Základní vlastnosti proteinů Úkol 1 Pomocí aplikace ProtParam určete základní fyzikálně-chemické parametry proteinu: PLLSASIVSAPVVTSETYVDIPGLYLDVAKAGIRDGKLQVILNVPTPYATGNNFPGIYFAIATNQGVVADGCFTYSSKVPESTGRMPFTLVATIDVGSG VTFVKGQWKSVRGSAMHIDSYASLSAIWGTAAPSSQGSGNQGAETGGTGAGNIGGGGERDGTFNLPPHIKFGVTALTHAANDQTIDIYIDDDPKPAATF KGAGAQDQNLGTKVLDSGNGRVRVIVMANGRPSRLGSRQVDIFKKSYFGIIGSEDGADDDYNDGIVFL Úkol 2 Molekulová hmotnost zkoumaného proteinu byla pomocí SDS-PAGE stanovena na cca 30 kDa. Ověřte, zda se jedná o Váš protein: SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRVLQGVLPALPQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALCRRSTTD CGGPKDHPLTCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ Pokuste se vysvětlit možné nesrovnalosti. Úkol 3 Student s využitím ProtParam vypočítal molekulovou hmotnost svých proteinů na 69,9 a 12,7 kDa. Při gelové chromatografii ale určil molekulovou hmotnost na 33 a 51 kDa! Ověřte jeho výpočet a zkuste najít vysvětlení, když je experimentálně prokázáno, že tyto proteiny nepodléhají PTM. Protein 1: CCGACGGAGTTCCTGTACACGAGCAAGATAGCGGCGATAAGCTGGGCGGCGACGGGGGGGAGGCAGCAGAGGGTGTACTTCCAGGACCTGAACGGGAAG ATAAGGGAGGCGCAGAGGGGGGGGGACAACCCGTGGACGGGGGGGAGCAGCCAGAACGTGATAGGGGAGGCGAAGCTGTTCAGCCCGCTGGCGGCGGTG ACGTGGAAGAGCGCGCAGGGGATACAGATAAGGGTGTACTGCGTGAACAAGGACAACATACTGAGCGAGTTCGTGTACGACGGGAGCAAGTGGATAACG GGGCAGCTGGGGAGCGTGGGGGTGAAGGTGGGGAGCAACAGCAAGCTGGCGGCGCTGCAGTGGGGGGGGAGCGAGAGCGCGCCGCCGAACATAAGGGTG TACTACCAGAAGAGCAACGGGAGCGGGAGCAGCATACACGAGTACGTGTGGAGCGGGAAGTGGACGGCGGGGGCGAGCTTCGGGAGCACGGTGCCGGGG ACGGGGATAGGGGCGACGGCGATAGGGCCGGGGAGGCTGAGGATATACTACCAGGCGACGGACAACAAGATAAGGGAGCACTGCTGGGACAGCAACAGC TGGTACGTGGGGGGGTTCAGCGCGAGCGCGAGCGCGGGGGTGAGCATAGCGGCGATAAGCTGGGGGAGCACGCCGAACATAAGGGTGTACTGGCAGAAG GGGAGGGAGGAGCTGTACGAGGCGGCGTACGGGGGGAGCTGGAACACGCCGGGGCAGATAAAGGACGCGAGCAGGCCGACGCCGAGCCTGCCGGACACG TTCATAGCGGCGAACAGCAGCGGGAACATAGACATAAGCGTGTTCTTCCAGGCGAGCGGGGTGAGCCTGCAGCAGTGGCAGTGGATAAGCGGGAAGGGG TGGAGCATAGGGGCGGTGGTGCCGACGGGGACGCCGGCGGGGTGG Protein 2: AWKGEVLANNEAGQVTSIIYNPGDVITIVAAGWASYGPTQKWGPQGDREHPDQGLICHDAFCGALVMKIGNSGTIPVNTGLFRWVAPNNVQGAITLIYN DVPGTYGNNSGSFSVNIGKDQS Úkol 4 Student pracuje se směsí tří proteinů. Ve standardním pufru (20 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5) pozoroval