1 Bi8120 A lik á b ěč á bi l iBi8120 A lik á b ěč á bi l iBi8120 Aplikovaná buněčná biologieBi8120 Aplikovaná buněčná biologie BUNĚČNÁ SMRTBUNĚČNÁ SMRTBUNĚČNÁ SMRTBUNĚČNÁ SMRT RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MUÚstav experimentální biologie PřF MUÚstav experimentální biologie PřF MU 2 „For every cell, „For every cell,  there is a time to live and a time to die.“there is a time to live and a time to die.“ Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 3 P ř d áškP ř d áškProgram přednášky:Program přednášky: • typy buněčné smrti • nekróza • typy buněčné smrti • nekróza • autofagie • apoptóza • autofagie • apoptózap p • metodické přístupy ke studiu apoptózy • apoptóza a medicínské aspekty p p • metodické přístupy ke studiu apoptózy • apoptóza a medicínské aspekty• apoptóza a medicínské aspekty• apoptóza a medicínské aspekty Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 4 TYPY BUNĚČNÉ SMRTITYPY BUNĚČNÉ SMRTITYPY BUNĚČNÉ SMRTITYPY BUNĚČNÉ SMRTI Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 5 Původní dělení způsobů buněčné smrti:Původní dělení způsobů buněčné smrti: • smrt v důsledku působení škodlivého vnějšího • smrt v důsledku působení škodlivého vnějšího  faktoru: náhodná (accidental) buněčná smrt k ó faktoru: náhodná (accidental) buněčná smrt k ó= nekróza • smrt jako indukovaná sebevražda: = nekróza • smrt jako indukovaná sebevražda:j programovaná (programmed) buněčná smrt = apoptóza j programovaná (programmed) buněčná smrt = apoptóza hodnocení podle morfologických změnhodnocení podle morfologických změn Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 6 Buněčná smrt:Buněčná smrt: • katastrofická buněčná smrt  nekróza • katastrofická buněčná smrt  nekróza • fyziologická buněčná smrt  apoptóza • fyziologická buněčná smrt  apoptóza (programmed cell death type I, PCDI) •kaspáza‐dependentní (programmed cell death type I, PCDI) •kaspáza‐dependentní •kaspáza‐independentní  autofagie •kaspáza‐independentní  autofagie (programmed cell death type II, PCDII) h d í dl bi h i ký h ě (programmed cell death type II, PCDII) h d í dl bi h i ký h ě Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. hodnocení podle biochemických změnhodnocení podle biochemických změn 7 Kdy je buňka mrtvá?Kdy je buňka mrtvá?Kdy je buňka mrtvá?Kdy je buňka mrtvá? •• rozrušení plasmatické membrány (důkaz např. rozrušení plasmatické membrány (důkaz např. •• rozrušení plasmatické membrány (důkaz např. rozrušení plasmatické membrány (důkaz např. p y ( pp y ( p inkorporace PI inkorporace PI in vitroin vitro)) •• rozpad buňky včetněrozpad buňky včetně jádra na fragmenty jádra na fragmenty  p y ( pp y ( p inkorporace PI inkorporace PI in vitroin vitro)) •• rozpad buňky včetněrozpad buňky včetně jádra na fragmenty jádra na fragmenty p yp y j g yj g y (apobodies)(apobodies) •• fragmenty jsou pohlceny jinými buňkami (fragmenty jsou pohlceny jinými buňkami (in in  p yp y j g yj g y (apobodies)(apobodies) •• fragmenty jsou pohlceny jinými buňkami (fragmenty jsou pohlceny jinými buňkami (in in fragmenty jsou pohlceny jinými buňkami (fragmenty jsou pohlceny jinými buňkami (inin vivovivo)) fragmenty jsou pohlceny jinými buňkami (fragmenty jsou pohlceny jinými buňkami (inin vivovivo)) rozdíl mezi mrtvou a umírající buňkourozdíl mezi mrtvou a umírající buňkourozdíl mezi mrtvou a umírající buňkourozdíl mezi mrtvou a umírající buňkou Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 8 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 9 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 10 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 11 KATASTROFICKÁKATASTROFICKÁKATASTROFICKÁ  (NEPROGRAMOVANÁ)  ĚČ Á KATASTROFICKÁ  (NEPROGRAMOVANÁ)  ĚČ ÁBUNĚČNÁ SMRTBUNĚČNÁ SMRT NEKRÓZANEKRÓZA Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 12 Indukce nekrózy a) rozsáhlé poškození při němž už nemohou být Indukce nekrózy a) rozsáhlé poškození při němž už nemohou býta) rozsáhlé poškození, při němž už nemohou být  aktivovány mechanismy apoptózy b) působení stresových faktorů a) rozsáhlé poškození, při němž už nemohou být  aktivovány mechanismy apoptózy b) působení stresových faktorůb) působení stresových faktorů • změny koncentrace iontů, pH...  • vyčerpání zdrojů energie b) působení stresových faktorů • změny koncentrace iontů, pH...  • vyčerpání zdrojů energie• vyčerpání zdrojů energie • změny teploty • poškození buňky nebo jejích organel • vyčerpání zdrojů energie • změny teploty • poškození buňky nebo jejích organel• poškození buňky nebo jejích organel • poškození buňky nebo jejích organel  Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 13 Příznaky a průběh nekrózy:Příznaky a průběh nekrózy:Příznaky a průběh nekrózy: • poškození mitochondriální membrány iká í i ů C 2+ d i h d ií Příznaky a průběh nekrózy: • poškození mitochondriální membrány iká í i ů C 2+ d i h d ií• pronikání iontů Ca2+ do mitochondrií • zakulacení a prasknutí mitochondrií t át l t t i tů • pronikání iontů Ca2+ do mitochondrií • zakulacení a prasknutí mitochondrií t át l t t i tů• ztráta regulace transportu iontů • zakulacení buňky (swelling) • lýze buňky • ztráta regulace transportu iontů • zakulacení buňky (swelling) • lýze buňky• lýze buňky • vznik nekrotického ložiska • invaze makrofágů • lýze buňky • vznik nekrotického ložiska • invaze makrofágů• invaze makrofágů  • zánětlivá reakce • invaze makrofágů  • zánětlivá reakce Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 14 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 15 nekrotické ložisko ve tkáninekrotické ložisko ve tkáni Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 16 FYZIOLOGICKÁ  ( Á) FYZIOLOGICKÁ  ( Á)(PROGRAMOVANÁ)  BUNĚČNÁ SMRT (PROGRAMOVANÁ)  BUNĚČNÁ SMRTBUNĚČNÁ SMRTBUNĚČNÁ SMRT Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 17 PROGRAMOVANÁ BUNĚČNÁ SMRT ( d ll h ) PROGRAMOVANÁ BUNĚČNÁ SMRT ( d ll h )(Programmed Cell Death, PCD) • indukovaný regulovaný a selektivní (Programmed Cell Death, PCD) • indukovaný regulovaný a selektivní• indukovaný, regulovaný a selektivní  proces pro vyřazování určitých buněk • indukovaný, regulovaný a selektivní  proces pro vyřazování určitých buněk Apoptóza (apoptosis, type I PCD) • kaspázy Apoptóza (apoptosis, type I PCD) • kaspázy • kalpainy, katepsiny, granzymy  Autofagie (autophagy type II PCD) • kalpainy, katepsiny, granzymy  Autofagie (autophagy type II PCD)Autofagie (autophagy, type II PCD) • autofagozomy/autolysozomy (lysozomální proteázy) Autofagie (autophagy, type II PCD) • autofagozomy/autolysozomy (lysozomální proteázy) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. (lysozomální proteázy)(lysozomální proteázy) 18 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 19 AUTOFAGIE (PCDII)AUTOFAGIE (PCDII)AUTOFAGIE (PCDII)AUTOFAGIE (PCDII) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 20 Průběh autofagie 1 indukce (starvace) Průběh autofagie 1 indukce (starvace)1. indukce (starvace) 2. vytvoření autofagosomu (nejasný původ, ER?) 3. vazba a fúze s lysosomem 1. indukce (starvace) 2. vytvoření autofagosomu (nejasný původ, ER?) 3. vazba a fúze s lysosomemy 4. rozpad autolysosomálního veziklu • účast savčích homologů genů Atg (kvasinky) y 4. rozpad autolysosomálního veziklu • účast savčích homologů genů Atg (kvasinky)účast savčích homologů genů Atg (kvasinky) Typy autofagie: účast savčích homologů genů Atg (kvasinky) Typy autofagie: • mikroautofagie (transfer do lysosomu přímou  invaginací) k t f i ( ik t f ) • mikroautofagie (transfer do lysosomu přímou  invaginací) k t f i ( ik t f )• makroautofagie (vznik autofagosomu) • chaperon‐mediated autofagie (CMA) ‐ selektivní • makroautofagie (vznik autofagosomu) • chaperon‐mediated autofagie (CMA) ‐ selektivní Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 21 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 22 fú autofagozom fúze  s lysozomem vznik autofagozomuautofagozomu autolysozom Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 23 mitochondrie v autofagosomumitochondrie v autofagosomu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. mitochondrie v autofagosomumitochondrie v autofagosomu 24 APOPTÓZA (PCDI)APOPTÓZA (PCDI)APOPTÓZA (PCDI)APOPTÓZA (PCDI) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 25 Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H., Currie, A.R. Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide ranging  Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H., Currie, A.R. Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide ranging  implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer (1972) 26, 239. implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer (1972) 26, 239. Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 26 2002 ‐ Nobelova cena za fyziologii a lékařství:2002 ‐ Nobelova cena za fyziologii a lékařství: h lh lSydney BrennerSydney Brenner John E. SulstonJohn E. Sulston H. Robert HorvitzH. Robert Horvitz za výzkum genetické regulace vývoje orgánů a  programované buněčné smrti za výzkum genetické regulace vývoje orgánů a  programované buněčné smrti Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. programované buněčné smrtiprogramované buněčné smrti 27 Caenorhabditis elegansCaenorhabditis elegans • 959 somatických buněk = dospělý hermafrodit,  navíc 131 podléhá apoptóze l ó ů d • 959 somatických buněk = dospělý hermafrodit,  navíc 131 podléhá apoptóze l ó ů d• regulace apoptózy ‐ 14 genů Ced: Ced‐3, Ced‐4 ‐ indukce Ced‐9 ‐ represe • regulace apoptózy ‐ 14 genů Ced: Ced‐3, Ced‐4 ‐ indukce Ced‐9 ‐ represe Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. pp 28 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 29 Příčiny apoptózyPříčiny apoptózyPříčiny apoptózy 1 Apoptóza je nezbytná pro řádný vývoj organismu: Příčiny apoptózy 1 Apoptóza je nezbytná pro řádný vývoj organismu:1. Apoptóza je nezbytná pro řádný vývoj organismu: • resorpce ocásku během metamorfózy pulce v žábu 1. Apoptóza je nezbytná pro řádný vývoj organismu: • resorpce ocásku během metamorfózy pulce v žábu • odstranění tkáně mezi prsty během embryogeneze d t ě í db t č ý h ů ři t ář í • odstranění tkáně mezi prsty během embryogeneze d t ě í db t č ý h ů ři t ář í• odstranění nadbytečných neuronů při vytváření  synapsí v mozku • odstranění nadbytečných neuronů při vytváření  synapsí v mozku • uvolňování endometria na počátku menstruace• uvolňování endometria na počátku menstruace Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 30 odstranění nadbytečných neuronů při  vytváření synapsí v mozkuvytváření synapsí v mozku Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 31 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 32 syndaktylie (defekt apoptózy)syndaktylie (defekt apoptózy) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. y y ( p p y)y y ( p p y) 33 Příčiny apoptózyPříčiny apoptózy 2. Apoptóza je nezbytná pro likvidaci buněk, které  předsta jí ohrožení integrit organism 2. Apoptóza je nezbytná pro likvidaci buněk, které  předsta jí ohrožení integrit organismpředstavují ohrožení integrity organismu • buňky infikované viry f kt é b ňk i it íh té představují ohrožení integrity organismu • buňky infikované viry f kt é b ňk i it íh té• efektorové buňky imunitního systému po  odeznění imunitní odpovědi • buňky s poškozením DNA • efektorové buňky imunitního systému po  odeznění imunitní odpovědi • buňky s poškozením DNAbuňky s poškozením DNA zvýšená produkce proteinu p53 (induktor apoptózy) buňky s poškozením DNA zvýšená produkce proteinu p53 (induktor apoptózy)(induktor apoptózy) • nádorově transformované buňky (induktor apoptózy) • nádorově transformované buňky Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 34 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 35 Indukce apoptózyIndukce apoptózy Odstranění pozitivního signálu ů t é f kt Odstranění pozitivního signálu ů t é f kt• růstové faktory ‐ neurony • Interleukin 2 (IL‐2) ‐ lymfocyty • růstové faktory ‐ neurony • Interleukin 2 (IL‐2) ‐ lymfocyty Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 36 Indukce apoptózyIndukce apoptózy Přij tí ti íh i álPřij tí ti íh i álPřijetí negativního signálu • zvýšení hladiny oxidačních látek v buňce Přijetí negativního signálu • zvýšení hladiny oxidačních látek v buňce • poškození DNA (volné radikály, UVR, gama záření,  chemoterapeutika) • poškození DNA (volné radikály, UVR, gama záření,  chemoterapeutika)chemoterapeutika) • molekuly (death activators), které se napojují na  chemoterapeutika) • molekuly (death activators), které se napojují na  specifické receptory (death receptors)specifické receptory (death receptors) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 37 P ůběh tóP ůběh tóPrůběh apoptózy:Průběh apoptózy: normální buňka normální buňka smršťovánísmršťování rozpad (fragmentace) rozpad (fragmentace) apoptotická tělíska apoptotická tělískabuňkabuňka (fragmentace)(fragmentace) tělíska (apo‐bodies) tělíska (apo‐bodies) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 38 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 39 Morfologické a biochemické příznaky apoptózyMorfologické a biochemické příznaky apoptózy 1. zmenšení (smrštění) buňky 2 poruchy mitochondrií a uvolnění cyt‐C 1. zmenšení (smrštění) buňky 2 poruchy mitochondrií a uvolnění cyt‐C2. poruchy mitochondrií a uvolnění cyt C 3. blebbing plazmatické membrány 4 změny v plazmatické membráně 2. poruchy mitochondrií a uvolnění cyt C 3. blebbing plazmatické membrány 4 změny v plazmatické membráně4. změny v plazmatické membráně 5. kolaps jádra (degradace chromatinu) 6 zvýšená aktivita transglutaminázy 4. změny v plazmatické membráně 5. kolaps jádra (degradace chromatinu) 6 zvýšená aktivita transglutaminázy6. zvýšená aktivita transglutaminázy 7. aktivace kaspáz, proteolytické štěpení  8 d b ňk t ti ká tělí k 6. zvýšená aktivita