Produkce rekombinantních proteinů Teoretický úvod Aplikovaná bioinformatika, Jaro 2013 + Vektor Gen Rekombinantní DNA + Hostitelská buňka Práce s proteiny – Zisk proteinů Struktura Funkce Gen Protein Protein je správně sbalený, aktivní, v dostatečném množství a koncentraci Optimální podmínky Optimalizace Bioinformatika Zisk proteinů •Izolace nativních proteinů z přírozeného zdroje [USEMAP] http://www.laboratorni-mysi.cz Buňky různých tkání a orgánů Krev a další tělní tekutiny http://www.fnbrno.cz/darcovstvi-krve/k1570 Zisk proteinů •Izolace nativních proteinů z přírozeného zdroje •Je možné získat velké množství proteinu. •Může být levná. •Nemusíme řešit správné sbalování (folding) proteinů a posttranslační modifikace. fazole-recepty-fazolove •Organismus může obsahovat velmi málo cílového proteinu, navíc pouze za specifických podmínek a po omezenou dobu. •Organismus může být nebezpečný (viry) nebo obtížně kultivovatelný/chovatelný. • Zisk proteinů •Izolace nativních proteinů z přírozeného zdroje •Je možné získat velké množství proteinu. •Může být levné. •Nemusíme řešit správné sbalování (folding) proteinů a posttranslační modifikace. fazole-recepty-fazolove •Zisk a zpracování materiálu může být velmi drahé a časově a technologicky náročné. Nebo trestné. • pa_pandawaage1_sidebar http://www.zoovienna.at/ Zisk proteinů •Izolace nativních proteinů z přírozeného zdroje •Je možné získat velké množství proteinu. •Může být levné. •Nemusíme řešit správné sbalování (folding) proteinů a posttranslační modifikace. fazole-recepty-fazolove •Problémem je rovněž složitost přírodního materiálu. Je nutné využívat množství purifikačních a separačních metod! • C4830 Instrumentální biochemické metody C7030 Separační metody C6260 Metody separace proteinů C6200 Biochemické metody Zisk proteinů •Kom€rčně dostupné proteiny •Jednoduché a (někdy) rychlé. •Definované složení. •Může být dost drahé. •Omezené množství (za hodně peněz málo proteinu). •Dostupná forma nemusí být vhodná pro náš účel. Výhodné, když používáme proteiny jako NÁSTROJE v běžných metodách (enzymy, stabilizátory). Zisk proteinů •Kom€rčně dostupné proteiny http://www.sigmaaldrich.com/czech-republic.html Zisk proteinů •Kom€rčně dostupné proteiny Zisk proteinů •Kom€rčně dostupné proteiny http://www.elicityl-oligotech.com/ Zisk proteinů •Chemická syntéza • •Chemická syntéza peptidů – karbodiimidová metoda, produkce převážně kratších řetězců (syntéza na nosičích, nutnost aktivace funkčních skupin, blokování, odblokování) • •Chemická syntéza proteinů – metodický rozvoj umožnil úplnou chemickou přípravu i proteinů o délce cca 200 aminokyselin. Chcete vědět vic? Lukáš Žídek Skripta předmětu C9530 Strukturní biochemie Zisk proteinů •Chemická syntéza Produkce rekombinantních proteinů + Vektor Gen Rekombinantní DNA + Hostitelská buňka GMO Geneticky modifikovaný organismus Řízená exprese („nadexprese“) našeho genu: „Začni ho dělat teď a hodně a nepřestávej!“ Izolace a purifikace proteinu Protein Produkce rekombinantních proteinů + Vektor Gen Rekombinantní DNA + Hostitelská buňka GMO Geneticky modifikovaný organismus Klonování DNA Vytváření identických molekul DNA, v tomto případě zmožením rekombinantních molekul v hostitelské buňce. Cílem nemusí být exprese proteinu, ale například vytvoření dostatečného množství materiálu pro studium (a manipulace) genů. Příprava DNA, přenos do hostitelských buněk, selekce transformovaných buněk. Produkce rekombinantních proteinů GMO Geneticky modifikovaný organismus Řízená exprese („nadexprese“) našeho genu: „Začni ho dělat teď a hodně a nepřestávej!