Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU BUNĚČNÁ SMRT Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. „For every cell, there is a time to live and a time to die.“ Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. • typy buněčné smrti • nekróza • autofagie • apoptóza • metodické přístupy ke studiu apoptózy • apoptóza a medicínské aspekty Program přednášky: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. TYPY BUNĚČNÉ SMRTI Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Původní dělení způsobů buněčné smrti: • smrt v důsledku působení škodlivého vnějšího faktoru: náhodná (accidental) buněčná smrt = nekróza • smrt jako indukovaná sebevražda: programovaná (programmed) buněčná smrt = apoptóza hodnocení podle morfologických změn Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Buněčná smrt: • katastrofická buněčná smrt  nekróza • fyziologická buněčná smrt  apoptóza (programmed cell death type I, PCDI) •kaspáza-dependentní •kaspáza-independentní  autofagie (programmed cell death type II, PCDII) hodnocení podle biochemických změn Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Kdy je buňka mrtvá? • rozrušení plasmatické membrány (důkaz např. inkorporace PI in vitro) • rozpad buňky včetně jádra na fragmenty (apobodies) • fragmenty jsou pohlceny jinými buňkami (in vivo) rozdíl mezi mrtvou a umírající buňkou Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. KATASTROFICKÁ (NEPROGRAMOVANÁ) BUNĚČNÁ SMRT NEKRÓZA Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Indukce nekrózy a) rozsáhlé poškození, při němž už nemohou být aktivovány mechanismy apoptózy b) působení stresových faktorů • změny koncentrace iontů, pH... • vyčerpání zdrojů energie • změny teploty • poškození buňky nebo jejích organel Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Příznaky a průběh nekrózy: • poškození mitochondriální membrány • pronikání iontů Ca2+ do mitochondrií • zakulacení a prasknutí mitochondrií • ztráta regulace transportu iontů • zakulacení buňky (swelling) • lýze buňky • vznik nekrotického ložiska • invaze makrofágů • zánětlivá reakce Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. nekrotické ložisko ve tkáni Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. FYZIOLOGICKÁ (PROGRAMOVANÁ) BUNĚČNÁ SMRT Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. PROGRAMOVANÁ BUNĚČNÁ SMRT (Programmed Cell Death, PCD) • indukovaný, regulovaný a selektivní proces pro vyřazování určitých buněk Apoptóza (apoptosis, type I PCD) • kaspázy • kalpainy, katepsiny, granzymy Autofagie (autophagy, type II PCD) • autofagozomy/autolysozomy (lysozomální proteázy) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. AUTOFAGIE (PCDII) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Průběh autofagie 1. indukce (starvace) 2. vytvoření autofagosomu (nejasný původ, ER?) 3. vazba a fúze s lysosomem 4. rozpad autolysosomálního veziklu • účast savčích homologů genů Atg (kvasinky) Typy autofagie: • mikroautofagie (transfer do lysosomu přímou invaginací) • makroautofagie (vznik autofagosomu) • chaperon-mediated autofagie (CMA) - selektivní Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. autofagozom autolysozom vznik autofagozomu fúze s lysozomem Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. mitochondrie v autofagosomu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. APOPTÓZA (PCDI) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H., Currie, A.R. Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer (1972) 26, 239. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. 2002 - Nobelova cena za fyziologii a lékařství: za výzkum genetické regulace vývoje orgánů a programované buněčné smrti Sydney Brenner H. Robert Horvitz John E. Sulston Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Caenorhabditis elegans • 959 somatických buněk = dospělý hermafrodit, navíc 131 podléhá apoptóze • regulace apoptózy - 14 genů Ced: Ced-3, Ced-4 - indukce Ced-9 - represe Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Příčiny apoptózy 1. Apoptóza je nezbytná pro řádný vývoj organismu: • resorpce ocásku během metamorfózy pulce v žábu • odstranění tkáně mezi prsty během embryogeneze • odstranění nadbytečných neuronů při vytváření synapsí v mozku • uvolňování endometria na počátku menstruace Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. odstranění nadbytečných neuronů