vznik sraženiny! Zkuste ODHADNOUT, jestli dochází ke srážení všech proteinů nebo pouze některého z nich a zoufalému studentovi pomozte najít řešení. Protein 1: PLLSASIVSAPVVTSETYVDIPGLYLDVAKAGIRDGKLQVILNVPTPYATGNNFPGIYFAIATNQGVVADGCFTYSSKVPESTGRMPFTLVATIDVGSG VTFVKGQWKSVRGSAMHIDSYASLSAIWGTAAPSSQGSGNQGAETGGTGAGNIGGGGERDGTFNLPPHIKFGVTALTHAANDQTIDIYIDDDPKPAATF KGAGAQDQNLGTKVLDSGNGRVRVIVMANGRPSRLGSRQVDIFKKSYFGIIGSEDGADDDYNDGIVFLNWPLG Protein 2: GLSDGACWQLVLNVWGKVEADICPGHGQEVLILLFKGHPETLEKFDKCFKHLKCSEDEMKASEDLKKHGATVLTACLGGILKKKCGHHEAECIKPLAQD SHATKHKISPVCKYLCEFRISECRCIQIVLQCSKHPGDFGCADAQGAMNKALELFRCKDMASNYKELGFQG Protein 3: AWKGEVLANNEAGQVTSIIYNPGDVITIVAAGWASYGPTQKWGPQGDREHPDQGLICHDAFCGALVMKIGNSGTIPVNTGLFRWVAPNNVQGAITLIYN DVPGTYGNNSGSFSVNIGKDQS Úkol 5 Student potřeboval pro následné experimenty imobilizovat 3 proteiny na nosič (karboxymethylovaný dextran). Nechtělo se mu ptát se na radu kolegů a tak proteiny rozpustil v doporučovaném komerčním pufru (10 mM octan sodný, pH 5,0) a provedl imobilizace. U proteinů 1 a 3 byla úspěšná, u proteinu 2 naprosto selhala. „Proč?“, ptá se (opět) zoufalý student. Protein 1: PTEFLYTSKIAAISWAATGGRQQRVYFQDLNGKIREAQRGGDNPWTGGSSQNVIGEAKLFSPLAAVTWKSAQGIQIRVYCVNKDNILSEFVYDGSKWIT GQLGSVGVKVGSNSKLAALQWGGSESAPPNIRVYYQKSNGSGSSIHEYVWSGKWTAGASFGSTVPGTGIGATAIGPGRLRIYYQATDNKIREHCWDSNS WYVGGFSASASAGVSIAAISWGSTPNIRVYWQKGREELYEAAYGGSWNTPGQIKDASRPTPSLPDTFIAANSSGNIDISVFFQASGVSLQQWQWISGKG WSIGAVVPTGTPAGW Protein 2: ATQGVFTLPANTFGVTAEFANESSGTQTVNVLVNNETAATFSGQSTNNAVIGTQVENSGSSGKVQVQVSVNGRPSDLVSAQVILTNELNFALVGSEDDG TDNDYNDAVVVINWPLG Protein 3: SSVQTAATSWGTVPSIRVYTANNGKITERCWDGKGWYTGAFNEPGDNVSVTSWLVGSAIHIRVYASTGTTTTEWCWDGNGWTKGAYTATN Úkol 6 Student experimentálně určil extinkční koeficienty tří proteinů při 280 nm. A potom si rozházel špatně popsané výsledky a neví, který koeficient patří ke kterému proteinu... Pomozte mu přiřadit jednotlivé koeficienty ke správným proteinům. Předpokládejte, že student už čeká před kanceláří vedoucího a nemůže použít počítač. Protein 1: AQQGVFTLPARINFGVTVLVNSAATQHVEIFVDNEPRAAFSGVGTGDNNLGTKVINSGSGNVRVQITANGRQSDLVSSQLVLANKLNLAVVGSEDGTDM DYNDSIVILNWPLG Protein 2: AWKGEVLANNEAGQVTSIIYNPGDVITIVAAGWASYGPTQKWGPQGDREHPDQGLICHDAFCGALVMKIGNSGTIPVNTGLFRWVAPNNVQGAITLIYN