transglutaminázy 7. aktivace kaspáz, proteolytické štěpení  8 d b ňk t ti ká tělí k8. rozpad buňky na apoptotická tělíska 9. fagocytóza apoptotických tělísek 8. rozpad buňky na apoptotická tělíska 9. fagocytóza apoptotických tělísek Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 40 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 41 Metodické aspekty studia apoptózyMetodické aspekty studia apoptózy •• morfologické příznakymorfologické příznaky (1972)(1972) blebbingblebbing membrány, kondenzace chromatinu, kolaps jádra, membrány, kondenzace chromatinu, kolaps jádra,  •• morfologické příznakymorfologické příznaky (1972)(1972) blebbingblebbing membrány, kondenzace chromatinu, kolaps jádra, membrány, kondenzace chromatinu, kolaps jádra,  vznik vznik apoapo‐‐bodiesbodies •• fragmentace DNAfragmentace DNA (1987)(1987) f tf t l ddl dd l ř tě í h TUNELl ř tě í h TUNEL vznik vznik apoapo‐‐bodiesbodies •• fragmentace DNAfragmentace DNA (1987)(1987) f tf t l ddl dd l ř tě í h TUNELl ř tě í h TUNELfragmenty: fragmenty: ladderladder, zlomy v řetězcích: TUNEL, zlomy v řetězcích: TUNEL •• aktivace proteolytické kaskádyaktivace proteolytické kaskády (1995)(1995) produkty proteolytického štěpeníprodukty proteolytického štěpení fragmenty: fragmenty: ladderladder, zlomy v řetězcích: TUNEL, zlomy v řetězcích: TUNEL •• aktivace proteolytické kaskádyaktivace proteolytické kaskády (1995)(1995) produkty proteolytického štěpeníprodukty proteolytického štěpeníprodukty proteolytického štěpeníprodukty proteolytického štěpení •• změny plazmatické membrányzměny plazmatické membrány ((1997)1997) externalizaceexternalizace fosfatidylserinufosfatidylserinu:: annexinannexin‐‐VV produkty proteolytického štěpeníprodukty proteolytického štěpení •• změny plazmatické membrányzměny plazmatické membrány ((1997)1997) externalizaceexternalizace fosfatidylserinufosfatidylserinu:: annexinannexin‐‐VVexternalizaceexternalizace fosfatidylserinufosfatidylserinu: : annexinannexin‐‐VV •• změny mitochondriízměny mitochondrií ((1998)1998) změny permeability mitochondriální změny permeability mitochondriální  externalizaceexternalizace fosfatidylserinufosfatidylserinu: : annexinannexin‐‐VV •• změny mitochondriízměny mitochondrií ((1998)1998) změny permeability mitochondriální změny permeability mitochondriální  Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. membrány, detekce membrány, detekce CytochomuCytochomu C a AIFC a AIFmembrány, detekce membrány, detekce CytochomuCytochomu C a AIFC a AIF 42 Blebbing plazmatické membrány d d k ikál íh k l Blebbing plazmatické membrány d d k ikál íh k l• degradace kortikálního cytoskeletu (fodrin, aktin) • degradace kortikálního cytoskeletu (fodrin, aktin) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 43 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 44 Změny v plazmatické membráněZměny v plazmatické membráněZměny v plazmatické membráně • externalizace fosfatidylserinu ( t “ i l) Změny v plazmatické membráně • externalizace fosfatidylserinu ( t “ i l)(„eat me“ signal)(„eat me“ signal) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 45 Změny v plazmatické membráněZměny v plazmatické membráněZměny v plazmatické membráně • detekce fosfatidylserinu • Annexin V + fluorochrom Změny v plazmatické membráně • detekce fosfatidylserinu • Annexin V + fluorochrom• Annexin V + fluorochrom• Annexin V + fluorochrom Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 46 Změny v plazmatické membráněZměny v plazmatické membráně • detekce fosfatidylserinu – Annexinem V • flow cytometrie • detekce fosfatidylserinu – Annexinem V • flow cytometrie Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 47 Kolaps jádra (degradace chromatinu)Kolaps jádra (degradace chromatinu) • kondenzace chromatinu na periferních oblastech jádra • internukleosomální štěpení DNA ‐ žebříček (ladder) • fragmentace jádra • kondenzace chromatinu na periferních oblastech jádra • internukleosomální štěpení DNA ‐ žebříček (ladder) • fragmentace jádra• fragmentace jádra• fragmentace jádra CAD – kaspázou aktivovaná Dnáza ICAD – inhibitor CAD CAD – kaspázou aktivovaná Dnáza ICAD – inhibitor CAD Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 48 Detekce štěpení DNA:Detekce štěpení DNA: TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling TUNELTUNEL DAPIDAPIDAPIDAPI Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 49 Aktivace proteolytického štěpeníAktivace proteolytického štěpeníp y p Kaspázy p y p Kaspázy • cysteinové proteázy, štěpící na karboxyskupině kyseliny asparagové • cysteinové proteázy, štěpící na karboxyskupině kyseliny