1 Analýza obrazu Gabriela Lochmanová CENTRÁLNÍ LABORATOŘ – PROTEOMIKA CEITEC – Středoevropský technologický institut NCBR – Národní centrum pro výzkum biomolekul Přírodovědecká fakulta Studijním ateriály ? Experiment • Stanovení cíle experimentu Definice jasně stanovených otázek – cílů • potvrzení hypotézy • soustředění se na úzce vymezený problém Stanovení počtu a typu replik • umožňují statistické zpracování experimentálních údajů Způsob detekce Kontrolní vzorky, standard Biologické • Zahrnutí biologické diverzity - repliky prezentovány různými vzorky téhož typu X rostlinek Arabidopsis, X různých pacientů se stejným typem nádoru apod. Technické • Zahrnutí chyb metody (reprodukovatelnost) - stejný vzorek v několika replikách Studijním ateriály Biologické repliky Technické repliky Studijním ateriály ? Experiment • Stanovení cíle experimentu • Příprava vzorku • 2 DE • Detekce Studijním ateriály • Detekce Obecné požadavky na vizualizaci proteinů • široký lineární rozsah závislosti intenzity barvičky na množství proteinu v gelu • kompatibilita s následnými analýzami (např. stříbro - glutaraldehyd!) • vysoká citlivost Dynamický rozsah = graf závislosti intenzity barvičky (osa y) na koncentraci proteinu (osa x) Barvení stříbrem – lineární závislost pouze v rozmezí do 100 ng proteinu. Při vyšších množstvích odklon od linearity. • kvantitativní barvení • end-point • trvanlivost (např. zhášení fluorescenčních barviček!) Studijním ateriály 6 • Detekce Typy detekce • fosforylace: Pro-Q Diamond (pSer, pThr, pTyr), Pierce phosphoprotein staining kit (pSer, pThr) glykosylace: Pro-Q Emerald, Pierce glycoprotein staining kit • Radioaktivní značení Značení před analýzou (DIGE – CyDye, radioaktivní značení) Barvení po analýze Specifické barvení: post-translační modifikace (PTM) Nespecifické barvení: všechny proteiny • Viditelné barvení: Coomassie brilliant blue (R250, G250), stříbro (kyselá x amoniakální varianta) • Fluorescenční barvení: Sypro Ruby (Ex/Em = 280, 450/610 nm), Lucy (Ex/Em = 506/520 nm), Flamingo Pink (Ex/Em = 512/535 nm), Oriole (Ex/Em = 270/604 nm), Krypton (Ex/Em = 520/580), Deep Purple (Ex/Em = 365, 520/610 nm), Lumitein (Ex/Em = 280, 450/610 nm) Studijním ateriály POZADÍ – 3D náhled Koloidní CCB Stříbro SYPRO Ruby • Detekce Studijním ateriály Při analýze obrazu pracujeme s denzitou barvičky. • Detekce Proteinový spot – 3D náhled Koloidní CCB Stříbro SYPRO Ruby Studijním ateriály ? Experiment • Stanovení cíle experimentu • Příprava vzorku • 2 DE • Detekce • Snímání obrazu Studijním ateriály • Snímání obrazu Signály z biologických vzorků jsou konvertovány do digitálních dat v odstínech šedé barvy • formát TIFF, vysoké rozlišení Přístroje pro snímání obrazu Volba přístroje dle použitého typu detekce proteinů • Viditelné barvičky : denzitometry • Fluorescenční barvičky: fluorescenční skenery, kamery Ex/Em spektrum se musí shodovat s Ex/Em charakteristikami přístroje PharosFX™ and PharosFX Plus Systems Molecular Imager GS-800 Fuji FLA-3000 Typhoon 9200 Imager Image Scanner III S. Ruby: Ex/Em: 280, 450/610 nm Studijním ateriály ? Experiment • Stanovení cíle experimentu • Příprava vzorku • 2 DE • Barvení • Snímání obrazu • Analýza obrazu Studijním ateriály • Analýza obrazu Analýza pomocí speciálního SW • Porovnání a vyhodnocení 2D gelů (vizuální vyhodnocení 2D gelů není možné) Kvalitativní vyhodnocení Kvantitativní vyhodnocení Statistická analýza Přístup dle předem stanoveného cíle • Výběr spotů, které se významně liší podle daného „designu“ experimentu (srovnání ovlivněný vzorek x kontrola – detekce „up and down“ regulovaných proteinů) • Výběr pouze několika velmi významných spotů, které budou případně použity jako budoucí marker Studijním ateriály • Analýza obrazu • Vývoj – kontinuální proces • Spolehlivost • Reprodukovatelnost • Automatizace • Srovnání gelů různých velikostí, tvarů • Nesmí modifikovat „raw“ data Přesná a správná práce v laboratoři je základem experimentu. Sebelepší SW nedovede ze špatných podkladů vytvořit dobré výsledky. Špatné vyhodnocení může zmařit předchozí dobrou práci. • Různé typy SW se liší: filozofií, stupňem možností zasahovat do vyhodnocení, možnostmi statistických vyhodnocení, cenou. • Příklady SW: Delta 2D, ImageMaster, Melanie, Progenesis, PDQuest, Redfin Ludesi SW Výsledky analýzy jsou ovlivněny: • kvalitou a filozofií daného programu • uživatelem - manuální editace Studijním ateriály 14 • Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuestu Sejmutí obrazu Úprava obrazu – velikost, orientace Identifikace spotů Přiřazení spotů („matching“) a jejich porovnání Normalizace Analýza dat Report Studijním ateriály • Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuestu