Nukleární magnetická rezonance Gradientní NMR spektroskopie Selekce signálů • homogenita magnetického pole - kdyby nebylo magnetické pole homogenní, vykazovala by jádra stejného typu v různých pozicích vzorku rozdílné precesní frekvence a tím i rozdílné chemické posuny (rozšířeni signálu) • homogenita je nastavena cívkami kolem vzorku - upravují pole v osách x, y, z a jejich kombinacích • magnetické pole může v čase fluktuovat => je potřeba ho zastabilizovat -lokování "locking" např. na signál deuteria, které je přítomné v nějakém množství v rozpouštědle (např. D20) • řízená a přesně definovaná nehomogenita může být využita k selekci signálu Gradienty X v případě homogenního magnetického pole se vektory reprezentující různé pozice v kyvetě posunou za čas t o stejný úhel a (stejná frekvence) v případě nehomogenního mag. pole se vektory posunou o různý úhel (různá frekvence) 90 x T Selekce signálů • výběr signálu páru 1H - 13C a eliminace nebo rozfázování 1H - 12C — fázové cykly 90° 1H 90° 180° «C 4-' AíAa i ■■ y V t r-i- 1/2J 1/2J 13C - pulzní gradient magnetického pole 1/2J MIIÍAAAaa. GP G Selekce signálů • výběr signálu páru 1H - 13C a eliminace nebo rozfázování 1H - 12C — fázové cykly 1H 13c 90° 1/J 'H 13C 90° 180° 1/2J B 1/2J Selekce signálů Výběr signálů pomocí fázových cyklů k vývoji kaplingu dochází jen pro pár 1H - 13C (ne pro 1H - 12C) měření dvou spekter (A a B), sečtení/odečtení není perfektní kvůli experimentálním nepřesnostem - zbytkové signály 1H - 12C Selekce signálů • výběr signálu páru 1H - 13C a eliminace nebo rozfázování 1H - 12C - pulzní gradient magnetického pole 90c 1/2J 1/2J 13C GP Selekce signálů Výběr signálů pomocí gradientů • signály 1H - 12C se rozfázují v rovině pomocí gradientu G • 90°y sklopí 1H - 13C signály do osy x - během 1/2J zrefokusují • výhody - žádné artefakty vznikající odečtem spekter (viz. předchozí obr.) • měření jednoho spektra - rychlejší akumulace signálu Gradienty x x v případě homogenního magnetického pole se vektory na všech pozicích v kyvetě posunou za čas t o stejný úhel a gradientem o intenzitě G uměle vygenerujeme nehomogenní magnetické pole a dojde k různému vývoji v jednotlivých částech vzorku po dobu trvání G G Gradienty Oz = PytgBg Oz - fázový posun P - řád koherence (SQ, DQ) y-magnetogyrická konstanta Tg - doba trvaní gradientu Bg - intenzita gradientu X O = 0 - suma fází musí být nulová pro refokusaci signálu HSQC s gradienty (gs-HSQC) nastavení gradientů : splnění podmínky £ O = 0: HSQC: P1 = P2 (SQ), tx = t2, Bx = B2 =^> poměr gradientů se řídí poměrem y ^(pro1H-13CGl:G2 4:l) GP G1 G2 Gradienty • HMQC: Gl-DQ, G2-ZQ, G3-SQ Ti = T2 = T3 0 = 0 = (yc+Yh)g1 + (Yc-Yh)G2 + ("Yh)G3 Pro lH"13c/ naPř: G1:G2:G3 = 5:3:4 (l+4)*5 + (l-4)*3 + (-4)*4 = 0 13c 90 180 AAAaam— dl d2 ti/2 t,/2 9C G1 G2 G3 • použití gradientů je velmi významné pro 1H-13C HMBC v přirozeném zastoupení, kde se jinak při fáz. cyklech odečítá kolem 97-98 % signálu -> tl šum • nezbytné pro 15N - v přirozeném zastoupení 3x méně než 13C (0.37 % vs. 1.11 %) Gradient-Enhanced 1H-15N HMBC HMQC s gradienty 15 14 11,17-13 1! 20 8,16-23 12 4 1 2 22,3 oh 6 i. jllJuJuL Iii •1 o o o * e o O o o i ■ < <*> o ft o T" 4 2 - 40 ■ - 60 80 h 100 -120 Sc HMBC s gradienty 10 3D spektra 2D • 2D experimenty - dvě dimenze -> FT dvou časových proměnných - FID (t2) a inkrementační čas tľ • 2D spektrum - rovina, kde je interakce dvou jader zobrazena jako vrstevnice 3D 3D experimenty - přidán třetí časový vývoj (druhá inkrementační perioda) FID (t3) a inkrementační čas tx a t2 • 3D spektrum - kostka, kde je interkace jader zobrazena jako bod uvnitř kostky 3D spektra • 3D spektrum - kostka, kde je interkace jader zobrazena jako bod uvnitř kostky • každý rozměr kostky představuje jednu frekvenční (časovou) proměnnou • vhodné pro velké molekuly, biomolekuly • kombinované experimenty HMQC-COSY, HMQC-TOCSY 3D HMQOCOSY 'H dl pi d2 p2 d2 p3 d3 p4 d2 t,/2 p5 t,/2 d2 t2 p6 aq nc n n n P7 p8 P9 1,5 §H GARP rovina h,h pri 6C=42,5 ppm 5^ 0 iT12 o- 23 IS 11 18 11 17 Jl JLLJi * 1 t 0 Ô e t) ft T" 3 -1—i—i—i—t—t—t—j—i—1—r—i—i—i—9—i—t— 3D Gradient-Selected HSQC-TOCSY 'H x x y 11 i i 11 I ir 11 i i I dlpld2p2d2p3d3 p4 P5 d2 p6 dl h mlcv]6 aq X X X X J6 GARP p7 pS t,/2 t,/2 p9 plO field gradients A rv g2 rovina h,h pri 6C=26,7 ppm % 7 \ 7 8. 14, 9 I 13 >■ 11 ^12*0 20 21 22 23 15 15 i lJL 1 # 1 1 3 Gradient-Selected HMQC-TOCSY 'H dl pi d2 IJ2 p2 IJ2 d3 p5 p6 d4 p7 aq field gradients P3 gl g2 GARP 4 g3 12 23 16 8 20 23 IS 11 18 20 15 14 11 37 35 13 IL 0 o 11 0 0 f ft 0 # Ö & • V 1 1»