při vytváření synapsí v mozku Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. syndaktylie (defekt apoptózy) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Příčiny apoptózy 2. Apoptóza je nezbytná pro likvidaci buněk, které představují ohrožení integrity organismu • buňky infikované viry • efektorové buňky imunitního systému po odeznění imunitní odpovědi • buňky s poškozením DNA zvýšená produkce proteinu p53 (induktor apoptózy) • nádorově transformované buňky Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Indukce apoptózy Odstranění pozitivního signálu • růstové faktory - neurony • Interleukin 2 (IL-2) - lymfocyty Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Indukce apoptózy Přijetí negativního signálu • zvýšení hladiny oxidačních látek v buňce • poškození DNA (volné radikály, UVR, gama záření, chemoterapeutika) • molekuly (death activators), které se napojují na specifické receptory (death receptors) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Průběh apoptózy: normální buňka smršťování rozpad (fragmentace) apoptotická tělíska (apo-bodies) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. 1. zmenšení (smrštění) buňky 2. poruchy mitochondrií a uvolnění cyt-C 3. blebbing plazmatické membrány 4. změny v plazmatické membráně 5. kolaps jádra (degradace chromatinu) 6. zvýšená aktivita transglutaminázy 7. aktivace kaspáz, proteolytické štěpení 8. rozpad buňky na apoptotická tělíska 9. fagocytóza apoptotických tělísek Morfologické a biochemické příznaky apoptózy Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Metodické aspekty studia apoptózy • morfologické příznaky (1972) blebbing membrány, kondenzace chromatinu, kolaps jádra, vznik apo-bodies • fragmentace DNA (1987) fragmenty: ladder, zlomy v řetězcích: TUNEL • aktivace proteolytické kaskády (1995) produkty proteolytického štěpení • změny plazmatické membrány (1997) externalizace fosfatidylserinu: annexin-V • změny mitochondrií (1998) změny permeability mitochondriální membrány, detekce Cytochomu C a AIF Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Blebbing plazmatické membrány • degradace kortikálního cytoskeletu (fodrin, aktin) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Změny v plazmatické membráně • externalizace fosfatidylserinu („eat me“ signal) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Změny v plazmatické membráně • detekce fosfatidylserinu • Annexin V + fluorochrom Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Změny v plazmatické membráně • detekce fosfatidylserinu – Annexinem V • flow cytometrie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Kolaps jádra (degradace chromatinu) • kondenzace chromatinu na periferních oblastech jádra • internukleosomální štěpení DNA - žebříček (ladder) • fragmentace jádra CAD – kaspázou aktivovaná Dnáza ICAD – inhibitor CAD Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Detekce štěpení DNA: TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling TUNEL DAPI Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Aktivace proteolytického štěpení Kaspázy • cysteinové proteázy, štěpící na karboxyskupině kyseliny asparagové • caspases = cysteinyl-aspartic-acid-proteases • 14 druhů kaspáz (u člověka): iniciační (apikální - 8, 9, 10 a 12) efektorové (exekuční - 3, 6 a 7) pro-inflamatorní Katepsiny, kalpainy, granzymy Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Aktivace kaspáz, proteolytické štěpení prokaspáza kaspáza aktivní kaspáza Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Aktivace proteolytického štěpení Substráty kaspáz - proteiny • „cell death“ proteiny (Bcl-2,Bcl-XL, prokaspázy..) • regulátory b. cyklu (MDM2, p21, Rb, cyklin A..) • cytoskelet (aktin, fodrin, keratiny, laminy..) • DNA metabolismus (ICAD, PARP..) • RNA metabolismus • signální dráhy • transkripční faktory • proteiny spojené s neurodegenerativními chorobami Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. a-tubulin / DAPI aktivovaná kaspáza 3 Aktivace kaspáz – fluorescenční mikroskopie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Aktivace kaspáz – detekce (WB) Lamin A Poly (ADP-ribose) polymerase Kaspáza-3 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Rozpad buňky na apoptotická tělíska • účast nově formované aktinové 3D struktury a nesvalového myosinu • apoptotická tělíska obsahují zbytky jádra, organely a části