MOLEKULOVÁ ABSORPČNÍ SPEKTROFOTOMETRIE v UV a viditelné oblasti spektra ENERGIE MOLEKULY •EM = ET + ER + EV + EE • EE > EV > ER > ET •Kvantovaná energie Þ energetické hladiny: –Rotační Þ přechody mezi rotačními stavy Þ – rotační spektra (MW) –Vibrační Þ přechody mezi vibračními stavy Þ – vibrační spektra (IR) ΔEV » X.104 . ΔER –Elektronové Þ přechody mezi elektronovými stavy Þ –elektronická spektra (UV-Vis) ΔEE » X.102 . ΔEV V=0 V=1 V=2 V=3 V=4 V=0 V=1 DEE = 6,2 – 1,5 eV DEV = 0,6 – 0,06 eV DER = 0,01 – 0,0001 eV DEE Vibronický přechod DEE Rotačně-vibrační př. DEV Rotační přechod DER DEV DER ENERGETICKÉ PŘECHODY V MOLEKULE A MOLEKULOVÁ SPEKTRA ELEKTRONICKÉ PŘECHODY VE FORMALDEHYDU n p p* p* ELEKTROMAGNETICKÉ VLNĚNÍ SPEKTRUM ELEKTROMAGNETICKÉHO ZÁŘENÍ 400px-Spectre ZÁŘENÍ UV - Vis c je rychlost světla (3×108 m/s) h = 6.65 × 10−34 J·s = 4.1 μeV/GHz je Planckova konstanta •E = hν = hc/λ VIDITELNÉ SVĚTLO Záření o vlnových délkách 400 - 800 nm je viditelné světlo, které je absorbováno a emitováno elektrony v atomech a molekulách, když přecházejí mezi energetickými hladinami. Barva Vlnová délka Frekvence červená ~ 625 až 740 nm ~ 480 až 405 THz oranžová ~ 590 až 625 nm ~ 510 až 480 THz žlutá ~ 565 až 590 nm ~ 530 až 510 THz zelená ~ 520 až 565 nm ~ 580 až 530 THz azurová ~ 500 až 520 nm ~ 600 až 580 THz modrá ~ 430 až 500 nm ~ 700 až 600 THz fialová ~ 380 až 430 nm ~ 790 až 700 THz INTERAKCE ZÁŘENÍ S LÁTKOU •Absorpce 1 •Emise 2 •Luminiscence 3 1 2 E0 E2 E1 E3 > E2 >E1 >E0 E3 3 hνabs = E3-E0 hνem = E3-E1 hνlum = E2-E0 PROPUSTNOST A BARVA Lidské oko vidí komplementární barvu, světlo vlnových délek, pro něž je látka propustná ABSORPCE A KOMPLEMENTÁRNÍ BARVY Transmitted color UV-Vis spektroskopie Fotometrie •Signál: zářivý tok Φ (W), dopadající Φ0 –Emisní –Absorpční –Luminiscenční (fluorescenční, fosforescenční) •Transmitance T = (Φ/Φ0); (Φ/Φ0)´100 (%) •Absorbance A = log(Φ0/ Φ)= -log T; 0£A £¥ Transmitance a délka absorbujícího prostředí: zákon Bouguer-Lambert I0 až I5 = propuštěný zářivý tok Φ = Φ0 - Φabs T Délka absorbujícího prostředí Transmitance a koncentrace zákon Beerův T Concentration UV-Vis spektroskopie Bouguert-Lambert-Beerův zákon dΦ = Φ- Φ0 -dΦ = k·Φ·dl -dΦ/Φ = k·dl Φ0 Φ Φ< Φ0 dl ln(Φ0 /Φ) = k·l ελ je molární absorpční koeficient při λ c je koncentrace UV-Vis spektroskopie Bouguert-Lambert-Beerův zákon F/F0 c limΦ=0 c→∞, l=konst. Φ=Φ0·eε·l·c F/F0 l limΦ=0 l→∞, c=konst. Φ=Φ0·eε·l·c Bouguert-Lambert-Beerův zákon Charakteristika absorpčního píku Gaussův profil fmn = síla oscilátoru ~ plocha píku A ε εmax ½εmax Rmn = moment přechodu Charakteristika absorpčního píku Síla oscilátoru fmn c = rychlost světla h = Planckova konstanta e = náboj elektronu Rmn = moment přechodu je vektor dipólmomentu Ψm , Ψn jsou vlnové funkce horního a dolního stavu spektrálního přechodu dτ = prostorový element , když je součin funkcí v integrálu funkce sudá. •Sudá funkce f(+x) = f(-x) •Lichá funkce f(-x) = -f(x) Charakteristika absorpčního píku Výběrová pravidla -α +α x y Sudá funkce: òf(x)dx ¹ 0 x y +α -α Lichá funkce: òf(x)dx = 0 Sudá x sudá = lichá x lichá = sudá Sudá x lichá = lichá x sudá = lichá Sudá funkce při inverzi vzhledem k počátku nemění znaménko Lichá funkce při inverzi zachovává velikost, ale mění znaménko Charakteristika absorpčního píku Výběrová pravidla 1.Vektor dipólového momentu je funkce lichá Aby Rmn¹0, musí být Rmn funkce sudá: 2.Součin Ψm . Ψn musí být proto funkce lichá. 