Základní vlastnosti proteinů Teoretický úvod Aplikovaná bioinformatika, Jaro 2013 RNA Ribosom Protein Protein Proteiny •Protein, polypeptid, bílkovina. • •Lineární polymer aminokyselin spojených peptidovými vazbami. • •Funkce: katalytická, regulační, transportní, zprostředkování pohybu, obranná, strukturální, zásobní. RNA Ribosom Protein Protein Proteinogenní aminokyseliny Proteinogenní aminokyseliny Proteinogenní aminokyseliny Proteinogenní aminokyseliny 21. aminokyselina – selenocystein, Sec, U 22. aminokyselina – pyrrolysin, Pyl, O PLLSASIVSAPVVTSETYVDIPGLYLDVAKAGIRDGKLQVILNVPTPYATGNNFPGIYFAIATNQGVVADGCFTYSSKVPESTGRMPFTLVATIDVGSG VTFVKGQWKSVRGSAMHIDSYASLSAIWGTAAPSSQGSGNQGAETGGTGAGNIGGGGERDGTFNLPPHIKFGVTALTHAANDQTIDIYIDDDPKPAATF KGAGAQDQNLGTKVLDSGNGRVRVIVMANGRPSRLGSRQVDIFKKSYFGIIGSEDGADDDYNDGIVFLNWPLG 21. aminokyselina – selenocystein, Sec, U 22. aminokyselina – pyrrolysin, Pyl, O Peptidová vazba Figure 3.18. Peptide-Bond Formation. NH2 COOH NH2 COOH + NH2 COOH N-konec C-konec MTWCKTMIDQGRSWPHCYYGMAADTYYKKLTPGHTQVGITILMGACGCCCGTGCRNMSDETGCWWCGTAHSPGCTDEQLRCGLVCGT N C N C Proteinogenní aminokyseliny •Stavební jednotky proteinů: a-L-aminokyseliny. •20 standardních proteinogenních aminokyselin. •Alifatické (Gly, Ala, Val, Leu, Ile). •Sirné (Cys, Met). •S OH skupinou (Ser, Thr). •Kyselé a z nich odvozené (Glu, Gln, Asp, Asn). •Bazické (Lys, Arg). Sekundární struktura Figure 3.37. An Antiparallel β Sheet. Figure 3.38. A Parallel β Sheet. Figure 3-6. Model of the α helix. a-helix b-skládaný list Terciární struktura a-helix b-skládaný list Jak se chovají proteiny? (v laboratoři) •Limitované množství proteinu (cena, dostupnost). • •In vitro mohou rychle ztrácet aktivitu (nutná správná sekundární, terciární a někdy i kvarterní struktura). • •Mohou být nestabilní (některé velmi nestabilní) mimo své optimální prostředí v buňce (organismu). • •K výrazné destabilizaci a denaturaci může docházet již za laboratorní teploty (25 °C). • • …zlobí. Práce s proteiny •Většina savčích proteinů začíná denaturovat již při teplotách nad 40 °C. Při teplotě 95 °C dochází k úplné denaturaci téměř všech proteinů během několika minut. K výrazné destabilizaci a denaturaci může docházet již za laboratorní teploty (25 °C). • • S proteiny pracujeme „na ledu“. • • • • • ANd9GcQoDXTvrVM3rZZVu6MlGO7Vw63brftaDajCElN2I-PPFzmx01s-bQ ANd9GcSq2t-tZMK-GB3FrQKEk1QDpECqYwnU7qUY9N9X0EdRWL0LtIPQ Práce s proteiny •Proteiny jsou štěpeny proteasami a peptidasami. Optimum těchto enzymů je 37 °C, za nižší teploty se jejich aktivita snižuje (ale jsou aktivní i při 4 °C). Proteasy se do vzorku dostanou neopatrnou manipulací a jsou také produkovány mikroorganismy. • • Minimalizace kontaminace vzorku (ochranné pomůcky) a použití inhibitorů proteas. • • ANd9GcTBQ886zYZirsdbyVNGRy1q2QdK3_zsMBbjSbhHJwj5BSF633MI Práce s proteiny •Všechny vzorky jsou dříve či později kontaminovány bakteriemi. Mikroorganismy si na proteinech pochutnají i při 4 °C a produkují proteasy. • • Přídavek antibakteriálních látek (0,02-0,05 % azid sodný) • • Práce s proteiny •Proteiny jsou aktivní (a stabilní) v určitém rozmezí pH. • A to může být pro některé proteiny velmi úzké… Fyziologické pH pro většinu proteinů je cca 7,2-7,4. Silně kyselé nebo zásadité prostředí proteiny denaturuje. • • Nutné kontrolované prostředí – pufry o vhodném pH. • • Práce s proteiny •Proteiny jsou aktivní (a stabilní) v určitém rozmezí pH. • A to může být pro některé proteiny velmi úzké… Fyziologické pH pro většinu proteinů je cca 7,2-7,4. Silně kyselé nebo zásadité prostředí proteiny denaturuje. • • Nutné kontrolované prostředí – pufry o vhodném pH. • • •Pufr, tlumivý roztok, ústojný roztok, ústoj: látka (směs látek) schopná udržovat stabilní pH po přídavku silné kyseliny nebo zásady do systému. Příklad: slabá kyselina/její sůl, HA/A-. „Přirodní“ x syntetické pufry. Pufry nesmí interagovat s proteiny nebo interferovat s jejich funkcí! Práce s proteiny •Proteiny vyžadují pro svou aktivitu (a stabilitu) určitou koncentraci solí (iontů). Vysoká i nízká koncentrace solí může způsobovat agregaci a precipitaci. Proteiny většinou