4. úloha. Restrikční mapování DNA
Mapování restrikčních fragmentů DNA lze s řadou výhod provádět po jejich naklonování do
vektorů, obsahujících polylinkery se štěpnými místy pro různé restriktázy. Restrikční místa
polylinkeru pak vymezují konce restrikčního fragmentu a kombinovaným štěpením
jednotlivými restriktázami lze poměrně snadno sestrojit restrikční mapu fragmentu.
Jedním z vhodných vektorů je plazmid pUC18.
K vlastnímu mapování můžeme použít různé strategie, zvláště vhodnou je kombinované
štěpení DNA několika různými RE
Materiál: Rekombinantní plazmid pUC18 nesoucí 5 kb (4992 bp) inzert cizorodé DNA (ve
formě DNA), plazmid pUC18 (ve formě DNA), zařízení pro elektroforézu a vyhodnocování
elektroforetických gelů, standardy molekulové hmotnosti (např. DNA fága lambda štěpená
EcoRI/HindIII + HindIII), restrikční endonukleázy EcoRI, PstI, PvuII, NdeI, SnaBI a XhoI
štěpící pufry, mikrozkumavky, pipety, špičky, vodní lázeň, termostat
Postup:
1. Provedeme izolaci rekombinantního plazmidu pUC18 obsahujícího Eco RI inzert cizorodé
DNA.
2. Stanovíme velikost inzertu (naklonovaného restrikčního fragmentu) štěpením
rekombinantního plazmidu RE Eco RI, který(é) byl (y) použit(y) ke klonování
3. Rekombinantní plazmid štěpíme vybranými restriktázami: EcoRI, PstI, PvuII, NdeI, SnaBI
a XhoI
- jednotlivě
- současně EcoRI a další (případně třemi)
3.Stanovíme velikost vzniklých restrikčních subfragmentů
4. Hodnoty získané v bodě 1) a 3) uspořádáme do tabulky a logickou úvahou uspořádáme
restrikční místa na restrikčním fragmentu, případně nakreslíme restrikční mapu.
Příklad:
do restrikčního místa EcoRI vektoru pBR322 byl naklonován restrikční fragment. K
mapování bylo použito PstI, jejíž štěpné místo je vzdáleno od EcoRI místa 764 bp.
Postup: provedeme následující štěpení:
1 - pBR322/EcoRI
2 - pBR322+inzert/EcoRI
3 - pBR322+inzert/PstI + EcoRI
Pufry pro štěpení 2 enzymy současně volíme podle přiložené tabulky. V případě nutnosti
následného štěpení použijeme jako první pufr s nižším obsahem solí.
Velikost DNA fragmentů se stanoví z elektroforetogramu na základě srovnání s mobilitou
standardních DNA fragmentů. Z velikostí jednotlivých fragmentů se sestaví restrikční mapa.