cytoplazmy Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Fagocytóza apoptotických tělísek • pohlcení apoptotických tělísek okolními buňkami (makrofágy, dendritické buňky) • fagocytující buňky vylučují cytokiny, které zabraňují zánětu ve tkáni Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Apoptóza vyvolaná vnitřními signály: • zdravá buňka exprimuje na vnější membráně mitochondrií BCL-2 - BCL-2 inhibuje oligomerizaci BAK a BAX • při vnitřním poškození buňky (poškození DNA, ↑c Ca2+...) - permeabilizace vnější membrány (póry z BAK, BAX proteinů) - uvolnění cytochromu-c do cytoplasmy • vzniká apoptosom: APAF-1 Cytochrom C prokaspáza 9 (dATP) • vzniká aktivní kaspáza 9 (iniciační), která štěpením aktivuje další kaspázy (efektorové) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Změny mitochondrií změna permeability mitochondriální membrány detekce cytochomu-C - fl. mikroskopie - flow-cytometrie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Apoptóza vyvolaná vnitřními signály, nezávislá na kaspázách • probíhá i při aplikaci inhibitorů kaspáz • průběh smrti je delší • ztráta mitochondriálního transmembránového potenciálu • inhibice respiračního řetězce • štěpení DNA pomocí AIF a ENDOG (apoptosis inducing factor, endonukleáza G) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Apoptóza vyvolaná vnějšími signály: • aktivační molekuly (death activators) se napojují na specifické receptory v plazmatické membráně (death receptors, DR1-5): Tumor necrosis factor (TNF- ) - TNF receptor Lymphotoxin (TNF- ) - TNF receptor Fas-ligand (FasL) - Fas receptor (CD95) • přenos signálu do cytoplasmy aktivuje prokaspázu-8 (-10) (iniciační kapázy) • aktivovaná kaspáza-8 (-10) štěpením dalších prokaspáz spouští proteolytickou kaskádu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. DISC death-inducing signaling complex • ligand • receptor • adaptorové proteiny • prokaspáza-8 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Apoptóza vyvolaná vnějšími signály: dependence receptotors (např. DCC) • rozdílná signalizace: • při navázaném ligandu ->přežívání buňky • po uvolnění ligandu -> aktivace kaspázové kaskády Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Současné rozdělení regulované buněčné smrti a) autofagická buněčná smrt b) apoptóza vyvolaná vnitřními signály, závislá na kaspázách c) apoptóza vyvolaná vnitřními signály, nezávislá na kaspázách d) apoptóza vyvolaná vnějšími signály, aktivací death receptors e) apoptóza vyvolaná vnějšími signály, (de)aktivací dependence receptors f) anoikis – smrt způsobená ztrátou kontaktu k podkladu nebo okolním buňkám (mechanismus vnitřní apoptózy) g) cornification (keratinizace) - terminální diferenciace epidermálních buněk, vznik vrstvy mrtvých keratinocytů (=stratum corneum) h) entosis (buněčný kanibalismus) – pohlcení buňky stejným typem (ne fagocytem), postupná degradace ve fagozomu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. cornification entosis http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407013943 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Současné rozdělení regulované buněčné smrti i) mitotická katastrofa – iniciace navození smrti v M-fázi buněčného cyklu vlivem poškození mitotického aparátu j) necroptosis (regulovaná nekróza) – smrt vyvolána aktivací death receptorů při současné inaktivaci kaspáz (8,10) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. k) netosis – odvozeno od NET (Neutrophil Extracelular Trap) = mikrobicidní struktura složená z chromatinu, histonů a antimikrobiálních proteinů produkovaná granulocyty smrt specifická pro granulocyty, nezávislá na kaspázách; silná vakuolizace cytoplazmy, dekondenzace chromatinu, rozpad membrány jádra a granulí – podobnosti s autofagií a regulovanou nekrózou l) parthanatos – při nadměrné aktivaci PARP (poly ADP-riboza polymeráza), tvorba PAR, následná degradace chromatinu; popsánu u mrtvice, diabetu a neurodegenerativních chorob m) pyroptosis – původně popsáno u makrofágů po infekci (S. tiphymurium), typickým příznakem aktivace kaspázy-1->aktivace pyrogenního IL-1 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Apoptóza a nádory Chemo- a radio- terapií indukovaná buněčná smrt strategie: • zabránit neregulovanému buněčnému dělení nádorových buněk • ovlivnění buněčného cyklu a DNA syntézy u rychle se dělících buněk - antimetabolity - genotoxické