Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Lékařsky asistovaná reprodukce Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie – 27.3.2013 doc. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 • neplodnost a její příčiny • lékařsky asistovaná reprodukce historický vývoj základní rozdělení a přehled metod IVF a její modifikace • in vitro fertilizace historický vývoj standardní průběh IVF modifikace IVF • klonování člověka klonování pro výzkumné účely / terapeutické klonování reprodukční klonování Program přednášky: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 NEPLODNOST A JEJÍ PŘÍČINY Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 NEPLODNOST: • snížená nebo chybějící schopnost zplodit potomka (NE kompletní neschopnost mít děti, NE sterilita) • po uplynutí 1 roku při nechráněném pravidelném styku nedošlo k otěhotnění • celosvětové statistiky WHO: 5 - 15 % párů: neschopnost počít dítě 10 - 25 % párů: neschopnost počít druhé nebo další dítě (tzv. sekundární infertilita) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Kategorie neplodnosti dle WHO Primární neplodnost = naprostá absence početí i přes pravidelný nechráněný pohlavní styk po dobu jednoho roku Sekundární neplodnost = i přes pravidelný nechráněný pohlavní styk po dobu jednoho roku nedošlo k žádnému novému početí poté, co v minulosti k oplodnění došlo Pravidelné spontánní potraty / kojenecká úmrtnost = úmrtnost živě narozených dětí před dosažením pátého roku života "Neobjasněná neplodnost" = absence početí způsobená faktory jako laktace, antikoncepce, snížená sexuální aktivita nebo z neznámých příčin Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Příčiny neplodnosti: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Příčiny neplodnosti: • ženská neplodnost poškození vejcovodů, hormonální poruchy ( produkce oocytů), vrozené vývojové vady dělohy, endometrióza, genetické či imunologické faktory neplodnosti (rejekce spermatu), problémy s nidací • mužská neplodnost nízká kvalita spermatu, autoimunitní problémy, aktuální zdravotní stav, urogenitální infekce, poškození chámovodů, koitální problémy • další příčiny neplodnosti vyšší věk při početí, stres, užívání drog a léků, kuřáctví, alkoholismus, vliv životního prostředí Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Posun věkových kategorií u žen (1983-2003): Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Pravděpodobnost početí a neplodnosti u žen dle věkových kategorií: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Základní vyšetření při neplodnosti: • Základní gynekologické vyšetření rodinná, osobní a gynekologická anamnéza, křivka bazálních teplot, mikroabrase endometria, mikrobiální obraz poševní, onkologická cytologie, kolposkopie, případně rentgenové vyšetření dělohy • Specializované vyšetření laboratorní hormonální screening, vaginální ultrazvuk, vyšetření spermiogramu, případně komplexní diagnostická laparoskopie a hysteroskopie, genetické, imunologické či urologické vyšetření Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 LÉKAŘSKY ASISTOVANÁ REPRODUKCE Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 • chirurgické zákroky • farmakoteparie (např. hormonální léčba) • umělé oplodnění (artificial insemination, AI) oplodnění v organismu ženy • oplodnění ve zkumavce (in vitro fertilization, IVF) oplodnění mimo organismus ženy ASISTOVANÁ REPRODUKCE = jakýkoli medicínský zásah, který napomáhá lidskému rozmnožování Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 • umělé oplodnění (artificial insemination, AI) IUI, GIFT • oplodnění ve zkumavce (in vitro fertilization, IVF) IVF-ET , IVF-KET , ZIFT AH MESA , TESE PZD, SUZI ICSI , ROSNI Asistovaná reprodukce (AR) zahrnující manipulace s gametami, příp. s embryi: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 AR homologní, heterologní: • intrauterinní inseminace (IUI) • intrafallopiánní transfer gamet (GIFT) • in vitro fertilizace (IVF)  chirurgický odběr spermií z nadvarlete (MESA) nebo varlete (TESE)  subzonální inzerce spermií (SUZI)  parciální disekce zony pellucidy (PZD)  injekce kulatého jádra spermatidy (ROSNI)  intracytoplazmatická injekce spermií (ICSI)  přenos embryí po rozmražení (KET)  intrafallopiánní transfer zygoty (ZIFT)  asistovaný hatching (AH) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Intrauterinní inseminace (IUI) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Intrafallopiánní transfer gamet (GIFT) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Historický vývoj metod umělého oplodnění - IUI: • experimenty probíhaly převážně v utajení (zásahy do reprodukce byly považovány za ostudné a nepřirozené) • 1790 – Londýn (1866 – New York): první provedení homologní IUI • 1884 – Philadelphia: první provedení heterologní IUI (zveřejněno 1909) • 1953: první úspěšná IUI s využitím kryokonzervovaného spermatu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 IN VITRO FERTILIZACE (IVF) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Historický vývoj metod IVF: • 1944 – první provedení IVF s lidskými gametami • 1978 – narození prvního dítěte počatého metodou IVF • 1982 – první dvojčata po IVF • 1983 – narozeno první dítě po zamražení embrya • 1985 – první případ náhradního mateřství • 1988 – poprvé provedena preimplantační genetická diagnostika • 1990 – poprvé použita metoda ICSI • 1997 – první dítě ze zamraženého oocytu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 1978 - Louise Brown (Velká Británie) Československo: 1982 - GIFT 1983 - IVF Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 2010 – Nobelova cena za fyziologii a lékařství: • Sir Robert G. Edwards "for the development of in vitro fertilization” Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Nárůst výkonů IVF v letech 1985-1998: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Základní schéma IVF Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Příklad protokolu hormonální stimulace Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Odběr oocytů po hyperovulaci Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Prodloužená kultivace embryí (5 dní) IVF / ICSI ET Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Asistovaný hatching (AH) • metody narušení ZP (>15µm):  mechanicky (mikrojehla)  chemicky (enzymy)  laser Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Asistovaný hatching (AH) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Indikace k AH: • věk pacientky nad 35 let • opakované nedosažení těhotenství po transferu kvalitních embryí • zvýšená hodnota FSH u pacientky • zjištění silnějšího obalu embrya • na žádost pacientky Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Intracytoplazmatická injekce spermií (ICSI) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Indikace k ICSI: • selhání oplození vajíček v předchozích cyklech • nízká koncentrace a pohyblivost spermií • získání spermií chirurgickým odběrem z varlete nebo nadvarlete (= MESA/TESE) • potřeba provedení preimplantační genetické diagnostiky (PGD) • na žádost pacientky Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Metody pro léčbu poruch pohyblivosti spermií mikromanipulační metody Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Transfer embryí = ET (příp. KET) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Preimplantační genetická diagnostika (PGD, PID) Metody: • biopsie (blastomer, blastocysty, polárního tělíska) • genetické testy • eliminace embryí se specifikovanou vadou PID se provádí obvykle v kombinaci s ICSI Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Biopsie pólocytu pro účely PID Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Indikace k PID: • vrozená chromozomální aberace u některého z rodičů • vyšší věk ženy, nebo obou rodičů • porod dítěte s vrozenou vývojovou vadou v rodině • opakované spontánní potraty nejasné etiologie • opakovaná zástava vývoje embryí na prodloužené kultivaci • cytogenetika: 13, 18, 21, X, Y • molekulární genetika: dle indikace / diagnózy Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Rizika spojená s IVF: Pro ženu: • ovariální hyperstimulační syndrom (OHSS), vícečetné gravidity • torze vaječníků, mimoděložní gravidita, preeklampsie, SC, psychické problémy • dlouhodobé riziko nádorových onemocnění ??? Pro dítě: • předčasný porod – (extrémně) nízká porodní váha • riziko nádorových onemocnění ??? Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 KLONOVÁNÍ ČLOVĚKA Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Reprodukční klonování (Reproductive Cloning): • přenos embrya, vzniklého metodou SCNT, do dělohy ženy, následné těhotenství a narození dítěte Terapeutické klonování (Research Cloning): • embryo, vzniklé metodou SCNT, udržováno v podmínkách in vitro • výzkum (genetická kontrola diferenciace) • izolace ESCs a indukovaná diferenciace (buněčná terapie bez problémů s imunokompatibilitou) Tvorba cybridů Klonování člověka Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 2001: Cibelli et al. (Advanced Cell Technology) • 19 rekonstruovaných embryí metodou SCNT: 3 embrya schopna buněčného dělení (max. 6 buněk) • 22 oocytů aktivováno partenogeneticky: 6 embryí se dělilo až do stádia blastocysty Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Hwang WS et al.: Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science 303, 1669-1674, 2004 • ES morfologie, normální karyotyp • embryonální markery • schopnost diferenciace in vitro • 70 pasáží in vitro Hwang WS et al.: Patient-specific embryonic stem cells derived from human SCNT blastocyst. Science 308, 1777-1783, 2005 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 2005 - terapeutické klonování člověka povoleno ve Velké Británii (pro výzkumné účely) 2006 - první úspěšné provedení SCNT na lidských buňkách (UK) 2008 - "hybridní" embryo (cybrid): enukleovaný oocyt živočišného původu, jádro lidské somatické buňky) 2003: Čína Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 ??? 2006 - Zavos and Illmense: • 3 "rekonstruovaná" lidská embrya (SCNT), z toho 1 se vyvíjelo do 4buněčného stádia • následná implantace do dělohy příjemkyni – gravidita se nepotvrdila http://www.zavos.org/library/UAAN_A_150346.pdf Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 2009 - Karim Nayernia • "umělá spermie" • neplodný muž • jádro somatické buňky • SCNT • blastocysta • odběr hESCs • diferenciace do fenotypu spermií Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2013