP a multifaktoriální choroby Nepřímá diagnostika Nepřímá diagnostika gelová elektřofořéza kapilární elektřofotéza ■■ JBiSirnMÍSMrOTECSnSO/ || »:S^H ÍG5HUM5BÍ Nepřímá diagnostika Vazebná analýza je umožněna: — v rodinách s dvěma a více jedinci s klinicky potvrzenou diagnózou — rozlišením dvou chromozomů pomocí markerů na DNA — přiřazením DNA markerů (tj. chromozomu) k patologii v rodině Základní principy nepřímé DNA diagnostiky 1) odlišení dvou chromozomů rodičů (heterozygozyta markerů) 2) určení fáze (určení haplotypu - souboru alel polymorfních míst ve vazbě) 3) určení haplotypu (chromozomu) asociovaného s patologií v rodině Přísná rodinná specifita Nikdy nepotvrzuje diagnózu Rodokmen rod Nepřímá diagnostika užitím vazebních markerů v rodiných studiích odhalí chromozom v asociaci s nemocí v rodině Nepřímá diagnostika GTATCACACACATTCGG od otce od matky alela AI: ------GTATCACATTCGG- alela A2: -----GTATCACACACATTCGG- délka alely m bp délka alely m+4 bp [mt] + [=] [A1]+[A3] P]+[=] [A1]+[A2] [mt] + [=] [A1] + [A3] P]+[=] [A1] + [A1] Nepřímá diagnostika Neurofibromatóza typu 1 Autozomálně dominantní dědičbňost 131 131 179 179 135 131 187 179 135 181 131 179 131 135 179 179 O □ 131 131 179 179 135 181 131 179 neznáma mutace □ 135 181 131 179 135 181 135 185 Polymorfní systémy GXAlu / i27b IVS38GT /Í38 haplotyp v asociaci s neznámou mutací Nepřímá diagnostika Cystická fibróza I I Autozomálne recesivní dědičnost F508del CD neznáma mutace Polymorfní systémy IVS17BTA alely 1 -6 IVS8BTA alelyA-D U haplotyp v asociaci s neznámou mutací Cystická fibróza Nepřímá diagnostika_ Lokalizace extra a inttagenních polymotfních míst genu CFTR XV-2C Taql KM19 Psrl CFTR J44 Xbal IVS67 (GATTI)i IVS8 (CA) \ 1 \ f T854T Avall N t IVS17b (CA)n TUB20 PrsII N t kbO 50 100 150 200 230 Cystická fibróza Nepřímá diagnostika K určení patologického haplotypu slouží genotyp zdravé sestry zemřelého probanda c 2 I I F508del m neznáma mutace Polymorfní systémy IVS17BTA alely 1 -6 IVS8BTA alelyA-D [J haplotyp v asociaci s neznámou mutací A 3 1 B AC 2 2 I I Cystická fibróza Nepřímá diagnostika c 5 F508del CD AA 6 6 B 1 AA 2 3 o o A C CA 3 5 5 6 5 6 1 3 A 2 I I 1 O AD AA 2 2 2 2 I AD 2 2 AD 2 2 neznáma mutace Polymorfní systémy IVS17BTA alely 1 -6 IVS8BTA alelyA-D U haplotyp v asociaci s neznámou mutací Nepřímá diagnostika Duchennova svalová dystrofie X vázaná dědičnost 243 251 175 190 243 251 175 190 2&3. 251 178 193 Legenda STR50 STR49 STR45 STR50 neznáma mutace haplotyp v asociaci s neznámou mutací Duchennova svalová dystrofie _Nepřímá diagnostika_ Polymoffhí místa v dystrofinovém genu 5 (CA)n amHI ST R45 S TR50 Taq I STR44 STR4 9 e 'T.iaplř...... ■I" ■2- 3 4 ■5- 6 ,i,g 13 3 l i 1\ 1Z 44 45 48 49 50 3 (CA)n 79 3'UTR Legenda •5(CA)n •pERT 87-8/Taq I •pERT 87-15/BamH I alely 172 - 184 pb alela 145 pb (-), 71 pb a 74pb (+) alela 216 pb (-), 166 pb a 50 pb (+) STR sekvence /(CA)n/: STR44 alely 174 - 204 pb, hetetozygozyta 87% STR45 alely 156 - 184 pb, hetetozygozyta 89% STR49 alely 227 - 257 pb, hetetozygozyta 93% _STR50 alely 233 - 251 pb, hetetozygozyta 71% ►3 (CA)n alely 131 - 137 pb Duchennova svalova dystrofie _Nepfima diagnoslika_ GeneScan® 