1
Bi8120 A lik á b ěč á bi l iBi8120 A lik á b ěč á bi l iBi8120 Aplikovaná buněčná biologieBi8120 Aplikovaná buněčná biologie
EMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKYEMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKYEMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKYEMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKY
RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MUÚstav experimentální biologie PřF MUÚstav experimentální biologie PřF MU
2
Program přednášky:Program přednášky:Program přednášky:Program přednášky:
• vlastnosti kmenových buněk• vlastnosti kmenových buněk
• embryonální kmenové buňky
li i k ý h b ěk d í ká h i it
• embryonální kmenové buňky
li i k ý h b ěk d í ká h i it• linie kmenových buněk v podmínkách in vitro 
• indukované pluripotentní buňky
• linie kmenových buněk v podmínkách in vitro 
• indukované pluripotentní buňkyp p yp p y
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
3
Totipotence
• nelimitovaný diferenciační potenciál
Totipotence
• nelimitovaný diferenciační potenciál• nelimitovaný diferenciační potenciál
• schopnost tvořit embryonální i extraembryonální 
tkáně
• nelimitovaný diferenciační potenciál
• schopnost tvořit embryonální i extraembryonální 
tkáně
• časná stádia rýhování zygoty
Pluripotence
• časná stádia rýhování zygoty
Pluripotenceu pote ce
• schopnost tvořit buňky všech 3 zárodečných listů
• buňky ICM (embryonální kmenové buňky)
u pote ce
• schopnost tvořit buňky všech 3 zárodečných listů
• buňky ICM (embryonální kmenové buňky)
Multipotence
• schopnost tvořit buňky příslušného typu tkáně
Multipotence
• schopnost tvořit buňky příslušného typu tkáněp y p yp
• např. hematopoetické kmenové buňky, neuronální 
kmenové buňky…
p y p yp
• např. hematopoetické kmenové buňky, neuronální 
kmenové buňky…
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
4
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
5
VLASTNOSTI KMENOVÝCH BUNĚKVLASTNOSTI KMENOVÝCH BUNĚKVLASTNOSTI KMENOVÝCH BUNĚKVLASTNOSTI KMENOVÝCH BUNĚK
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
6
Kmenové buňky (Stem Cells, SCs)Kmenové buňky (Stem Cells, SCs)
= buňky z embrya, fetu nebo dospělého organismu, 
které se za určitých podmínek mohou 
neomezeně množit a rovněž dávat vzniknout
= buňky z embrya, fetu nebo dospělého organismu, 
které se za určitých podmínek mohou 
neomezeně množit a rovněž dávat vzniknoutneomezeně množit a rovněž dávat vzniknout
specializovaným buňkám různých typů tkání 
d j k ý h b ěk
neomezeně množit a rovněž dávat vzniknout
specializovaným buňkám různých typů tkání 
d j k ý h b ěk• zdroje kmenových buněk:
embryo, fetus, dospělý organismus
• zdroje kmenových buněk:
embryo, fetus, dospělý organismus
[+ placenta, pupečníková krev][+ placenta, pupečníková krev]
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
7
TERMINOLOGIE:TERMINOLOGIE:T RMINO OGI :
• embryonální SCs (ESCs):
b ál í k é ( b ll )
T RMINO OGI :
• embryonální SCs (ESCs):
b ál í k é ( b ll )• embryonální kmenové (Embryonic Stem Cells)
• embryonální zárodečné (Embryonic Germ Cells)
• embryonální karcinomové (Embryonic Carcinoma)
• embryonální kmenové (Embryonic Stem Cells)
• embryonální zárodečné (Embryonic Germ Cells)
• embryonální karcinomové (Embryonic Carcinoma)• embryonální karcinomové (Embryonic Carcinoma)
• linie embryonálních kmenových buněk
• embryonální karcinomové (Embryonic Carcinoma)
• linie embryonálních kmenových buněk
• dospělé (adultní) SCs (ASCs)• dospělé (adultní) SCs (ASCs)