DVPGTYGNNSGSFSVNIGKDQS Protein 3: SSVQTAATSWGTVPSIRVYTANNGKITERCWDGKGWYTGAFNEPGDNVSVTSWLVGSAIHIRVYASTGTTTTEWCWDGNGWTKGAYTATN Určené koeficienty jsou: 45 687, 7105, 27 860 M-1 cm-1. Úkol 7 Stejná situace. Ale nyní předpokládejte, že student má internet v mobilu. (A že je příliš nervózní a nedokáže to odhadnout. Což je rychlejší.) Úkol 8 Predikujte in vivo half-life následujících proteinů: Protein 1: MAQQGVFTLPARINFGVTVLVNSAATQHVEIFVDNEPRAAFSGVGTGDNNLGTKVINSGSGNVRVQITANGRQSDLVSSQLVLANKLNLAVVGSEDGTD MDYNDSIVILNWPLG Protein 2: MDRNGNFSLPPNTAFKAIFYANAADRQDLKLFIDDAPEPAATFVGNSEDGVRLFTLNSKGGKIRIEASANGRQSATDARLAPLSAGDTVWLGWLGAEDG ADADYNDGIVILQWPIT Protein 3: MERDGTFNLPPHIKFGVTALTHAANDQTIDIYIDDDPKPAATFKGAGAQDQNLGTKVLDSGNGRVRVIVMANGRPSRLGSRQVDIFKKSYFGIIGSEDG ADDDYNDGIVFLNWPLG Úkol 9 Student se má rozhodnout, se kterými proteiny bude pracovat příští dva roky v rámci diplomové práce. Poučen předchozími chybami se chce poradit se svými kolegy (s Vámi). Vyberte mu dva proteiny! Protein 1: SDVDIEAQDAGQTLVQVISIPSGETWVAIQLPSQYRYFDFVFENVSPTSSGSVLVAQMAPQSGGVYGSNYSGSGWGNDLGGGGFYGYSEAKWMCLWPAN RSGPSSKTGLYGTCKLMNLNQSSAVPSVTSNLFAPTAYKNEPGYANVGGCCQKIRGLASSIQFAFALAGGNVPQNTDTFNGGTIKVYGWN Protein 2: LVIVDAVTLLSAYPEASRDPAAPTVIDGRHLYVVSPGDAAQLGHNDSRLFTGLSPGDQLHLRETALALRAEVSVLFIRFALKDAGIVAPIELEVRDAAT AVPDADDLLHPSCRPLKDHYWRSDVLAAGATTCTADFAVCDRDGTVSGYFRWETSIEIAGSQPDTKQPGFKPSS Protein 3: PLLSASIVSAPVVTSETYVDIPGLYLDVAKAGIRDGKLQVILNVPTPYATGNNFPGIYFAIATNQGVVADGCFTYSSKVPESTGRMPFTLVATIDVGSG VTFVKGQWKSVRGSAMHIDSYASLSAIWGTAAPSSQGSGNQGAETGGTGAGNIGGGG Protein 4: ADSQTSSNRAGEFSIPPNTDFRAIFFANAAEQQHIKLFIGDSQEPAAYHKLTTRDGPREATLNSGNGKIRFEVSVNGKPSATDARLAPINGKKSDGSPF TVNFGIVVSEDGHDSDYNDGIVVLQWPIG Úkol 10 Porovnejte typický membránový a cytoplasmatický protein: Protein 1: DPIALTAAVGADLLGDGRPETLWLGIGTLLMLIGTFYFIVKGWGVTDKEAREYYSITILVPGIASAAYLSMFFGIGLTEVQVGSEMLDIYYARYADWLF TTPLLLLDLALLAKVDRVSIGTLVGVDALMIVTGLVGALSHTPLARYTWWLFSTICMIVVLYFLATSLRAAAKERGPEVASTFNTLTALVLVLWTAYPI LWIIGTEGAGVVGLGIETLLFMVLDVTAKVGFGFILLRSRAILGDTEAPEPSAGAEASAAD Protein 2: KLAVYSTKQYDKKYLQQVNESFGFELEFFDFLLTEKTAKTANGCEAVCIFVNDDGSRPVLEELKKHGVKYIALRCAGFNNVDLDAAKELGLKVVRVPAY DPEAVAEHAIGMMMTLNRRIHRAYQRTRDANFSLEGLTGFTMYGKTAGVIGTGKIGVAMLHILKGFGMRLLAFDPYPSAAALELGVEYVDLPTLFSESD