látky způsobují apoptózu - mitotické inhibitory • defekty v apo dráhách negativně ovlivňují léčbu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Chemo- a radio- terapií indukovaná buněčná smrt - signalizace • indukce poškození DNA – (DNA damage signal) • přenos z DNA vazebných proteinů na kinázy PI3K rodiny (ATM, ATR) - funkce v kontrolních uzlech • fosforylují efektorové kinázy (Chk1, Chk2 a c-Abl) • fosforylace TF - p53, p73, E2F.. • zvýšení exprese genů – skupiny reparace DNA, zástava buněčného cyklu a apoptóza Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Vztah p53 a apoptózy • aktivuje mitochondriální apopotickou dráhu - upregulace proapoptotických genů (Bax, Bid, Noxa, Puma) - downregulace antiapoptotických genů (Bcl-2, Mcl-1) • aktivuje receptorovou apoptotickou dráhu upregulace death receptorů (Fas, DR4, DR5) • nezávisle na transkripci translokace p53 do mitochondrií a vazba na Bcl-2 a Bcl-XL Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Apoptóza a nádory Inhibice apoptózy nádorových buněk bez účasti virů: • narušení apoptózy aktivované receptory u nádorových buněk (např.) a) nedostatečná aktivita inicičních kaspáz (8,10) – z důvodu metylace promotoru, delece nebo mutace genu pro kaspázu-8 (neuroblastom, plicní karcinom, Ewingův sarkom, melanomy) b) sekrece „decoy“ molekuly, která se váže na FasL a brání její vazbě na FasR (nádory plic a střeva) c) sekrece FasL nádorovými buňkami indukuje apoptózu cytotoxických lymfocytů • narušení apoptózy spouštěné mitochondriemi u nádorových buněk (např.) a) delece a/nebo metylace genu pro Apaf-1 (melanom) b) nedostatečná aktivita iniciční kaspázy 9 (nádory ovaria) c) overexprese Bcl-2 z důvodu translokace (leukémie) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Apoptóza a nádory Viry, inhibující apoptózu transformovaných buněk: tvorba proteinů blokujících apoptózu na různých úrovních • receptorová apoptóza • mitochondriální apoptóza • p53 • podpora proliferačních signálních drah • Human papilloma virus (HPV): exprese proteinu E6 - inaktivátor proteinu p53 • Epstein-Barrové virus (EBV): produkuje protein, podobný proteinu Bcl-2 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. When Cells Die II: R. A. Lockshin, Z. Zakeri Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Apoptóza a imunitní systém • nutnost odstranění aktivovaných lymfocytů • produkují protilátky a cytokiny, jsou cytotoxické Regulace apoptózy • omezení růstových faktorů (IL-2) pro T buňky reagující na vnější a přechodné antigeny • pomocí „death“ molekul (Fas ligand) pro T buňky reagující na vnitřní a trvalé antigeny Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Apoptóza a imunitní systém defekty v indukci apoptózy a autoimunitní choroby • neschopnost navození apoptózy a přežívání autoreaktivních lymfocytů - mutace ve Fas receptoru (CD95) nebo Fas ligandu –> lymfadenopatie (zvětšení uzlin), akumulace lymfocytů • účast „death“ receptorů a ligandů v poškození okolní tkáně místo lymfocytů Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Defekty v indukci apoptózy a autoimunitní choroby systémový lupus erythematodes (SLE), lupenka, revmatoidní artritida, Hashimotovo struma… systémový lupus erythematodes - častěji u žen (90%) - motýlový erytém na obličeji - artritida - zánět ledvin - nedokrvení periferii Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Autoimunitní choroby: systémový lupus erythematodes  porucha funkce makrofágů  vznik sekundární nekrózy  uvolnění prozánětlivých látek  vystavení autoantigenů  zánět Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Apoptóza a imunitní systém AIDS: pokles CD4+ T-lymfocytů • pouze část infikována HIV, většina umírá apoptózou • infikované buňky produkují virové proteiny (Tat, gp120, Nef, Vpu), • blokují Bcl-2, aktivují pro-kaspázu 8 • změny v expresi cytokinů (↑ IL-4, IL-10; ↓ IL-12, INF-γ) • viry a jejich proteiny v extracelulární prostoru aktivují apoptózu v okolních lymfocytech Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2. Apoptóza a degenerativní onemocnění Alzheimerova choroba Parkinsonova choroba Huntingtonova choroba nejasné mechanismy indukce apoptózy: • volné radikály • nedostatečná hladina nervových růstových faktorů • vysoká hladina neurotransmiterů • vnitrobuněčná akumulace toxických proteinů Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2013 - 02 / 27.2.