Sejmutí obrazu Úprava obrazu – velikost, orientace Identifikace spotů Přiřazení spotů („matching“) a jejich porovnání Normalizace Analýza dat • velké rozlišení (tiff) • všechny srovnávané gely musí mít stejnou velikost Report Studijním ateriály 16 • Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuestu Sejmutí obrazu Úprava obrazu – velikost, orientace Identifikace spotů Přiřazení spotů („matching“) a jejich porovnání Normalizace Analýza dat Report • Spot detection wizard – průvodce nastavením parametrů pro vyhledání spotů a odfiltrování pozadí • Různé gely – různé parametry nastavení Studijním ateriály • Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuestu Detekce spotů a filtrace pozadí • Scanset = soubor obrazů, které vycházejí z jednoho základního gelu (3 zobrazení každého gelu) Filtered GaussianRaw 2D image Studijním ateriály • Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuestu • Kvantita spotu = celková intenzita definovaného spotu v daném zobrazení gelu (pro výpočet se používá gaussovské zobrazení) - koresponduje s množstvím proteinu v aktuálním spotu Studijním ateriály • Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuestu Sejmutí obrazu Úprava obrazu – velikost, orientace Identifikace spotů Přiřazení spotů a jejich porovnání Normalizace Analýza dat • Matchset = soubor gelů porovnávaných navzájem v rámci experimentu • Master gel = uměle vytvořený gel, zahrnuje spoty ze všech srovnávaných gelů Report Studijním ateriály • Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuestu Sejmutí obrazu Úprava obrazu – velikost, orientace Identifikace spotů Přiřazení spotů a jejich porovnání Normalizace Analýza dat Editace spotů Report Studijním ateriály • Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuestu Sejmutí obrazu Úprava obrazu – velikost, orientace Identifikace spotů Přiřazení spotů a jejich porovnání Normalizace Analýza dat Replikativní skupiny • máme-li 2 a více gelů od jednoho vzorku (repliky) • umožňují seskupit kopie gelů daného vzorku a určit průměrnou kvantitu každého spotu • analýza gelů v replikách je podmínkou pro aplikaci statistických nástrojů (např. Student T-test) Report Studijním ateriály • Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuestu • Replikativní skupiny Studijním ateriály • Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuestu Sejmutí obrazu Úprava obrazu – velikost, orientace Identifikace spotů Přiřazení spotů a jejich porovnání Normalizace Analýza dat • Normalizace = kompenzace rozdílů ve velikosti spotů a intenzitě mezi gely, které nesouvisí s expresí • nutná podmínka pro správné srovnání kvantity spotů • Variace způsobené různými faktory: - chyby pipetování během přípravy vzorku - chyby při přípravě a zpracování vzorku - ztráta vzorku během přenosu na gel (precipitace) - nekonzistence v barvení/značení - nekonzistence při snímání obrazu - ….. • Normalizační faktor (dle zvolené metody) • Total quantity in analysis set • Total quantity in valid spots • Total density in gel image • Specified value • Mean of log ratios • Local regresion model Report Studijním ateriály • Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuestu Sejmutí obrazu Úprava obrazu – velikost, orientace Identifikace spotů Přiřazení spotů a jejich porovnání Normalizace Analýza dat • Analytický set = soubor spotů vybraných pro studium - umožňuje vytvářet soubory spotů se statistickou a biologickou významností • Kvalitativní • Kvantitativní • Statistické (pouze pro replikativní skupiny) • Booleovy • Výběrové • Matching Report Studijním ateriály • Analýza obrazu Vyhodnocování pomocí PDQuestu • Kvalitativní • Kvantitativní • Statistické • Booleovy • Výběrové • Matching Studijním ateriály • Analýza obrazu Sejmutí obrazu Identifikace spotů Normalizace Analýza dat Úprava obrazu – velikost, orientace Přiřazení spotů a jejich porovnání Report Vyhodnocování pomocí PDQuestu Studijním ateriály • Analýza obrazu • Report Image report Quantity Table report Quantity Graph report Vyhodnocování pomocí PDQuestu Studijním ateriály ? Experiment • Stanovení cíle experimentu • Příprava vzorku • 2 DE • Barvení • Snímání obrazu • Analýza obrazu • Vyřezání spotů Studijním ateriály Manuálně (skalpel, spot picker) • viditelné barvičky • fluorescenční barvičky - transiluminátor Automaticky • Spot cutter • Vyřezání spotů OneTouch Plus spot picker Exquest UV-transilluminator (Ex: 302, 365 nm) Ettan Spot picker Dark Reader (Ex: 490 nm) Xcise Studijním ateriály ? Experiment • Stanovení cíle experimentu • Příprava vzorku • 2 DE • Barvení • Snímání obrazu • Analýza obrazu • Vyřezání spotů • Digesce • Identifikace • Cíl experimentu ?? Studijním ateriály Děkuji za pozornost.Studijním ateriály