“ Exprese genu Cílem je zisk aktivního (správně sbaleného) proteinu v co největším množství. Produkce cizího proteinu buňky zatěžuje, proto je exprese genu indukovatelná – syntéza proteinu je vyvolána až po zmnožení a nárustu buněčné kultury. Optimalizace exprese je náročná, je nutné brát v úvahu množství parametrů, např. hustotu buněčné kultury, teplotu, koncentraci induktoru, složení média, pH, dobu indukce… Produkce rekombinantních proteinů Řízená exprese („nadexprese“) našeho genu: „Začni ho dělat teď a hodně a nepřestávej!“ Izolace a purifikace proteinu Protein Purifikace proteinů Zahrnuje množství metodik, které je nutné kombinovat a optimalizovat. Výběr závisí na vlastnostech proteinu (stabilita, rozpustnost) a rovněž důvodu proč protein purifikujeme. Při charakterizaci nových proteinů není často zisk aktivního proteinu koncem, ale teprve začátkem vlastního výzkumu… C8202 Základy proteomiky Bi8202c Základy proteomiky - cvičení Hostitelský organismus •Známý (tj. dobře prostudovaný) organismus •Ochotně akceptující cizorodou DNA •Bezpečný (tj. neohrožující zdraví, nepatogenní) •Krátká generační doba •Snadná kultivace/pěstování/chov •Nenáročný („levný“), přizpůsobivý •Vysoká produkce cizorodých proteinů •Možnost různých modifikací • Bakterie E. coli Izolace PCR produktu Cca 2 hodiny Štěpení 3-12 hodin pRSET A Štěpení 3-12 hodin Ligace Cca 16 hodin pRSET A-gen pRSET A Klonování DNA [USEMAP] Transformace Heat shock Cca 2-3 hodiny XL-1-Blue pRSET A -gen Selekce Ampicillin Cca 12 hodin Izolace plasmidu Asi den… Transformace Heat shock BL21(DE3) Selekce Ampicillin pRSET A -gen Expresní buňky Neexpresní buňky A teď můžete začít! Klonování DNA Klonování DNA http://worldwide.promega.com/products/ Vektory, enzymy, buňky, kity, induktory… •…jsou komerčně dostupné, a to v široké nabídce. https://www.neb.com http://www.lifetechnologies.com Vektory, enzymy, buňky, kity, induktory… •…jsou komerčně dostupné, a to v široké nabídce. http://www.qiagen.com/ DSCN3849 Stabilita proteinu •N-koncové pravidlo - ProtParam Protein = problém pro hostitelskou buňku •Produkce toxických proteinů. •Problémem může být i nadprodukce primárně netoxického proteinu – narušení metabolických drah. •Produkce proteinů s hydrofobními oblastmi – mohou se vázat na/do membrány. Protein = problém pro hostitelskou buňku •Produkce toxických proteinů. •Problémem může být i nadprodukce primárně netoxického proteinu – narušení metabolických drah. •Produkce proteinů s hydrofobními oblastmi – mohou se vázat na/do membrány. BLAST, PubMed, ProtParam, Jpred, TMpred Protein = problém pro hostitelskou buňku •Produkce toxických proteinů. •Problémem může být i nadprodukce primárně netoxického proteinu – narušení metabolických drah. •Produkce proteinů s hydrofobními oblastmi – mohou se vázat na/do membrány. •Řešením je vysoká kontrola exprese nebo použití speciálních kmenů hostitelských buněk. http://lucigen.com/store/elucidations-archive.html E. coli – využití kodonů •Využití kodonů odráží dostupnost jejich tRNA. •Vzácné kodony jsou využívány zřídka