3.Potom Ψm musí být lichá a Ψn sudá nebo naopak. + + - - Sudá funkce d orbital + - Lichá funkce p orbital + Sudá funkce s orbital Charakteristika absorpčního píku Výběrová pravidla •Molekulové orbitaly MO •Lineární kombinace atomových orbitalů MO-LCAO •Ψ1 a Ψ2 jsou atomové orbitaly, c1 a c2 konstanty •Φa je vazebný molekulový orbital •Φb je protivazebný molekulový orbital Výběrová pravidla Symbolika a členění molekulových orbitalů •Osové kvantové číslo λ je analogií vedlejšího (orbitálního) kvantového čísla l u atomů. •λ kvantuje úhlový (orbitální) moment hybnosti elektronu na dané energetické hladině molekuly; nabývá celočíselných hodnot λ = 0, 1, 2, 3, 4, … •Pro jednoelektronové orbitaly odpovídající jednotlivým hodnotám λ = 0, 1, 2, 3, 4, … se užívá značení σ, π, δ, φ, γ podobně jako značení s, p, d, f, g pro atomové orbitaly. •Protivazebné orbitaly se značí σ*, π* … •Celkové orbitální kvantové číslo Λ je analogií celkového vedlejšího kvantového čísla L u atomů. •Λ respektuje přítomnost více než 1 elektronu na dané hladině a platí Λ = Σ λi Výběrová pravidla Symbolika a členění molekulových orbitalů •Značení orbitalů pro Λ = 0, 1, 2, 3, 4, … se provádí velkými písmeny Σ, Π, Δ, Φ, Γ analogicky ke znační atomových orbitalů S, P, D, F, G. •Celkové spinové kvantové číslo S = Σ si •Multiplicita termu (hladiny) je 2S + 1 •Energetická hladina se zapisuje jako 2S+1 Λ, tedy konkrétně 2Σ, 3Σ, 2Π, 2Δ. •Molekulové orbitaly se rozdělují podle symetrie vůči počátku souřadnic umístěnému uprostřed mezi oběma atomy (sudé a liché funkce). •Sudé molekulové orbitaly se označují dolním indexem g (gerade), liché orbitaly u (ungerade). Výběrová pravidla Symbolika a členění molekulových orbitalů •Kombinace atomových orbitalů vazebný protivazebný 1s 1s protivazebný vazebný 1s Σg (s σg) 1s Σu (s σu) + - + ® - + ® + + + + Výběrová pravidla Symbolika a členění molekulových orbitalů •Přechody jsou možné: Øgerade ® ungerade (g ® u) Øungerade ® gerade (u ® g) Ø Derivační spektrofotometrie D1 D3 Derivační spektrofotometrie 1. derivace Přesné určení polohy maxim λmax širokých absorpčních pásů a inflexních bodů Derivační spektrofotometrie 2. derivace Přesné určení polohy maxim a minim λmax a λmin širokých absorpčních pásů a inflexních bodů Derivační spektrofotometrie •S rostoucím n sudé derivace klesá šířka centrálního Gaussova píku •Sudé derivace mají vždy centrální pík s alternujícím znaménkem, který koinciduje s původním píkem(λmax) • W0 W2 W4 - 34 W6 6 + 41 W4 4 - 53 W2 2 + 100 W0 0 Orientace ústřeního píku W (%) Pološířka FWHM Derivace n Derivační spektrofotometrie •Lichá derivace (n+1) stupně jakožto derivace n-té derivace obsahuje maximum a minimum. •Velikosti maxima a minima jsou rovny směrnicím tečen v inflexních bodech n-té derivace. •Užší = strmější profil tedy poskytuje větší amplitudu jako rozdíl y-souřadnic mezi max. a min. liché derivace D1, D3. •Čím užší pík, tím strmější křídla Gaussova profilu, tj. větší absolutní hodnota směrnice v inflexním bodě. Amplituda Dn n-té derivace je nepřímo úměrná n-té mocnině šířky píku W. T D1 D3 