• kmenové buňky nádorů (Cancer SCs, CSCs)• kmenové buňky nádorů (Cancer SCs, CSCs)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
8
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
9
StemnessStemness
• sebeobnova
• diferenciace
• sebeobnova
• diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
10
Sebeobnova (self‐renewal)
SC h dělit ě“ dl h d bSCs se mohou dělit po „neomezeně“ dlouhou dobu, 
narozdíl od ostatních buněk organismu
Diferenciace
SCs jsou nespecializované buňky, postupnou diferenciací 
vznikají specializované typy buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
11
Plasticita (Transdiferenciace)
h t d lt í h SC čitéh á b tká ě
Plasticita (Transdiferenciace)
h t d lt í h SC čitéh á b tká ěschopnost adultních SCs určitého orgánu nebo tkáně 
diferencovat do jiného druhu tkáně 
schopnost adultních SCs určitého orgánu nebo tkáně 
diferencovat do jiného druhu tkáně 
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
12
Replikační potenciál SCs:Replikační potenciál SCs:
In vivo
• ESCs ‐ tvorba ICM ve stádiu blastocysty
• ASCs ‐ po celou dobu života organismu
In vivo
• ESCs ‐ tvorba ICM ve stádiu blastocysty
• ASCs ‐ po celou dobu života organismup g
In vitro
• ESCs neuronální ASCs neomezeně
p g
In vitro
• ESCs neuronální ASCs neomezeně• ESCs, neuronální ASCs ‐ neomezeně
• většina ASCs – omezené dělení
l á á k i i
• ESCs, neuronální ASCs ‐ neomezeně
• většina ASCs – omezené dělení
l á á k i i• telomerázová aktivita
ESCs ‐ symetrická mitóza
• telomerázová aktivita
ESCs ‐ symetrická mitózay
ASCs ‐ asymetrická mitóza
y
ASCs ‐ asymetrická mitóza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
13
Replikační potenciál SCs:
A – kmenová buňka
B – progenitorová buňka
C – diferencovaná buňka
1 – symetrické dělení
2 t i ké děl í2 – asymetrické dělení
3 – dělení progenitorů
4 – terminální diferenciace4  terminální diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
14
“Niche” (hnízdo) SCs“Niche” (hnízdo) SCs
• mikroprostředí (microenvironment):
podpůrné buňky, extracelulární matrix, adhezní 
molekuly a signální molekuly
• mikroprostředí (microenvironment):
podpůrné buňky, extracelulární matrix, adhezní 
molekuly a signální molekulymolekuly a signální molekuly
• udržuje self‐renewal SCs
molekuly a signální molekuly
• udržuje self‐renewal SCsudržuje self renewal SCs
• chrání před deplecí živin
• reguluje proliferaci SCs
udržuje self renewal SCs
• chrání před deplecí živin
• reguluje proliferaci SCsg j p
• ASCs ‐ po celou dobu 
g j p
• ASCs ‐ po celou dobu 
života organismuživota organismu
niche cells
( ó )
niche cells
( ó )
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
SCs (mitóza)SCs (mitóza)
15
Diferenciační potenciál lidských SCsDiferenciační potenciál lidských SCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
16
Embryonální zárodečné buňky (EG cells)
• vznik z primordiálních zárodečných buněk (PG cells)p ý ( )
• migrují v embryu do genitální lišty
• později společně se somatickými buňkami tvoří gonády
• izolace ve vhodný čas + kultivace in vitro  pluripotentní (EG cells)
• lidské EGCs netvoří teratomy ani chiméry
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
17
Fetální kmenové buňky
• primitivní (málo diferencované) buňky v orgánech fétu
• např: KB neurální lišty, hematopoetické KB, pankreatické 
progenitory, neurální KB 
• izolovány z abortovaných fétůizolovány z abortovaných fétů
Kmenové buňky z pupečníku
pupečníková krev hematopoetické KB (HSCs) endoteliálnípupečníková krev – hematopoetické KB (HSCs), endoteliální 
progenitory, mezenchymální KB (MSCs), VSELs... 
