Dvoudimenzionální elektroforéza Hana Konečná CENTRÁLNÍ LABORATOŘ - PROTEOMIKA CEITEC – Středoevropský technologický institut NCBR – Národní centrum pro výzkum biomolekul PřF proteinový vzorek komplexní směs peptidů komplexní proteinový vzorek jednoduchý směs peptidů jednoduchá databáze identifikace kvantifikace 2D GE proteinové čipy multiD-LC MS MS/MS charakterizace modifikace shotgun bottom-up proteinový vzorek komplexní směs peptidů komplexní proteinový vzorek jednoduchý směs peptidů jednoduchá databáze identifikace kvantifikace 2D GE proteinové čipy multiD-LC MS MS/MS charakterizace modifikace shotgun bottom-up Dvoudimenzionální elektroforéza 2-DE ? Proteomický experiment extrakce fokusace SDS-PAGE digest MS identifikace neznámý protein HOMOGENIZACE • mechanicky • ultrazvukem • tlakem • zmražením / rozmražením • detergentovou lyzí PŘÍPRAVA VZORKU solubilizace močovina, thiomočovina, detergenty redukce DTT, TBP inhibice proteáz, fosfatáz, glykosyláz odstranění kontaminant MĚŘENÍ KONCENTRACE PROTEINU žádný celkový náboj 0.5 – 4% použitelné ve vysokých koncentracích močoviny neionogenní zwitterointové SDS jen v nízkých koncentracích (do 0.25%) DETERGENTY C7BzO 3-(4-Heptyl)phenyl-3-hydroxypropyl)dimethylammoniopropanesulfonate CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate CHAPS C7BzO E.coli ZÁKLADNÍ PRAVIDLA zabránit proteolýze jednoduchý postup čerstvé reagencie čerstvý vzorek odstranit pevné částice - centrifugace odstranit kontaminanty KONTAMINANTY soli, zbytky pufrů malé endogenní molekuly iontové detergenty nukleové kyseliny polysacharidy lipidy fenolické látky 2-DE • první rozměr • druhý rozměr IEF SDS-PAGE 1. ROZMĚR IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE migrace nabitých částic v gradientu pH v elektrickém poli IZOELEKTRICKÁ FOKUSACE • imobilizovaný pH gradient • amfolyty + + + - - - ROZSAH STRIPU ROZMĚR STRIPU ROZSAH STRIPU MW pI 3 - 10 NL pI 4 - 7 denaturace SDS • redukce DTT • alkylace IAA • EKVILIBRACE STRIPU 2. ROZMĚR SDS-PAGE migrace aniontů v elektrickém poli podle MW STRIP GEL + - + FOKUSACE SDS-PAGE - ekvilibrace 2-DE INSTRUMENTACE Protean IEF Protean Dodeca Cell Densitometer GS-800 FLA-7000, STORM PDQuest, Quantity One Protean Plus Dodeca Cell Mini-Protean 3 Dodeca Cell Protean II xi Cell DETEKCE PROTEINU • gel x blot • visualizace barvení radioaktivita imunodetekce • barvení v gelu • po elektroforéze • před elektroforézou • specifické pro protein • specifické pro PTM • viditelné spektrum • fluorescence Sypro Ruby Coomassie silver 1.4 ng 36 ng 0.6 ng DETEKCE PROTEINU V GELU PTM specifická barvení • kvalitativní • kvantitativní ANALÝZA OBRAZU 2D or not 2D ? vizuální aspekty reprodukovatelnost dynamický rozsah extrémní proteiny (membránové,basické...) nesnadná automatizace postdigesční extrakce MULTIDIMENZIONÁLNÍ CHROMATOGRAFIE velké objemy vzorku možnost koncentrace na koloně membránové proteiny, basické proteiny není nutno barvit peptidy – přímo na MS automatizace vizuální aspekty ztraceny: pI a Mr LC - sériová analýza GE současně pro více vzorků PROTI PRO Difference Gel Electrophoresis DIGE BIOMARKERY … jehly v kupce sena prefrakcionace separace identifikace srovnání kontrola vs.vzorek • seno - proteiny bez vztahu k onemocnění • jehly - specifické proteiny pro onemocnění • potenciální jehly obtížně validovatelné • které jehly dále zkoumat? • často PTM, neidentifikovány MS • hledání obtížné a neefektivní Den 21 – před klinickým projevem Den 44 – po klinickém projevu