a navíc jsou rozeznávány tRNA dostupnou v malých množstvích. •Kodony vzácné v E. coli jsou velmi často obvyklé v eukaryotických organismech. •PROBLÉMY S TRANSLACÍ! • • • AUG UCG CAU GCC UAC AGC GUA CGG Met Ser His Ala Kodony na mRNA Antikodony na tRNA Aminokyseliny nesené tRNA E. coli – využití kodonů •Využití kodonů odráží dostupnost jejich tRNA. •Vzácné kodony jsou využívány zřídka a navíc jsou rozeznávány tRNA dostupnou v malých množstvích. •Kodony vzácné v E. coli jsou velmi často obvyklé v eukaryotických organismech. •PROBLÉMY S TRANSLACÍ! • • • E. coli – využití kodonů http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/protein_expression/ecoli/codons1/index.html Další vzácné kodony: GGA, GGG (glycin), AAG (lysin), ACA (threonin), UGU, UGC (cystein)… E. coli – využití kodonů •Využití kodonů odráží dostupnost jejich tRNA. •Vzácné kodony jsou využívány zřídka a navíc jsou rozeznávány tRNA dostupnou v malých množstvích. •Kodony vzácné v E. coli jsou velmi často obvyklé v eukaryotických organismech. •PROBLÉMY S TRANSLACÍ! • • • mRNA Ribosom Protein Protein tRNA s aminokyselinami E. coli – využití kodonů •Využití kodonů odráží dostupnost jejich tRNA. •Vzácné kodony jsou využívány zřídka a navíc jsou rozeznávány tRNA dostupnou v malých množstvích. •Kodony vzácné v E. coli jsou velmi často obvyklé v eukaryotických organismech. •PROBLÉMY S TRANSLACÍ! • • Předčasné ukončení translace, záměna aminokyselin (místo argininu je začleněn lysin u kodonu AGA), změna čtecího rámce, vynechání aminokyselin. • •Problém vzácných kodonů lze vyřešit využitím speciálních kmenů hostitelských buněk (upravené, produkují větší množství tRNA pro vzácné kodony). • • E. coli – využití kodonů BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL – extra kopie genů pro tRNA rozeznávající vzácné kodony argininu, isoleucinu, prolinu a leucinu http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/protein_expression/ecoli/optimisation_expression_levels /index.html •Další možností je změna sekvence genu – cílená mutageneze. Vzácné kodony změníme na běžné. • Problém: časová náročnost! • •Alternativa – SYNTETICKÝ GEN s optimalizovaným využitím kodonů. • Drahé, ale ve výsledku se dnes vyplatí. • Lze samozřejmě navrhnout i jiné modifikace než „pouhou“ optimalizaci kodonů. • I SE SYNTETICKÝM GENEM LZE DÁLE PRACOVAT A DODATEČNĚ HO „DOMA“ UPRAVOVAT! • E. coli – využití kodonů Tvorba disulfidických můstků (vazeb) •V cytoplasmě E. coli je redukční prostředí – „wild-type“ kmeny netvoří v cytoplasmě disulfidické můstky! •Jsou disulfidické můstky pro správné sbalení proteinu důležité? • • BLAST Predikce struktury Obsah cysteinů Původ proteinu/genu NE Výborně! Můžete řešit jiné problémy. ANO Musíte použít speciální kmeny E. coli. Vyzkoušejte cílenou produkci do periplasmy. Origami(DE3) (Novagen) Origami™ host strains are K-12 derivatives that have mutations in both the thioredoxin reductase (trxB) and glutathione reductase (gor) genes, which greatly enhance disulfide bond formation in the E. coli cytoplasm. Studies have shown that expression in Origami(DE3) yielded 10-fold more active protein than in another host even though overall expression levels were similar. The original Origami strains are compatible with ampicillin-resistant plasmids and are ideal for use with pET-32 vectors, since