Whartonův rosol – zdroj mezenchymálních KB (MSCs)
• většinou jsou multipotentní
• buňky tvoří kolonie, mohou být kultivovány a mají dlouhébuňky tvoří kolonie, mohou být kultivovány a mají dlouhé 
telomery
• vyšší imunologická kompatibilita než buňky KD
• HSCs frekvence výskytu minimálně stejná jako v kostní dřeni
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
• HSCs ‐ frekvence výskytu minimálně stejná jako v kostní dřeni
18
EMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKYEMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKYEMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKYEMBRYONÁLNÍ KMENOVÉ BUŇKY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
19
5denní blastocysta5denní blastocysta
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
20
Schopnosti ESCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
21
Typy mESCsTypy mESCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
22
Izolace a indukovaná diferenciace ESCsIzolace a indukovaná diferenciace ESCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
23
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
24
Á ÍÁ ÍLINIE EMBRYONÁLNÍCH 
KMENOVÝCH BUNĚK
LINIE EMBRYONÁLNÍCH 
KMENOVÝCH BUNĚKKMENOVÝCH BUNĚK
V PODMÍNKÁCH IN VITRO
KMENOVÝCH BUNĚK
V PODMÍNKÁCH IN VITRO
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
25
1981 ‐ myší ES buněčná linie:1981 ‐ myší ES buněčná linie:
M.J. Evans and M.H. Kaufman
University of Cambridge, UK
M.J. Evans and M.H. Kaufman
University of Cambridge, UK
Gail R. Martin
University of California, 
Gail R. Martin
University of California, 
Nobel Prize 2007Nobel Prize 2007
San Francisco, CA, USA
1998 lid ká ES b ěč á li i
San Francisco, CA, USA
1998 lid ká ES b ěč á li i
Nobel Prize 2007Nobel Prize 2007
1998 ‐ lidská ES buněčná linie:
J.A. Thomson et al.
U i it f Wi i
1998 ‐ lidská ES buněčná linie:
J.A. Thomson et al.
U i it f Wi iUniversity of Wisconsin, 
Madison, WI, USA
University of Wisconsin, 
Madison, WI, USA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
26
Postup při vytvoření 
linie ESCs:
Postup při vytvoření 
linie ESCs:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
27
exprese a aktivita
telomerázy
(A) Gut‐like structures (B) Rosettes of neural 
epithelium (C) Bone (D) Cartilage (E) Striated 
muscle (F) Tubules interspersed with 
structures resembling fetal glomeruli
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
exprese: AP, SSEA‐3, SSEA‐4, TRA‐1‐60, TRA‐1‐81
structures resembling fetal glomeruli.
28
• odstanění zony pelucidy pronázou (proteáza)
• imunochirurgické uvolnění ICM 
(anti‐lidský IgG, komplement)
ř í ICM f d l (MEF )• přenesení ICM na feeder‐layer (MEFs)
• pasážování mechanicky nebo enzymaticky 
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
29
http://portal.gov.cz/app/zakony/zakon.jsp?page=0&fulltext=&nr=227~2F2006&part=&name=&rpp=15#seznam
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
http://portal.gov.cz/app/zakony/zakon.jsp?page 0&fulltext &nr 227 2F2006&part &name &rpp 15#seznam
30
Zákon č. 40/2009 Sb., trestní zákoník
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
31
Alternativní metody získání pluripotentních SCs 
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
32
Alternativní metody získání pluripotentních SCs 
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
33
Alternativní metody získání pluripotentních SCs 
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
34
Markery lidských ESCs:Markery lidských ESCs:y ý
• Oct‐4 (TF, octamer‐4 binding protein) 
• Nanog (homeobox TF)
y ý
• Oct‐4 (TF, octamer‐4 binding protein) 
• Nanog (homeobox TF)Nanog (homeobox TF)
• SSEA3
SSEA4 