asparagové • caspases = cysteinyl‐aspartic‐acid‐proteases • 14 druhů kaspáz (u člověka): i i i č í ( ikál í 8 9 10 12) • caspases = cysteinyl‐aspartic‐acid‐proteases • 14 druhů kaspáz (u člověka): i i i č í ( ikál í 8 9 10 12)iniciační (apikální ‐ 8, 9, 10 a 12)  efektorové (exekuční ‐ 3, 6 a 7) pro inflamatorní iniciační (apikální ‐ 8, 9, 10 a 12)  efektorové (exekuční ‐ 3, 6 a 7) pro inflamatornípro‐inflamatorní  Katepsiny, kalpainy, granzymy pro‐inflamatorní  Katepsiny, kalpainy, granzymy Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. Katepsiny, kalpainy, granzymyKatepsiny, kalpainy, granzymy 50 Aktivace kaspáz, proteolytické štěpeníAktivace kaspáz, proteolytické štěpení prokaspázaprokaspáza kaspázakaspázakaspázakaspáza aktivníaktivní Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. kaspázakaspáza 51 Aktivace proteolytického štěpeníAktivace proteolytického štěpení Substráty kaspáz ‐ proteinySubstráty kaspáz ‐ proteiny • „cell death“ proteiny (Bcl‐2,Bcl‐XL, prokaspázy..) • regulátory b. cyklu (MDM2, p21, Rb, cyklin A..) k l ( k i f d i k i l i ) • „cell death“ proteiny (Bcl‐2,Bcl‐XL, prokaspázy..) • regulátory b. cyklu (MDM2, p21, Rb, cyklin A..) k l ( k i f d i k i l i )• cytoskelet (aktin, fodrin, keratiny, laminy..)  • DNA metabolismus (ICAD, PARP..) • RNA metabolismus • cytoskelet (aktin, fodrin, keratiny, laminy..)  • DNA metabolismus (ICAD, PARP..) • RNA metabolismus• RNA metabolismus • signální dráhy • transkripční faktory • RNA metabolismus • signální dráhy • transkripční faktorytranskripční faktory • proteiny spojené s neurodegenerativními chorobami transkripční faktory • proteiny spojené s neurodegenerativními chorobami Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 52 Aktivace kaspáz – fluorescenční mikroskopieAktivace kaspáz – fluorescenční mikroskopie a‐tubulin / DAPIa‐tubulin / DAPI aktivovaná kaspáza 3aktivovaná kaspáza 3 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. pp 53 Aktivace kaspáz – detekce (WB)Aktivace kaspáz – detekce (WB) Kaspáza‐3 Lamin A Poly (ADP‐ribose) polymeraseLamin A                         Poly (ADP‐ribose) polymerase    Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 54 Rozpad buňky na apoptotická tělískaRozpad buňky na apoptotická tělíska • účast nově formované aktinové 3D struktury a  nesvalového myosinu • apoptotická tělíska obsahují zbytky jádra • účast nově formované aktinové 3D struktury a  nesvalového myosinu • apoptotická tělíska obsahují zbytky jádra• apoptotická tělíska obsahují zbytky jádra,  organely a části cytoplazmy • apoptotická tělíska obsahují zbytky jádra,  organely a části cytoplazmy Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 55 Fagocytóza apoptotických tělísek hl í i ký h ělí k k l í i b ňk i Fagocytóza apoptotických tělísek hl í i ký h ělí k k l í i b ňk i• pohlcení apoptotických tělísek okolními buňkami (makrofágy, dendritické buňky) • pohlcení apoptotických tělísek okolními buňkami (makrofágy, dendritické buňky) • fagocytující buňky vylučují cytokiny, které  zabraňují zánětu ve tkáni • fagocytující buňky vylučují cytokiny, které  zabraňují zánětu ve tkáni Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 56 Apoptóza vyvolaná vnitřními signály: • zdravá buňka exprimuje na vnější membráně mitochondrií BCL‐2 Apoptóza vyvolaná vnitřními signály: • zdravá buňka exprimuje na vnější membráně mitochondrií BCL‐2p j j ‐ BCL‐2 inhibuje oligomerizaci BAK a BAX • při vnitřním poškození buňky (poškození DNA, ↑c Ca2+...) p j j ‐ BCL‐2 inhibuje oligomerizaci BAK a BAX • při vnitřním poškození buňky (poškození DNA, ↑c Ca2+...) ‐ permeabilizace vnější membrány (póry z BAK, BAX proteinů)  ‐ uvolnění cytochromu‐c do cytoplasmy ‐ permeabilizace vnější membrány (póry z BAK, BAX proteinů)  ‐ uvolnění cytochromu‐c do cytoplasmy • vzniká apoptosom:   APAF‐1 • vzniká apoptosom:   APAF‐1 Cytochrom C prokaspáza 9 (dATP) Cytochrom C prokaspáza 9 (dATP)(dATP) • vzniká aktivní kaspáza 9 (iniciační), která štěpením aktivuje další  k á ( f k é) (dATP) • vzniká aktivní kaspáza 9 (iniciační), která štěpením aktivuje další  k á ( f k é) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. kaspázy (efektorové) kaspázy (efektorové)  57 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 58 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 59 Změny mitochondriíZměny mitochondrií změna permeability změna permeability  mitochondriální mitochondriální  b áb ámembrány membrány  detekce  detekce  cytochomucytochomu‐‐CC ‐‐ fl. mikroskopiefl. mikroskopie ‐‐ flowflow‐‐cytometriecytometrieflowflow cytometrie cytometrie  Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 