Environmentální analytická chemie Analytická chemie životního prostředí Laboratorní cvičení 2013 4.úloha: Extrakce microcystinů ze vzorků vody metodou SPE Určení a cíl Zakoncentrování microcystinů ve vzorcích s nízkou koncentrací pro jejich následné analytické stanovení pomocí HPLC-DAD (kapalinová chromatografie s UV-VIS detekcí) Princip Microcystiny ze vzorku se zachytávají na povrchu pevného sorbentu. Následně jsou převedeny do malého množství organického rozpouštědla a tento roztok je připraven pro analýzu microcystinů na HPLC. Bezpečnost při práci a toxikologické údaje Vzorky vod, extrakty biomasy sinic = rizikový materiál potenciálně obsahující cyanotoxiny! Methanol – jedovatý! Kyselina trifluoroctová – silná žíravina! Kyselina chlorovodíková – silná žíravina! Při práci s evakuovanou aparaturou používat ochranné pomůcky (brýle) a dodržovat veškeré zásady bezpečnosti. Chemikálie a spotřební materiál - 100% methanol – potřebné roztoky o koncentraci 20% a 50% (v/v) připravit smícháním čistého methanolu a destilované vody - kyselina trifluoroctová (TFA) – potřebný roztok o koncentraci 0,1%TFA v methanolu připravit smícháním čistého methanolu s TFA (v/v) - 1% kyselina chlorovodíková - roztok thiosíranu sodného (c=10g/L) - GF (glass fiber) filtry (0,45µm) - SPE kolonky se sorbentem C18 - čisté 1.5 mL skleněné vialky, víčka, septa - střička s destilovanou vodou Přístroje - filtrační aparatura Nalgene DS0320 - aparatura pro SPE - elektrická membránová vývěva - rotační vakuová odparka - pH metr 4. A Postup práce příprava vzorků - vzorky přefiltrovat přes GF filtr (0,45µm) - přidat methanol v množství do 10% celkového objemu (v/v) vzorku. V případě vyššího obsahu organického rozpouštědla zředit vzorek destilovanou vodou tak, aby koncentrace organického rozpouštědla nepřesahovala 10% (v/v) - filtrát okyselit přidáním HCl na pH~6, pH zkontrolovat pomocí pH metru - přidat 1mL roztoku thiosíranu sodného (c=10g/L) aktivace a ekvilibrace SPE kolony - pokyny ke konkrétním typům kolon jsou uvedeny na příbalových letácích od výrobce - v případě použití kolon Supelclean LC-18 3ml Tubes postupovat takto: aktivace 5ml 100% methanolu (bez použití podtlaku) ekvilibrace 5ml vody (možno použít podtlak) - v průběhu aktivace, ekvilibrace a přetahování vzorku kolona nesmí vyschnout ! (nad horní fritou musí být stále alespoň 5mm kapaliny) přetažení vzorku - vzorek přetáhnout za použití podtlaku (15mm Hg), průtok 5ml/min - po přetažení vzorku sušit kolonu proudem vzduchu (10min) - vysušenou kolonu promýt 5ml 20% methanolu eluce analytu - eluci provést 5ml roztoku 0,1%TFA v methanolu, za použití podtlaku (5mm Hg) - eluát v případě potřeby skladovat v mrazáku (-18°C) zakoncentrování eluátu - eluát odpařit do sucha na rotační vakuové odparce (teplota lázně = 45°C) - odparek rozpustit v 500µl 50% methanolu a převést do vialky - vzorky ve vialkách před analýzou skladovat v mrazáku (-18°C) 4. B Stanovení microcystinů v lyofilizované biomase sinic Princip Navážka lyofilizované biomasy sinic je extrahována solventem za působení ultrazvuku. Buněčný debris je oddělen centrifugací, supernatant je zfiltrován a připraven pro analýzu microcystinů. Bezpečnost při práci a toxikologické údaje Vzorky vod, extrakty biomasy sinic = rizikový materiál potenciálně obsahující cyanotoxiny! Methanol – jedovatý! Při práci s ultrazvukovým homogenizátorem používat tlumítka zvuku a dodržovat veškeré zásady bezpečnosti. chemikálie a spotřební materiál - 50% aq. methanol - 1.5 mL Eppendorfovy mikrozkumavky - plastová stříkačka 1 mL + jehla - stříkačkové nylonové filtry (0.45 μm) - čisté 1.5 mL skleněné vialky, víčka, septa - denaturovaný ethanol, střička s destilovanou vodou přístroje - analytické váhy - pipeta 100-1000 μL - vortex - ultrazvukový homogenizátor nebo lázeň - centrifuga Postup práce příprava vzorků - do Eppendorfovy zkumavky navážit cca 20 mg lyofilizované biomasy (zaznamenat přesnou navážku) - přidat pipetou 1 mL 50% aq. methanolu a důkladně vortexovat - extrahovat pomocí ultrazvukového homogenizátoru (2 x 20 s, cycle 0.8 x 10%, power 90%), mezi oběma extrakcemi nechat vzorek vychladnout - centrifugací oddělit buněčný debris (maximální otáčky, 10 min) - supernatant přefiltrovat pomocí stříkačky a filtru do skleněné vialky - vzorky před analýzou skladovat při -18°C