VISLHCPLTPENYHLLNEAAFDQMKNGVMIVNTSRGALIDSQAAIEALKNQKIGSLGMDVYENERDLFFEDKSNDVIQDDVFRRLSACHNVLFTGHQAF LTAEALTSISQTTLQNLSNLEKGETCPNELV Úkol 11 Analyzujte proteiny z Úkolu 10 pomocí nástroje PSORT. Oba proteiny pocházejí z Gram negativních bakterií. Úkol 12 Student má za úkol izolovat zajímavý (pro vedoucího) protein z Gram negativní bakterie. Po několikadenním pěstování čtyř litrů kultury se student snažil získat z buněk protein (další týden práce), ale získal pouze mizivé množství… Jeho kolegyně si myslí, že se jedná o membránový protein, který je labilní a nevydrží proces izolace. Ověřte její teorii… Protein 1: MKYKTVKSIPLFLLGSIVFTACSTPQSTFHLPVQTTVSAIKKDISGKTATAVKAASSSSSTTTSNDDNNQKGYFLETNRSTGTYDPNNSTRLIKLGESG DFHAADQNKPEEALFERLYGGIASLLNFRIIKPALTYWNTVTPSLKAIGKSSNLITFSQDIDETELQRALANNLIVADDGNNNFWFGLKSLSFNSAKLT DNAQTQMAQKTTQAVTLKSQAQMSSTNTKNTNKKIDLRDKITLSSTMNTQGSGDNKNPSSGLIQKLVSVENIEAEFSFVKTGFNGNEIKFGDFVTENSP TTTQLKQVWKKKWGTELKKTNYKLQLNNFSLLLTYTPEVNKVEKGNNGDSNKGTIATPNGFSFLYPANLNETPSSSSSYWTNVTDLTKAATDTENTNLL NDLQKSQEQVNQFVAAITQNHLDVSEAALTKKQFGSLSISDFFKAIFKENGKDTKAKS Úkol 13 Student má za úkol charakterizovat a navrhnout možnou funkci proteinu z Burkholderia cenocepacia. Pomozte mu. Protein 1: LVIVDAVTLLSAYPEASRDPAAPTVIDGRHLYVVSPGDAAQLGHNDSRLFTGLSPGDQLHLRETALALRAEVSVLFIRFALKDAGIVAPIELEVRDAAT AVPDADDLLHPSCRPLKDHYWRSDVLAAGATTCTADFAVCDRDGTVSGYFRWETSIEIAGSQPDTKQPGFKPSS Úkol 14 Predikujte možnou lokalizaci proteinu z Homo sapiens a zkuste predikovat lokalizaci proteinu z Vampyroteuthis infernalis, i když je k dispozici jen fragment proteinu. Protein 1: MKWLLLLGLVALSECIMYKVPLIRKKSLRRTLSERGLLKDFLKKHNLNPARKYFPQWEAPTLVDEQPLENYLDMEYFGTIGIGTPAQDFTVVFDTGSSN LWVPSVYCSSLACTNHNRFNPEDSSTYQSTSETVSITYGTGSMTGILGYDTVQVGGISDTNQIFGLSETEPGSFLYYAPFDGILGLAYPSISSSGATPV FDNIWNQGLVSQDLFSVYLSADDQSGSVVIFGGIDSSYYTGSLNWVPVTVEGYWQITVDSITMNGEAIACAEGCQAIVDTGTSLLTGPTSPIANIQSDI GASENSDGDMVVSCSAISSLPDIVFTINGVQYPVPPSAYILQSEGSCISGFQGMNLPTESGELWILGDVFIRQYFTVFDRANNQVGLAPVA Protein 2: RKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALREIRRYQKSTELLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSAVMALQEASEAYLVGLFED TNLCAIHAKR Úkol 15 Použijte BLAST a pokuste se blíže určit funkci proteinu z Vampyroteuthis infernalis.