Nanog (homeobox TF)
• SSEA3
SSEA4 
(povrchové markery: Stage Specific Embryonic 
Antigen)
T 1 60
(povrchové markery: Stage Specific Embryonic 
Antigen)
T 1 60• Tra‐1‐60
Tra‐1‐81
(Tumor Rejection Antigen)
• Tra‐1‐60
Tra‐1‐81
(Tumor Rejection Antigen)(Tumor‐Rejection Antigen)
• alkalická fosfatáza (Tra‐2‐54)
(Tumor‐Rejection Antigen)
• alkalická fosfatáza (Tra‐2‐54)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
35
Kultivační médium pro izolaci lidských ESCs:
• DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)
Kultivační médium pro izolaci lidských ESCs:
• DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium)
• 20% FBS nebo KO‐SR (serum replacement)
• aditiva (‐merkaptoethanol, Gln, AAs, Atb)
ů é f k bFGF (FGF2)
DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium)
• 20% FBS nebo KO‐SR (serum replacement)
• aditiva (‐merkaptoethanol, Gln, AAs, Atb)
ů é f k bFGF (FGF2)• růstové faktory: bFGF (FGF2)
• feeder‐layer (myší embryonální fibroblasty, lidské 
fibroblasty): inaktivace mitomycinem‐C
• růstové faktory: bFGF (FGF2)
• feeder‐layer (myší embryonální fibroblasty, lidské 
fibroblasty): inaktivace mitomycinem‐C
• matrigel
Metody diferenciace lidských ESCs:
• matrigel
Metody diferenciace lidských ESCs:y ý
• kultivace při vyšší densitě
• kultivace v přítomnosti dalších buněčných linií
• přídavek růstových faktorů / cytokinů do média
y ý
• kultivace při vyšší densitě
• kultivace v přítomnosti dalších buněčných linií
• přídavek růstových faktorů / cytokinů do média• přídavek růstových faktorů / cytokinů do média
• aktivace endogenních transkripčních faktorů
• suspenzní kultura (tvorba embryoid bodies)
• přídavek růstových faktorů / cytokinů do média
• aktivace endogenních transkripčních faktorů
• suspenzní kultura (tvorba embryoid bodies)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
36
Zachování self‐renewal
mESCs vs. hESCs
• nepotřebují feeder
• LIF (leukemia inhibitory factor)
b• vazba na LIF R a gp130 receptor
• aktivace (fosforylace) 
transcripčního faktoru STAT3transcripčního faktoru STAT3
• protiháč: ERK1/2  diferenciace
• specifický marker SSEA‐1
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
37
Zachování self‐renewal
mESCs vs hESCsmESCs vs. hESCs
• potřebují feeder layer nebo p j y
• adhezivní matrix (laminin, kolagen IV, heparan sulfát 
proteoglykany(HSPGs), entaktin – Matrigel) 
• kondiciované médium z MEF
• KO ‐ serum replacement (insulin, transferin, BSA)
• FGF‐2 (4ng/ml)
• aktivace signálních drah: FGF, TGF rodina ‐ activin, nodal
• protiháč: BMP  diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
38
Základní signální dráhy ovlivňující self‐renewal a pluripotenci
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
39
feeder‐layer
myší         lidský      _ 
feeder‐layer
myší vs. lidský
• druhová odlišnost
• odlišnosti v produkci 
růstových faktorůrůstových faktorů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
40
hESCs niche
• regulace Smad1 signální (diferenciační) dráhyg g ( ) y
• agonista‐BMP2 (bone morphogenic factor)
• produkován extra‐embryonálním endodermem
( h d d ff f ( )• antagonista – GDF3 (growth and differentiation factor (GDF)
• produkován hESCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
41
„Adaptované“ lidské ESCs:
• ESCs v podmínkách in vitro
„Adaptované“ lidské ESCs:
• ESCs v podmínkách in vitro• ESCs v podmínkách in vitro
• změny v karyotypu
• nejčastěji zisky (gains) na chromosomech 12, 17 a X
• ESCs v podmínkách in vitro
• změny v karyotypu
• nejčastěji zisky (gains) na chromosomech 12, 17 a X
• obdobné změny ‐ markery germinálních nádorů  
• prokázáno již od nízkých pasáží