Derivační spektrofotometrie •Derivace Lambert-Beer-Bouguer zákona = •zvýšení citlivosti: A = ε·l·c •Amplituda n-té derivace Dn je úměrná koncentraci •S rostoucím stupněm derivace roste citlivost jakožto směrnice k kalibrační přímky •λinflex, S,L je vlnová délka inflexního bodu při kratší (S) a delší (L) části spektra S λinflex, S λinflex, L T λinflex, S λinflex, L D Derivační spektrofotometrie •Velikost derivace v inflexních bodech profilu píku je nezávislá na velikosti pozadí, pokud je v rozsahu Δλ šířky absorpčního pásu přibližně konstantní. •Derivováním spekter superponovaných na zvýšeném pozadí korigujeme pozadí a zvyšujeme poměr S/B, podstatný pro určení meze detekce •Derivace absorpčních pásů na šikmém pozadí (rozptyl záření) umožňuje určit přesnou vlnovou délku λmax. Derivační spektrofotometrie NBW = 40 nm Δλmax = 30 nm Obálka 2 křivek - rozlišení Derivační spektrofotometrie Při stejné absorbanci (výška píku) dává užší pás větší amplitudu D=Δ(dA/dλ) ]lepší citlivost ]odlišení od širšího pásu. Derivační spektrofotometrie Korekce vlivu rozptýleného záření Derivační spektrofotometrie •Zlepšení rozlišení překrývajících se absorpčních pásů ] –Odhalení pásů příslušejících nečistotám –Přesné určení λmax širokých absorpčních pásů •Zvýšení citlivosti měření •Eliminace pozadí –Rayleighova rozptylu –Konstantního pozadí (v závislosti na λ) –Neselektivní absorpce matrice •Zlepšení poměru signál/pozadí Derivační spektrofotometrie •Tvorba derivačních spekter •1) Elektronicky: výstupní napětí proporcionální absorbanci je diferencováno vzhledem k času – vhodné pro skenující monochromátory: –Analogové derivační obvody: •Zesilovač •Derivační členy RC •Pásové filtry pro redukci šumů určitých frekvencí •Kombinace derivačních členů pro vyšší derivace •Analogová derivační spektrofotometrie – •zvýšení citlivosti ve srovnání s „klasickou fotometrií“ 5n – násobné, kde n = řád derivace x každý RC-člen snižuje poměr S/N faktorem 2. Derivační spektrofotometrie •Elektronická tvorba derivačních spekter – diferencování vzhledem k času: Derivační spektrofotometrie •Tvorba derivačních spekter •2) Opticky: rychlá modulace λ záření ] do kyvety; •Modulace λ = rychlé změny λ, periodické skenování ±λ v malém intervalu Δλ; Δλ<< FWHM absorpčního pásu. Derivační spektrum – jako funkce času (konstatní rychlost skenu dλ/dt ) se měří elektronickým diferenciačním členem Derivační spektrofotometrie •Tvorba derivačních spekter – opticky a)Modulace λ: provedení modulace vlnové délky: i.rychlým periodickým skenem monochromátoru ±λ ii.kmitající planparalelní destičkou (posun paprsku) iii.oscilací vstupní nebo výstupní štěrbiny (změna úhlu dopadu paprsku na mřížku) •střídavý fotoproud ~ změně Φ v úzkém intervalu Δλ: •1.derivace spektra ~ 1. harmonická fotoproudu (AC) •2.derivace spektra ~ 2. harmonická fotoproudu (AC) Derivační spektrofotometrie •Tvorba derivačních spekter – opticky •b) Dvouvlnová spektrofotometrie: spektrometr se dvěma monochromátory, které skenují simultánně s rozdílem Δλ= 1 až 5 nm. Dva monochromatické paprsky procházejí střídavě kyvetou (rotující sektor, zrcadlo). • Derivační spektrofotometrie •Tvorba derivačních spekter •3) Matematicky: v současné době nejvíce používáno •Aproximace 1. derivace: polynom, Savitzky-Golay