60 Apoptóza vyvolaná vnitřními signály,  nezávislá na kaspázách  Apoptóza vyvolaná vnitřními signály,  nezávislá na kaspázách  • probíhá i při aplikaci inhibitorů  kaspáz • probíhá i při aplikaci inhibitorů  kaspáz • průběh smrti je delší• průběh smrti je delší • ztráta mitochondriálního transmembránového potenciálu  • ztráta mitochondriálního transmembránového potenciálu  • inhibice respiračního řetězce • štěpení DNA pomocí AIF a ENDOG ( • inhibice respiračního řetězce • štěpení DNA pomocí AIF a ENDOG ((apoptosis inducing factor,  endonukleáza G) (apoptosis inducing factor,  endonukleáza G) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 61 Apoptóza vyvolaná vnějšími signály:Apoptóza vyvolaná vnějšími signály:Apoptóza vyvolaná vnějšími signály: • aktivační molekuly (death activators) se napojují na specifické  receptory v plazmatické membráně (death receptors, DR1‐5): Apoptóza vyvolaná vnějšími signály: • aktivační molekuly (death activators) se napojují na specifické  receptory v plazmatické membráně (death receptors, DR1‐5):p y p ( p , ) Tumor necrosis factor  (TNF‐) ‐ TNF receptor Lymphotoxin (TNF‐) ‐ TNF receptor p y p ( p , ) Tumor necrosis factor  (TNF‐) ‐ TNF receptor Lymphotoxin (TNF‐) ‐ TNF receptory p ( ) p Fas‐ligand (FasL) ‐ Fas receptor (CD95) • přenos signálu do cytoplasmy aktivuje prokaspázu‐8 (‐10)  y p ( ) p Fas‐ligand (FasL) ‐ Fas receptor (CD95) • přenos signálu do cytoplasmy aktivuje prokaspázu‐8 (‐10)  (iniciační kapázy)  • aktivovaná kaspáza‐8 (‐10) štěpením dalších prokaspáz spouští  (iniciační kapázy)  • aktivovaná kaspáza‐8 (‐10) štěpením dalších prokaspáz spouští  proteolytickou kaskáduproteolytickou kaskádu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 62 DISC death‐inducing  signaling complex • ligand  • receptorreceptor • adaptorové proteiny • prokaspáza‐8 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 63 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 64 Apoptóza vyvolaná vnějšími signály: dependence receptotors (např. DCC) • rozdílná signalizace:  ři á é li d > ř ží á í b ňk• při navázaném ligandu ‐>přežívání buňky • po uvolnění ligandu ‐> aktivace kaspázové kaskády Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 65 Současné rozdělení  regulované buněčné smrti Současné rozdělení  regulované buněčné smrtiregulované buněčné smrti  a) autofagická buněčná smrt b) apoptóza vyvolaná vnitřními signály, závislá na kaspázách regulované buněčné smrti  a) autofagická buněčná smrt b) apoptóza vyvolaná vnitřními signály, závislá na kaspázáchb) apoptóza vyvolaná vnitřními signály, závislá na kaspázách c) apoptóza vyvolaná vnitřními signály, nezávislá na kaspázách d) apoptóza vyvolaná vnějšími signály, aktivací death receptors e) apoptóza vyvolaná vnějšími signály, (de)aktivací dependence receptors b) apoptóza vyvolaná vnitřními signály, závislá na kaspázách c) apoptóza vyvolaná vnitřními signály, nezávislá na kaspázách d) apoptóza vyvolaná vnějšími signály, aktivací death receptors e) apoptóza vyvolaná vnějšími signály, (de)aktivací dependence receptors) p p y j g y, ( ) p p f) anoikis – smrt způsobená ztrátou kontaktu k podkladu nebo okolním buňkám  (mechanismus vnitřní apoptózy) ) p p y j g y, ( ) p p f) anoikis – smrt způsobená ztrátou kontaktu k podkladu nebo okolním buňkám  (mechanismus vnitřní apoptózy) g) cornification (keratinizace) ‐ terminální diferenciace epidermálních buněk,  vznik vrstvy mrtvých keratinocytů (=stratum corneum) g) cornification (keratinizace) ‐ terminální diferenciace epidermálních buněk,  vznik vrstvy mrtvých keratinocytů (=stratum corneum) h) entosis (buněčný kanibalismus) – pohlcení buňky stejným typem (ne  fagocytem), postupná degradace ve fagozomu h) entosis (buněčný kanibalismus) – pohlcení buňky stejným typem (ne  fagocytem), postupná degradace ve fagozomu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 66 cornification entosis Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407013943 67 Současné rozdělení  l é b ěč é ti Současné rozdělení  l é b ěč é tiregulované buněčné smrti  i) mitotická katastrofa – iniciace navození smrti v M‐fázi buněčného cyklu vlivem  poškození mitotického aparátu regulované buněčné smrti  i) mitotická katastrofa – iniciace navození smrti v M‐fázi buněčného cyklu vlivem  poškození mitotického aparátupoškození mitotického aparátupoškození mitotického aparátu j) necroptosis (regulovaná nekróza) – smrt vyvolána aktivací death receptorů při  současné inaktivaci kaspáz (8,10) j) necroptosis (regulovaná nekróza) – smrt vyvolána aktivací death receptorů při  současné inaktivaci kaspáz (8,10) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 68 k) netosis – odvozeno od NET (Neutrophil Extracelular Trap) = mikrobicidní  struktura složená z chromatinu, histonů a antimikrobiálních proteinů  produkovaná granulocytyp odu o a á g a u ocyty smrt specifická pro granulocyty, nezávislá na kaspázách; silná vakuolizace  cytoplazmy, dekondenzace chromatinu, rozpad membrány jádra a granulí – podobnosti s autofagií a regulovanou nekrózou l) parthanatos – při nadměrné aktivaci PARP (poly ADP‐riboza polymeráza),  tvorba PAR, následná degradace chromatinu; popsánu u mrtvice, diabetu a  neurodegenerativních chorobneurodegenerativních chorob  m) pyroptosis – původně popsáno u makrofágů po infekci (S. tiphymurium),  typickým příznakem aktivace kaspázy‐1‐>aktivace pyrogenního IL‐1 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 69 Apoptóza a nádory Chemo‐ a radio‐ terapií indukovaná buněčná smrt strategie:  • zabránit neregulovanému buněčnému dělení nádorovýchzabránit neregulovanému buněčnému dělení nádorových  buněk • ovlivnění buněčného cyklu a DNA syntézy u rychle se dělících  b ěkbuněk ‐ antimetabolity ‐ genotoxické látky způsobují apoptózu  ‐ mitotické inhibitory • defekty v apo dráhách negativně ovlivňují léčbu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. defekty v apo dráhách negativně ovlivňují léčbu 70 Chemo‐ a radio‐ terapií  d k á b ěč á lindukovaná buněčná smrt ‐ signalizace • indukce poškození DNA – (DNA damage signal)  • přenos z DNA vazebných proteinů na kinázy PI3K rodiny (ATM,  ATR) ‐ funkce v kontrolních uzlech  • fosforylují efektorové kinázy (Chk1, Chk2 a c‐Abl) • fosforylace TF ‐ p53, p73, E2F.. • zvýšení exprese genů – skupiny reparace DNA, zástavazvýšení exprese genů  skupiny reparace DNA, zástava  buněčného cyklu a apoptóza Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 71 Vztah p53 a apoptózy p p p y • aktivuje mitochondriální apopotickou dráhu upregulace proapoptotických genů (Bax Bid Noxa Puma)‐ upregulace proapoptotických genů (Bax, Bid, Noxa, Puma) ‐ downregulace antiapoptotických genů (Bcl‐2, Mcl‐1)  • aktivuje receptorovou apoptotickou dráhu upregulace death receptorů (Fas, DR4, DR5) • nezávisle na transkripci   translokace p53 do mitochondrií a vazba na Bcl‐2 a Bcl‐XL Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 72 Apoptóza a nádoryApoptóza a nádory Inhibice apoptózy nádorových buněk  bez účasti virů: Inhibice apoptózy nádorových buněk  bez účasti virů: • narušení apoptózy aktivované receptory u nádorových buněk (např.) a) nedostatečná aktivita inicičních kaspáz (8,10) – z důvodu metylace  promotoru delece nebo mutace genu pro kaspázu‐8 (neuroblastom plicní • narušení apoptózy aktivované receptory u nádorových buněk (např.) a) nedostatečná aktivita inicičních kaspáz (8,10) – z důvodu metylace  promotoru delece nebo mutace genu pro kaspázu‐8 (neuroblastom plicnípromotoru, delece nebo mutace genu pro kaspázu 8 (neuroblastom, plicní  karcinom, Ewingův sarkom, melanomy) b)  sekrece „decoy“ molekuly, která se váže na FasL a brání její vazbě na FasR  (nádory plic a střeva) promotoru, delece nebo mutace genu pro kaspázu 8 (neuroblastom, plicní  karcinom, Ewingův sarkom, melanomy) b)  sekrece „decoy“ molekuly, která se váže na FasL a brání její vazbě na FasR  (nádory plic a střeva)( y p ) c)  sekrece FasL nádorovými buňkami indukuje apoptózu cytotoxických  lymfocytů ( y p ) c)  sekrece FasL nádorovými buňkami indukuje apoptózu cytotoxických  lymfocytů • narušení apoptózy spouštěné mitochondriemi u nádorových buněk (např.) a)  delece a/nebo metylace genu pro Apaf‐1 (melanom) b)  nedostatečná aktivita iniciční kaspázy 9 (nádory ovaria) ) B l 2 dů d t l k (l ké i ) • narušení apoptózy spouštěné mitochondriemi u nádorových buněk (např.) a)  delece a/nebo metylace genu pro Apaf‐1 (melanom) b)  nedostatečná aktivita iniciční kaspázy 9 (nádory ovaria) ) B l 2 dů d t l k (l ké i ) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. c)  overexprese Bcl‐2 z důvodu translokace (leukémie)c)  overexprese Bcl‐2 z důvodu translokace (leukémie) 73 Apoptóza a nádoryApoptóza a nádory Viry, inhibující apoptózu transformovaných buněk:Viry, inhibující apoptózu transformovaných buněk: tvorba proteinů blokujících apoptózu na různých úrovních • receptorová apoptóza tvorba proteinů blokujících apoptózu na různých úrovních • receptorová apoptóza • mitochondriální apoptóza • p53 • podpora proliferačních signálních drah • mitochondriální apoptóza • p53 • podpora proliferačních signálních drahp p p g • Human papilloma virus (HPV): exprese proteinu E6 ‐ inaktivátor proteinu p53  p p p g • Human papilloma virus (HPV): exprese proteinu E6 ‐ inaktivátor proteinu p53 p p p p • Epstein‐Barrové virus (EBV): produkuje protein, podobný proteinu Bcl‐2 p p p p • Epstein‐Barrové virus (EBV): produkuje protein, podobný proteinu Bcl‐2 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 74 When Cells Die II: R. A. Lockshin, Z. Zakeri Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 75 Apoptóza a imunitní systémApoptóza a imunitní systém • nutnost odstranění aktivovaných lymfocytů • produkují protilátky a cytokiny, jsou cytotoxické • nutnost odstranění aktivovaných lymfocytů • produkují protilátky a cytokiny, jsou cytotoxicképrodukují protilátky a cytokiny, jsou cytotoxické Regulace apoptózy produkují protilátky a cytokiny, jsou cytotoxické Regulace apoptózy • omezení růstových faktorů (IL‐2) pro T buňky reagující na vnější a přechodné antigeny • omezení růstových faktorů (IL‐2) pro T buňky reagující na vnější a přechodné antigenypro T buňky reagující na vnější  a přechodné antigeny • pomocí „death“ molekul (Fas ligand)  pro T buňky reagující na vnitřní a trvalé antigeny pro T buňky reagující na vnější  a přechodné antigeny • pomocí „death“ molekul (Fas ligand)  pro T buňky reagující na vnitřní a trvalé antigenypro T buňky reagující na vnitřní a trvalé antigenypro T buňky reagující na vnitřní a trvalé antigeny Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 76 Apoptóza a imunitní systémApoptóza a imunitní systém defekty v indukci apoptózy a autoimunitní chorobydefekty v indukci apoptózy a autoimunitní choroby • neschopnost navození apoptózy a přežívání auto‐ reaktivních lymfocytů • neschopnost navození apoptózy a přežívání auto‐ reaktivních lymfocytů ‐ mutace ve Fas receptoru (CD95) nebo Fas ligandu  –> lymfadenopatie (zvětšení uzlin), akumulace  ‐ mutace ve Fas receptoru (CD95) nebo Fas ligandu  –> lymfadenopatie (zvětšení uzlin), akumulace y p ( ), lymfocytů  y p ( ), lymfocytů  • účast „death“ receptorů a ligandů v poškození okolní  tkáně místo lymfocytů • účast „death“ receptorů a ligandů v poškození okolní  tkáně místo lymfocytů Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 77 Defekty v indukci apoptózy a autoimunitní chorobyDefekty v indukci apoptózy a autoimunitní choroby systémový lupus erythematodes (SLE),  lupenka,  revmatoidní artritida,  systémový lupus erythematodes (SLE),  lupenka,  revmatoidní artritida,  Hashimotovo struma…Hashimotovo struma… systémový lupus   erythematodes  ‐ častěji u žen (90%) ýl ý é bl č‐ motýlový erytém na obličeji ‐ artritida ‐ zánět ledvin d k í if ii‐ nedokrvení periferii Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 78 Autoimunitní choroby: systémový lupus erythematodesAutoimunitní choroby: systémový lupus erythematodes  porucha funkce makrofágů  porucha funkce makrofágů   vznik sekundární nekrózy   uvolnění prozánětlivých látek  t í t ti ů  vznik sekundární nekrózy   uvolnění prozánětlivých látek  t í t ti ů vystavení autoantigenů  zánět   vystavení autoantigenů  zánět  Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 79 Apoptóza a imunitní systémApoptóza a imunitní systém AIDS: pokles CD4+ T‐lymfocytů AIDS: pokles CD4+ T‐lymfocytů • pouze část infikována HIV, většina umírá apoptózou • infikované buňky produkují virové proteiny  • pouze část infikována HIV, většina umírá apoptózou • infikované buňky produkují virové proteiny  (Tat, gp120, Nef, Vpu), • blokují Bcl‐2, aktivují pro‐kaspázu 8 (Tat, gp120, Nef, Vpu), • blokují Bcl‐2, aktivují pro‐kaspázu 8 • změny v expresi cytokinů (↑ IL‐4, IL‐10; ↓ IL‐12, INF‐γ) • viry a jejich proteiny v extracelulární prostoru aktivují  • změny v expresi cytokinů (↑ IL‐4, IL‐10; ↓ IL‐12, INF‐γ) • viry a jejich proteiny v extracelulární prostoru aktivují y j j p y p j apoptózu v okolních lymfocytech y j j p y p j apoptózu v okolních lymfocytech Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 80 Apoptóza a degenerativní onemocněníApoptóza a degenerativní onemocnění Alzheimerova choroba Parkinsonova choroba Alzheimerova choroba Parkinsonova choroba Huntingtonova chorobaHuntingtonova choroba nejasné mechanismy indukce apoptózy: • volné radikály nejasné mechanismy indukce apoptózy: • volné radikály• volné radikály • nedostatečná hladina nervových růstových faktorů • vysoká hladina neurotransmiterů • volné radikály • nedostatečná hladina nervových růstových faktorů • vysoká hladina neurotransmiterůy • vnitrobuněčná akumulace toxických proteinů y • vnitrobuněčná akumulace toxických proteinů Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2. 81 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 02 / 27.2.