C6200-Biochemické metody
14E_Vazba makromolekul s ligandy
Petr Zbořil

Interakce molekul
•Makromolekula + ligand (nízkomolekulární)
–Obdoba E + S
–Efektory, modulátory apod.
•Interakce makromolekul
–Protein-protein
–Protein-NK
•Určení hodnot Mf, Lf, Lb
•
•
•

Stanovení hodnot
•
•
•Separace vázaného a volného ligandu
–rovnovážná dialýza
–MS
–GPC
–centrifugace
•

Separace vázaného a volného ligandu
•Rovnovážná dialýza
–Dlouhodobý proces
–Problém
–nespecifických interakcí
•

Separace vázaného a volného ligandu
•MS
–Separace Ab-hapten komplexu
•
•

Separace vázaného a volného ligandu
•
•GPC
•Ligand v elučním pufru
•Rovnováhy na patrech
•Vrchol následovaný depresí
•Centrifugace
•Partikulární suspenze - částice
•Problém nespecifické adsorpce - plast
–

Stanovení hodnot
•
•Analýza vazby bez separace – změna vlastností
–spektrální metody
•fluorescenční sondy, Q, FRET
–piezzoelektrické stanovení komplexu
•D fres = f(Dm)
–jiné specifické metody Mikrokalorimetrie - titrace
•

Mikrokalorimetrie
•
•
•
•
•
•
•
•Titrace ligandem

Analýza vazby - parametry
•Model dle
–Scatcharda
•Stejnocenná vazná místa (stejné K)
•Neovlivňují se
–Hilla
•Kooperativita vazných míst – ovlivnění + i -
–NNEM
•Negativní kooperativita, vyloučení souseda
•Speciálně pro DNA
–

Scatchardův model
•                    Mf + Lf        ML (= Lb)
•
•Kas = [Lb] / ([Mf] . [Lf])  =   [Lb] / ([Mt](n-n) . [Lf])
•
•[Lb] / [Mt] = n,   [Lb] = n . [Mt],   Kas = n / (n-n) . [Lf])
•
•Kas . (n-n)  =  n / [Lf]    Kas . n - Kas . n  = n/ [Lf]
•

Scatchardův model
•Grafické
•Znázornění
•odpovídá
•nesedí

Kooperující vazná místa – Hill
• Mf + m.Lf              ML = Lb
•
•KH = [Lb]/([Lf]m . [Mf])  =  [Lb] / [Lf]m . (n - n) . [M]  =  = n / (n - n) . [Lf]m
•  KH . (n - n) =  n / [Lf]m
•KH . [Lf]m =  n / (n - n)
•log KH + m.log [Lf]  =  log  (n / (n - n))
•

Kooperující vazná místa – Hill
• KH se nemění
•
•
•

NNEM
•Nearest neighbour exclusion model
•Typické pro interkalaci ligandů do šroubovice DNA
•Rozsah
•vyloučení
-Nejmenší
•počet bp
•mezi ligandy

NNEM
•n0/[Lf] = K0.(1-N0 n0).[ (1-N0 n0)/ (1-(N0 – 1) n0]N0-1
•
•pro n0        0             n0/[Lf] = K0
•pro n0/[Lf]       0       n0 = 1/N0
•
•K0 – vazebná konstanta pro isolované vazné místo
•n0 = c vázaného ligandu / c párů bazí - max. 1
•N0 = rozsah vyloučení, minimální počet párů bazí mezi ligandy (pro 1 žádné vyloučení)
•

NNEM
•Grafické
•vyjádření

•
•
•
•DĚkuji za pozornost
4/30/2013
Footer Text
17