Biomarkery v lidské plasmě separace identifikace DIGESCE • IN-GEL • IN-SOLUTIONtrypsin Glu-C Asp-N thermolysin MAVEPFPRRPITRPHASIEVDTSGTGGSAGSSE KVFCLIGQAEGGEPNTVYELRNYAQAKRLFR SGELLDAIELAWGSNPNYTAGRILAMRIEDAK PASAEIGGLKITSKIYGNVANNIQVGLEKNTLS DSLRLRVIFQDDRFNEVYDNIGNIFTIKYKGEE ANATFSVEHDEETQKASRLVLKVGDQEVKSY DLTGGAYDYTNAIITDINQLPDFEAKLSPFGD KNLESSKLDKIENANIKDKAVYVKAVFGDLE KQTAYNGIVSFEQLNAEGEVPSNVEVEAGEES ATVTATSPIKTIEPFELTKLKGGTNGEPPATWA DKLDKFAHEGGYYIVPLSSKQSVHAEVASFV KERSDAGEPMRAIVGGGFNESKEQLFGRQAS LSNPRVSLVANSGTFVMDDGRKNHVPAYMV AVALGGLASGLEIGESITFKPLRVSSLDQIYESI DLDELNENGIISIEFVRNRTNTFFRIVDDVTTFN DKSDPVKAEMAVGEANDFLVSELKVQLEDQF IGTRTINTSASIIKDFIQSYLGRKKRDNEIQDFP AEDVQVIVEGNEARISMTVYPIRSFKKISVSLV YKQQTLQA MS IDENTIFIKACE HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE • ionizátor, analyzátor, detektor • hmotnost/náboj • MALDI generuje ionty z pevné fáze • ESI generuje ionty z kapalné fáze databáze identifikace 1 20 0 17 00 2 20 0 m/ z 50 0 1 00 0 1 50 0 2 00 0 2 50 0 a. i. alpha-1-antiproteinase, antitrypsin Score 83 potvrzeno na MALDI-TOF/TOF MS Score 239 Neoznačené píky: keratiny nebo autolýza trypsinu KERATINY ! ! ! Potlačení ionizace G I G O GARBAGE IN - GARBAGE OUT G I G O • R.M. Twyman: Principles of Proteomics • R.Westermeier, T.Naven, H-R Höpker: Proteomics in Practice • A.J.Link: 2D Proteome Analysis Protocols • Current Protocols in Protein Science • R.J.Simpson: Proteins and Proteomics • T.Rabilloud: Proteome Research: Two-dimensional Gel • Electrophoresis and Identification Methods • A. Görg, W. Weiss, M.J.Dunn: Proteomics 2004, 4, 3665, rev. • I. Miller, J. Crawford, E. Gianazza: Proteomics 2006, 6, rev. • F.Chevalier: Proteome Science 2010, 8:23, review • R. Burgess, M. Deutscher: Guide to Protein Purification LITERATURA II. PREFRAKCIONACE 10 000km 100km 10km 10cm 1 000km 1km 100m 10m 1m 1cm vzorek solubilizace deplece/obohacení 2D GE prefrakcionace digesce in-gel směs peptidů odsolení MALDI-MS ESI-MS ESI-MS/MS separace RP-HPLC nebo CE PMF fragmentační spektrum PST identifikace proteinu odstranění abundantních proteinů afinitní chromatografií HSA IgG AFINITNÍ DEPLECE Apolipoprotein Immunoglobulin kappa light chain Immunoglobulin light chain albumin Lidská plazma - vázaná frakce po afinitní depleci ALBUMIN IgG Barvení: CB G-250 CPPL Combinatorial Peptide Ligand Library PROTEOMINERPREFRAKCIONACE PREFRAKCIONACE MicroRotofor OffGel Fractionator IEF • prefrakcionace v roztoku • prefrakcionace v roztoku na IPG stripu offgel pivo 70 proteinů OFFGEL IEF prefrakcionace proteinů nebo peptidů digest směsi proteinů IEF směsi peptidů na IPG stripu frakce stripu IPG-IEF SDS 8M Urea Peptides DTT IAA spin spin spin incubation spin proteins nucleic acids Lysate 8M Urea Ammonium Trypsin SDS DTT IAA bicarbonate PROTEINS PEPTIDES Nature Methods 6, 359 - 362 (2009) Filter Aided Sample Preparation FASPFASP Filter aided sample preparation PREFRAKCIONACE MIKRO ROZSAHY pI GELOVÁ CHROMATOGRAFIE INSPIRATIVNÍ LITERATURA PRO MÍRNĚ POKROČILÉ Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: A tutorial Thierry Rabilloud et al. Journal of Proteomics 2011 Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: past, present and future Thierry Rabilloud et al. Journal of Proteomics 2010 Proteomic biomarker discovery: It's more than just mass spectrometry Josip Blonder et al. Electrophoresis 2011 For all the complex problems and difficult questions there is always one simple, easily comprehensible w r o n g answer.