BIOINFORMATIKA V PRAXI – CVIČENÍ 6 KLONOVÁNÍ A RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ STUDIJNÍ MATERIÁLY Molekulárně biologické pozadí problematiky je obsaženo v knize Metody molekulární biologie (Šmarda J., Doškař J., Pantůček R., Růžičková V., Koptíková J.) 2005. VEKTOR V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII Pod pojmem vektor rozumíme v molekulární biologii molekulu DNA, která slouží k vložení úseku DNA (genu) a jeho přenos do cílového organismu (bakterie, buněčné kultury). Typicky se jedná o plasmidy. V současnosti je možno zakoupit široké spektrum plasmidů od různých dodavatelů. Liší se velikostí, použitím i cenou. ÚKOL 1 Na stránkách firem NEB (www.neb.com), Takara (www.takara-bio.com/research.htm), Invitrogen (www.invitrogen.com), Merck (www.merckmillipore.cz) nalezněte nabídku plasmidů (vektorů). Kolik různých plasmidů je možno zakoupit? STRUKTURA PLASMIDU Plasmidy používané v laboratořích jsou obvykle více či méně uměle upraveny tak, aby maximálně splňovaly svou funkci. K tomu je nezbytná přítomnost určitých úseků. Mezi základní patří selekční marker (obvykle gen pro rezistenci na antibiotikum) a mnohočetné klonovací místo (multiple cloning site). ÚKOL 2 Nalezněte informace o následujících plasmidech. Jaká je velikost těchto plasmidů a pro které antibiotikum nesou tyto plasmidy resistenci? Plasmid Velikost [bp] Rezistence pET-41a (Merck-Novagen) pUC18 (TaKaRa) pKLAC1 (NEB) pTWIN-MBP (NEB) pET-3d (Merck-Novagen) pRSET A (Invitrogen) RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ Skupina endonukleas, která specificky rozpoznává tzv. palindromatické sekvence, je označována jako restrikční endonukleasy (restriktasy). Mnohé informace k nim lze nalézt na stránkách dodavatelů těchto enzymů, např. New England Biolabs (http://www.neb.com). ÚKOL 3 Vytvářejí následující restriktasy tzv. kohezní konce? Pokud ano, jaké. AfeI BmtI DraI HpyCH4V KasI RsaI Tsp509I XbaI ÚKOL 4 Některé restriktasy rozpoznávají tytéž palindromatické sekvence, avšak štěpí je v odlišném místě (jedná se o tzv. isoschizomery). Nalezněte alespoň dvě dvojice takových restriktas a uveďte, kde a jak štěpí DNA. ÚKOL 5 Určité restriktasy rozpoznávají různé palindromatické sekvence, avšak vytvářejí tytéž převislé konce. K následujícím restriktasam doplňte vždy alespoň jednu další, která vytváří vzájemně kompatibilní převislé konce a přitom rozpoznává jiný palindrom. AgeI EagI PstI SpeI ÚKOL 6 Některé z restriktas jsou aktivní v závislosti na tom, zda štěpená DNA je či není methylována (methylace adeninu nebo cytosinu). Uveďte alespoň jednu restriktasu, která je blokována methylací Dcm methylasou (methylace na C5 pozici cytosinu v sekvencích CCAGG nebo CCTGG). Využijte informace o citlivosti na methylaci (methylation sensitivity) na serveru NEB. MULTIPLE CLONING SITE MCS je z praktického hlediska nejzajímavější částí plasmidu. Jedná se o úsek, v nemž se nachází přesně definované palindromy, které jsou rozpoznávány příslušnými restrikčními enzymy. ÚKOL 7 Ke komerčně dodávaným plasmidům lze nalézt základní informace, včetně sekvence MCS. Vyhledejte tuto sekvenci pro následující plasmidy a zjistěte, pro které restrikční enzymy jsou zde vhodné palindromy. Plasmid: pBAD/His A (Invitrogen) Restrikční místa v MCS: Plasmid: pKLMF-EK (NEB) Restrikční místa v MCS: Plasmid : pETBlue-1 (Novagen) Restrikční místa v MCS: RESTRIKČNÍ MAPA Zanesením restrikčních míst do graficky znázorněné sekvence DNA (plasmidu) vzniká restrikční mapa. Z praktického hlediska je často nutné zjistit, která z restriktas štěpí plasmid právě jednou, která vícekrát a která vůbec. K tomuto účelu lze použít online programy, například NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php). ÚKOL 8 Najděte sekvenci plasmidu pET-40b dodávaného firmou Merck (http://www.merck-chemicals.cz/life-science-research/) a detekujte restrikční místa. Uveďte restriktasy, které štěpí daný plasmid právě šestkrát. Kolik z nich je komerčně dostupných? SOUČASNÉ ŠTĚPENÍ DVĚMA RESTRIKTASAMI Pro účely klonování do vektoru (vložení genu do plasmidu) je obvykle třeba štěpit DNA dvěma restriktasami. S ohledem na prostředí, které tyto enzymy vyžadují pro optimální aktivitu, je možné provést toto štěpení v jednom kroku, nebo štěpit sekvenčně. ÚKOL 9 Zjistěte aktivitu (v procentech maximální aktivity) následujících restriktas v uvedených komerčních pufrech. Enzym Pufr Aktivita [%] AgeI NEB buffer 3.1 HpaI NEB buffer 2.1 TseI NEB buffer 1.1 BanII TaKaRa buffer M NaeI TaKaRa buffer H XhoI TaKaRa buffer K ÚKOL 10 Posuďte, zda je v případě následujících dvojic vhodné/nutné provést sekvenční štěpení – tj. štěpení DNA jednou restriktasou, převedení do jiného pufru a následné štěpení druhou restriktasou. Vycházejte z předpokladu, že pokud neexistuje pufr, v němž by oba enzymy měly alespoň 60% maximální aktivity, je vhodnější zvolit sekvenční štěpení. Vycházejte z informací na serverech firem NEB a TaKaRa. Enzym 1 Enzym 2 Sekvenční štěpení AscI XcmI BamHI PstI NotI SspI SacI SapI ÚKOL 11 Je možno v laboratoři nahradit pro štěpení enzymem HaeIII pufr 2.1 (NEB) pufrem K (Takara) při zachování alespoň 80% účinnosti enzymu? Existuje jiný pufr, v němž by bylo možno reakci provést při stejném nároku na účinnost? Informace naleznete na stránkách firem New England Biolabs (http://www.neb.com) a Takara (http://catalog.takara-bio.co.jp/en/index.asp). UMĚLÉ VLOŽENÍ RESTRIKČNÍHO MÍSTA DO SEKVENCE V praxi se často setkáváme s potřebou vytvořit v určitém místě genové sekvence (typicky na začátku a konci genu nebo některé jeho části). V takovém případě často navrhujeme primery, které daný úsek ohraničují a přitom kódují i restrikční místo. Tyto primery pak nemají sekvenci zcela totožnou se sekvencí DNA na kterou nasedají. Vzniklý PCR produkt však obsahuje konkrétní restrikční místa, která potřebujeme pro další práci. SAMOSTATNÝ PROJEKT U vašeho genu vypracujte restrikční mapu. Připojte rovněž seznam restrikčních enzymů, které váš gen neštěpí.