3.1 PRISM 210 240 GeneScan™ ProjecM4/3/2002 Display-9 270 720C. 540C. 360C. 180C. C HH 13B:Sample13 / 88/95 STR50V 1 5B:Sample1 5 / 90/95 STR50 / Page 1 of 1 300 proband A HB 16B:Sample16 / 91/95 STR50 / otn Duchennova svalová dystrofie _Nepřímá diagnostika_ K určení patologického haplotpu slouží genotyp zdravého bratra zemřelého probanda 243,251 251,242 178,153 193,198 243 247 170 193 Zeny jsou jasné přenašečky vzhledem k příbuzným DMD mužům neznáma mutace Legenda STR50 STR49 STR45 STR50 haplotyp v asociaci s neznámou mutací Duchennova svalová dystrofíe _Nepřímá diagnostika_ [172] [226] [237] [184]*-»fl 88] [172]<^170] [230]^"»[240] [237]^2 Nelze utčit haplotyp ptobandky vzhledem neznalosti genotypu otce a matky Ptobandka není DMD přenašečka haplotypy polymorfních markerU [xxx] STR44 [xxx] STR45 [xxx] STR49 [xxx] STR50 haplotyp polymorfních markerU ve vazbě s patologií Hemofílie A Nepřímá diagnostika mutace mohla vzniknout de novo při ttansmisi gamety 142 142 79 81 - + 141 L35 142 146 79 79 141 137 140 81 137 140 140 79 81 137 137 140 142 81 81 137 137 neznáma mutace haplotyp v asociaci s neznámou mutací Legenda STR13 STR22 RFLP18 STR24 , Retinoblastom ■ RB1 Provedena mutační analýza genu Rbl • sekvenace kódující oblasti • sekvenace promotorové oblasti • MLPA pro detekci velkých delecí a duplikcí • merylační analýza Nebyla detekována patologie v genu Rbl Retinoblastom Nepřímá diagnostika Používány polymorfní místa •extragenová (DS13S 1307, DS13S 272, DS13S 164) •intragenová (Rbl.20B) [A1] + [A2] [A3]^[A4] [A7| + [A8] [A5] + [A6] AI: DS 13S 1307 [141] DS 13S 272 [133] DS13S 164 [179] RM.20B [3] A2: DS 13S 1307 [151] DS 13S 272 [133] DS13S 164 [188] RM.20B [4] A3: DS 13S 1307 [139] DS 13S 272 [127] DS13S 164 [179] RM.20B [1] A4: DS 13S 1307 [139] DS 13S 272 [133] DS13S 164 [186] RM.20B [1] A5: DS 13S 1307 [139] DS 13S 272 [131] DS13S 164 [188] RM.20B [1] A6: DS 13S 1307 [126] DS 13S 272 [133] DS13S 164 [188] RM.20B [2] A7: DS 13S 1307 [126] DS 13S 272 [129] DS13S 164 [188] RM.20B [4] A8: DS 13S 1307 [139] DS 13S 272 [127] DS13S 164 [178] RM.20B [5] RB1 [A1] + [A3] [A6] + [A7] Nelze určit haplotyp v asociaci s patologií v RB1 genu Vysvětlení: • výskyt mutace v jiném systému regulace buněčného dělení a růstu (např. dráha pl4) • nehereditární forma retinoblastomu u obou bratranců Preimplantační genetická diagnostika monogenne dedičných chorob ^Selekce embryí pro in vitro fertilizaci (IVF) pro páry s rizikem přenosu dědičné choroby na potomky Pro genetickou analýzu vhodné tři typy buněk 1. Polární tělíska odebrané ze stádia oocyt/zygota 2. Buňky (blastomery) z embryí ve stádiu rýhování 3. Buňky trofoblastu z blastocyst Monogenní choroby - metoda PCR Komplikace : ADO (alelic drop out) amplifikace jedné alely pod úrovní detekovatelnosti Minimalizace ADO protokol monitorující výskyt ADO: •multiplex PCR (koamplifikace mutace s polymorfními markery) •SSCPnebo DGGE analýzy ( detekující obě alely současně, potvrdí genotyp) •fluorescenčníPCR - redukuje výskyt ADO, detekce DNA fragmentu je až lOOOx citlivější ve srovnání s konvenční PCR technikou Preimplantační genetická diagnostika _Nepřímá diagnostika_ Detekce