nejsou stabilní v čisté vodě. • • Nutná optimalizovaná koncentrace soli v roztoku. • • ANd9GcR3UpU4ks6TB-mlEtoLmK_4WLLrQGavdnpGDQZhTFTbWb_7bWuvLw ANd9GcT-QbATQbvU9kXPSp--Sw6hEotDbWYqbBlOmdt8vltqYLoNDHuXMA abrin Práce s proteiny •Při práci s nízkými koncentracemi proteinů (< 1 mg/ml) se může výrazně projevit ztráta způsobená vazbou na stěny použité nádobky (zkumavky). • • Pokud je to možné, lze použít inertní proteiny (BSA, cca 2 mg/ml), které vazbě zabrání. • • Práce s proteiny Práce s proteiny •Proteiny mohou být rovněž poškozeny mechanicky při příliš energickém míchaní nebo třepání! • • • Nutná opatrná a jemná manipulace s proteiny. • Vortex Míchačka Skladování proteinů www.piercenet.com Skladování proteinů www.piercenet.com •Lyofilizace – mrazová sublimace. •Odpařování vody ze zmraženého vzorku za sníženého tlaku. •Nedostatek vody zabraňuje růstu mikroorganismů a inhibuje enzymy (proteasy). •Nepoškozuje vzorek v takovém rozsahu jako jiné způsoby dehydratace (vysoká teplota, vysoušedla). •Jednoduchá rehydratace. • • • Skladování proteinů Sterilní zkumavky, sterilizace filtrací. Inhibitory proteas. www.piercenet.com Skladování proteinů Kryoprotektanty zabraňují tvorbě krystalků ledu a poškození proteinu. www.piercenet.com Skladování proteinů Nutné připravit několik alikvotů (částí zásobního roztoku) proteinu. Skladování proteinů Proteiny mohou být lyofilizací nebo zamražením nevratně poškozeny! www.piercenet.com Práce s proteiny Struktura Funkce Gen Protein Protein je správně sbalený, aktivní, v dostatečném množství a koncentraci Optimální podmínky Práce s proteiny Struktura Funkce Gen Protein Protein je správně sbalený, aktivní, v dostatečném množství a koncentraci Optimální podmínky Hydrofobní interakce? Sirné (disulfidové) můstky? Oligomerizace? Nutné kofaktory? Přirozené prostředí (kompartment) v buňce? Práce s proteiny Struktura Funkce Gen Protein Protein je správně sbalený, aktivní, v dostatečném množství a koncentraci Optimální podmínky Optimalizace Práce s proteiny Struktura Funkce Gen Protein Protein je správně sbalený, aktivní, v dostatečném množství a koncentraci Optimální podmínky Optimalizace Doba optimalizace Šedivé vlasy Práce s proteiny Struktura Funkce Gen Protein Protein je správně sbalený, aktivní, v dostatečném množství a koncentraci Optimální podmínky Optimalizace Bioinformatika Práce s proteiny Struktura Funkce Gen Protein Protein je správně sbalený, aktivní, v dostatečném množství a koncentraci Optimální podmínky Optimalizace Bioinformatika PLLSASIVSAPVVTSETYVDIPGLYLDVAKAGIRDGKLQVILNVPTPY Predikce vlastností Predikce vlastností proteinů ProtParam BLAST Použitá a doporučená literatura Cover of Molecular Biology of the Cell Molecular Biology of the Cell, 4th edition Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter New York: Garland Science; 2002. ISBN-10: 0-8153-3218-1ISBN-10: 0-8153-4072-9 Cover of Molecular Cell Biology Molecular Cell Biology, 4th edition Harvey Lodish, Arnold Berk, S Lawrence Zipursky, Paul Matsudaira, David Baltimore, and James Darnell New York: W. H. Freeman; 2000. ISBN-10: 0-7167-3136-3 Cover of The Cell The Cell, 2nd edition, A Molecular Approach Geoffrey M Cooper Boston University Sunderland (MA): Sinauer Associates; 2000. ISBN-10: 0-87893-106-6 Cover of Biochemistry Biochemistry, 5th edition Jeremy M Berg, John L Tymoczko, and Lubert Stryer New York: W H Freeman; 2002. ISBN-10: 0-7167-3051-0 Použitá a doporučená literatura Použitá a doporučená literatura http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/browse/ Použitá a doporučená literatura Použitá a doporučená literatura •Brian W. Matthews. Hydrophobic Interactions in Proteins, in Encyclopedia of Life Sciences (ELS), John Wiley & Sons, Ltd: Chichester, 2001. • •Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides: http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/AminoAcid/index.html • •Irwin H. Segel, Leigh D. Segel. pH and Buffers, in Encyclopedia of Life Sciences (ELS), John Wiley & Sons, Ltd: Chichester, 2002. • •Tech Tip #43 Protein stability and storage: www.piercenet.com • • • • •