the thioredoxin fusion tag further enhances the formation of disulfide bonds in the cytoplasm. The trxB and gor mutations are selectable on kanamycin and tetracycline, respectively; therefore, these strains cannot be used with plasmids that can only be selected with kanamycin or tetracycline. To reduce the possibility of disulfide bond formation between molecules, strains containing mutations in trxB and gor are recommended only for the expression of proteins that require disulfide bond formation for proper folding. Rosetta-Gami2(DE3)pLySRare (Novagen) Rosetta-gami 2 host strains combine the advantages of Rosetta 2 and Origami 2 strains to alleviate codon bias and enhance disulfide bond formation in the cytoplasm when heterologoous proteins are expressed in E. coli. These trxB/gor mutants are compatible with kanamycin-resistant vectors, and carry the chloramphenicol-resistant pRARE2 plasmid, which supplies seven rare tRNAs. pLysS strains express T7 lysozyme, which further suppresses basal expression of T7 RNA polymerase prior to induction, thus stabilizing pET recombinants encoding target proteins that affect cell growth and viability. Tvorba disulfidických můstků (vazeb) Tvorba disulfidických můstků (vazeb) Cytoplasma Cytoplasmatická membrána Buněčná stěna Periplasmatický prostor Vnější membrána •Oxidační prostředí v periplasmě umožňuje tvorbu -S-S- vazeb. •Obsahuje enzymy, které vznik -S-S- katalyzují. Jak donutíte protein jít do periplasmy? Tvorba disulfidických můstků (vazeb) Cytoplasma Cytoplasmatická membrána Buněčná stěna Periplasmatický prostor Vnější membrána •Oxidační prostředí v periplasmě umožňuje tvorbu -S-S- vazeb. •Obsahuje enzymy, které vznik -S-S- katalyzují. Jak donutíte protein jít do periplasmy? Signální peptid (sekvence) Stabilita Struktura Funkce Interakce Lokalizace Posttranslační modifikace Posttranslační modifikace Stabilita Struktura Funkce Interakce Lokalizace •E. coli je prokaryotický organismus = prokaryota PROVÁDĚJÍ POSTTRANSLAČNÍ MODIFIKACE MNOHEM MÉNĚ NEŽ EUKARYOTA… http:/www.imtech.res.in/raghava/glycopp/ http://www.proglycprot.org/ Posttranslační modifikace Problém s introny! •E. coli je prokaryotický organismus = prokaryota NEPROVÁDĚJÍ SESTŘIH! Exon Intron Exon Transkripce Sestřih Translace DNA Primární transkript mRNA Protein Eukaryotický složený gen Problém s introny! •E. coli je prokaryotický organismus = prokaryota NEPROVÁDĚJÍ SESTŘIH! Dobře, dělají sestřih, ale mnohem řidčeji než eukaryota a většinou u nekódující RNA (tRNA). Problém s introny! •E. coli je prokaryotický organismus = prokaryota NEPROVÁDĚJÍ SESTŘIH! •Pro produkci eukaryotických proteinů v E. coli vycházíme z komplementární DNA – cDNA. Což je DNA získaná zpětnou transkripcí z mRNA. Exon Intron Exon Transkripce Sestřih DNA Primární transkript mRNA cDNA Reverzní transkripce Problém s introny! •E. coli je prokaryotický organismus = prokaryota NEPROVÁDĚJÍ SESTŘIH! •Pro produkci eukaryotických proteinů v E. coli vycházíme z komplementární DNA – cDNA. Což je DNA získaná zpětnou transkripcí z mRNA. Problém s introny! •E. coli je prokaryotický organismus = prokaryota NEPROVÁDĚJÍ SESTŘIH! •Pro produkci eukaryotických proteinů v E. coli vycházíme z komplementární DNA – cDNA. Což je DNA získaná zpětnou transkripcí z mRNA. $104.00 Problém s introny! •E. coli