mutace F508del v genu CFTR Multiplex PCR — koamplifikace lokusu mutace F508del s inttagenním mikřosatelitem IVS17bTA Kapilární elekttofotéza 90_120_^BG_180_210_£40_270_300_ 2B : 966/98 ivs17/proband / 966/98 ivs17/proband / 2R : 966/98 ivsl 7/prob-and / GS500TAMRA / 8B : dFS08/nondF508 CFTR / dF508/nĎndF508 CFTR / Genotyp blastomery: [F508del] + [=] t aKtory, Které ovlivňuji spoienuvost nepřímeno moieKuiarne geneticKeno vyšetrení 1. Spolehlivost klinické diagnózy Klinická diagnóza onemocnění musí být naprosto přesná. Je-li vyslovena špatná klinická diagnóza, uvedené molekulární vyšetření nemá smysl, protože se sledovala segregace markeru vázaného na gen, který nemá s chorobou nic společného. Výsledek molekulárního vyšetření je v tom případě nesmyslný a zavádějící. 2. Možnost rekombinace mezi markerem a genem Mateřská a otcovská chromozomální DNA se v průběhu crossing-overu "promíchá" v rámci homologních chromozomů Pohlavní buňka pak nese nově "smíchanou" DNA - takto se vedle sebe mohou v gametě dostat informac které spolu původně nesousedily Např. varianta markeru původně ležící v nebo v sousedství mutované alely na otcovské DNA se tímto ' v nebo v sousedství "zdravé" alely pocházející z mateřské DNA, neboť mezi ním a markerem došlo k re Pravděpodobnost rekombinace roste se vzdáleností mezi sledovaným markerem a genem. smícháním" octne ombinaci. 3. Spolehlivost biologických vztahů v rodokmenu Biologické otcovství vyšetřovaných osob v rodokmenu musí souhlasit s údaji uvedenými v rodinné anamnéze která je většinou sestavena na podkladě výpovědi probanda. Je-li zapotřebí vyšetřit široký rodokmen, proband nemívá o těchto citlivých údajích týkajících se rodičů, prarodičů nebo vzdálenějších příbuzných znalost. Někdy je jako vedlejší produkt nepřímého molekulárně genetického vyšetření odhaleno, že u některých osob nesouhlasí biologické vztahy v rodině. Někdy může tato souvislost zůstat nepoznána a může vést k falešnému výsledku. Cystická fibróza Nepřímá diagnostika [F508]+[=] [A1]+[A3] [=]+[=] [A2]+[A5] '/// [F508]+[=] [A1]+[A2] [=]+[=] [A3]+[A5] [F508]+[G542X] [A1]+[A1] K provedení nepřímé diagnostiky je u některých chorob nutné vyšetřit co největší okruh členů rodiny, tedy i zdravých, u kterých se nepředpokládá, že by mohli být nositeli patologie (partneři osob v riziku). Z praktického hlediska je to komplikované a někdy až nemožné, v některých rodinách se jejich členové ani příliš neznají a nemají ochotu podstupovat vyšetření kvůli probandovi, který jez jejich hlediska vzdáleným příbuzným. Nepřímá molekulárně genetická diagnostika má mnoho nevýhod a její význam postupně klesá s tím, jak se vyvíjejí možnosti přímého molekulárně genetického vyšettření. Molekulárně genetická diagnostika představuje zásadní zlepšení lékařské péče ALE Molekulárně genetická diagnostika Problémy Vysoké náklady na molekulárně genetické vyšetření, velmi drahé používané chemikálie a přístrojová technika Při pozitivním nálezu znamená bolestnou zdravotní prognóz bez možnosti nápravy. Pacienta může eticky, sociálně i ekonomicky poškodit prozrazení jeho genetických údajů. Genetika prožívá svůj zlatý věk, je štěstí být u toho 1 ' L Síť mu