• obdobné změny ‐ markery germinálních nádorů  
• prokázáno již od nízkých pasáží
Peter Andrews
University of Sheffield
Peter Andrews
University of Sheffieldyy
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
42
trisomie ch17
zisky a ztráty
čá í h ů
Baker et al Nature Biotechnology 2007Baker et al Nature Biotechnology 2007
částí chromozomů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
Baker et al., Nature Biotechnology 2007Baker et al., Nature Biotechnology 2007
43
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
44
Diferenciační protokoly pro ESCs in vitro:
t t li d d t
Diferenciační protokoly pro ESCs in vitro:
t t li d d t• neurony, astrocyty, oligodendrocyty
• kardiomyocyty
• endoteliální buňky
• neurony, astrocyty, oligodendrocyty
• kardiomyocyty
• endoteliální buňky• endoteliální buňky
• pankreatické β‐buňky
• CD34+ hematopoetické progenitorové buňky
• endoteliální buňky
• pankreatické β‐buňky
• CD34+ hematopoetické progenitorové buňkyCD34+ hematopoetické progenitorové buňky
• antigen‐prezentující buňky a NK‐buňky
• buňky plicního epitelu
CD34+ hematopoetické progenitorové buňky
• antigen‐prezentující buňky a NK‐buňky
• buňky plicního epiteluy p p
• osteoblasty
• hepatocyty
y p p
• osteoblasty
• hepatocyty
• melanocyty
• buňky prostaty 
• melanocyty
• buňky prostaty 
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
45
Přínos studia kmenových buněk
• Studium vývoje organismů na buněčné a molekulární úrovni
• Nádorová biologie – nádorové KBNádorová biologie  nádorové KB
• Tvorba modelů různých onemocnění
St di ý h ílů“ á léči• Studium „genových cílů“ pro nová léčiva
• Testování léčiv, teratogenních a toxických sloučenin
• Studium mechanismů regenerace tkání
• Buněčná terapie ‐ náhrada chybějící nebo nefunkční 
buněčné populace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
46
Indukované pluripotentní kmenové buňky (iPSCs) 
• diferencovaná somatická buňka
• reprogramace vývoje
• vnesením a spuštěním vhodných 
genů
• změna do „embryonálního“ 
ádistádia
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
47
• vytvoření iPSCs bez využití embrya
• metoda:“jaderné programování somatických buněk” 
4 O t4 S 2 M Klf4• 4 geny : Oct4, Sox2, c‐Myc, Klf4 
• retrovirové vektory (náhodná integrace, nádorová 
transformace buněk))
• přeprogramování kožní buňky na pluripotentní
• ověřeno diferenciací a podílem iPSCs na tvorbě embrya 
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
(chimerické embryo)
48
Schéma tvorby myších iPSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
49
Podíl iPSCs na chimerickém myším embryu
epiblast
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
50
• 4 geny : Oct4 Sox2 Nanog Lin28• 4 geny : Oct4, Sox2, Nanog, Lin28
• lentivirové vektory (náhodná integrace, nádorová 
transformace buněk, nekontrolovaná exprese)
• přeprogramování kožní buňky na pluripotentní
• ověřeno: celogenomová exprese podobná hESCs, exprese 
h ý h ů b ů k dpovrchových antigenů, tvorba teratomů po injekci do 
imunodeficientní myši
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
51
využití iPSCs
• studium vývoje a funkce tkání 
• transplantační medicínatransplantační medicína 
(vlastní buňky) 
• vývoj a testování léčiv
• modelování chorob• modelování chorob
• léčba genetických poruch (genové inženýrství)
• náhrada za hESCs z embryí
rizika spojená s přenosem a indukcí exprese nových genů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
52
Příprava tělu vlastních iPSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
53
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.
54
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie  ‐ jaro 2013 ‐ 08 / 10.4.