je prokaryotický organismus = prokaryota NEPROVÁDĚJÍ SESTŘIH! •Pro produkci eukaryotických proteinů v E. coli vycházíme z komplementární DNA – cDNA. Což je DNA získaná zpětnou transkripcí z mRNA. •Nebo si necháme připravit syntetický gen. Pozor! Musíme vědět (nebo dostatečně přesně predikovat), kde jsou introny/exony! Inkluzní tělíska •Proteinová inkluzní tělíska = nerozpustné proteinové agregáty •Špatně sbalené proteiny (problém disulfidických můstků, hydrofobních proteinů, posttranslačních modifikací) •Toxické proteiny •Proteiny, které se tvoří až příliš dobře – moc rychle a ve velkém množství •Proteiny, které tvoří inkluzní tělíska z neznámých důvodů… • • Nesbalený protein! Mohou se tvořit ve velkém množství. Vysoká čistota. Někdy lze protein renaturovat. Možné řešení produkce toxických proteinů. Nevýhody E. coli jako expresního systému •Rozdílné využívaní kodonů u E. coli a eukaryot •Problém s tvorbou disulfidických můstků •Problémy s posttranslačními modifikacemi •Neprovádí sestřih •Tvorba inkluzních tělísek Analýza genu/proteinu (i základní = rychlá) před vlastní expresí nám může uspořit spoustu času! Stabilita? Aminokyselinové složení? Homologní proteiny? Funkce? Hydrofobní oblasti? Důležité posttranslační modifikace? Použitá a doporučená literatura •Stránky Sigma-Aldrich: http://www.sigmaaldrich.com • •Stránky ELICITYL: http://www.elicityl-oligotech.com • •Stephen Kent et al. Through the looking glass – a new world of proteins enabled by chemical synthesis, Journal of Peptide Science 18: 428-436, 2012. • •Michael Andrew Quail. DNA Cloning, in Encyclopedia of Life Sciences (ELS), John Wiley & Sons, Ltd: Chichester, 2005. • •Karthikeyan Kandavelou et al. Ligation: Theory and Practice, in Encyclopedia of Life Sciences (ELS), John Wiley & Sons, Ltd: Chichester, 2005. • •Mala Mani et al. Restriction Enzymes, in Encyclopedia of Life Sciences (ELS), John Wiley & Sons, Ltd: Chichester, 2007. • •Stránky Promega: http://worldwide.promega.com • •Stránky New England BioLabs: https://www.neb.com • •Stránky Life Technologies: http://www.lifetechnologies.com Použitá a doporučená literatura •Stránky QIAGEN: http://www.qiagen.com/ • •Dokumentace k pET vektoru: pET System Manual (Novagen) • •High Efficiency Expression of Toxic Proteins, eLucidations, Issue 6: http://lucigen.com/store/elucidations-archive.html • •Dequan Chen and Donald E. Texada. Low-usage codons and rare codons of Escherichia coli, Gene Therapy and Molecular Biology 10: 1-12, 2006. • •EMBL Protein Expression and Purification Core Facility: http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/index.html • •Dokumentace k Origami(DE3) a Rosetta-Gami2(DE3)pLySRare (Novagen) • •Christopher T. Walsh et al. Protein Posttranslational Modifications: The Chemistry •of Proteome Diversifications, Angewandte Chemie (International ed. in English) 44: 7342-7372, 2005. • • • Použitá a doporučená literatura •Jagat S. Chauhan et al. GlycoPP: A Webserver for Prediction of N- and O- Glycosites in Prokaryotic Protein Sequences, PLoS ONE 7(7): 1-13, 2012. • •Stránky GlycoPP: http:/www.imtech.res.in/raghava/glycopp/ • •Stránky ProGlycProt: http://www.proglycprot.org/ • •Marlene Belfort et al. Prokaryotic Introns and Inteins: a Panoply of Form and Function, Journal of Bacteriology 177(14): 3897-3903, 1995. • • •