Nukleární magnetická rezonance NMR spektroskopie pevného stavu NMR pevné fáze, MOTIVACE CrystEngComm, 2005, 7, 1-19 NM R pevné fáze, MOTIVACE CrystEngComm, 2005, 7, 1-19 NMR pevné fáze MOTIVACE Carbon-13 CPMAS spectra of nifedipine (VI). Top: crystalline form I. Bottom: amorphous J. Pharm. Pharmacol. 2007, 59: 225-239 NMR pevné fáze, MOTIVACE Polymorph is a solid crystalline phase of a given compound resulting from the possibility of at least two crystalline arrangements of the molecules of that compound in the solid state. W.C. McCrone, in Physics and Chemistry of the Organic Solid State, Vol. 2, Interscience, New York, p. 725, 1965. NMR pevné fáze, MOTIVACE Potenciálně rozdílné fyzikální a chemické vlastnosti mezi polymorfy, solváty a amorfní fází: - fyzikální a termální vlastnosti (hustota, refrakční index, teplota tání, volná energie a chemický potenciál, termální stabilita, rozpustnost) - spektroskopické vlastnosti (vibrační, rotační, elektronové a NMR vlastnosti) - kinetické vlastnosti (řád rozpustnosti, stabilita, kinetika reakcí v pevné fázi) - povrchové vlastnosti (plocha povrchu, distribuce velikosti částic) - mechanické vlastnosti (tvrdost, komprese, tepelná expanze, charakteristika vysychání) - chemické vlastnosti (chemická a fotochemická reaktivita) Pevná fáze vzorky v podobě monokrystalů, práškové formě (mikrokrystaly) či amorfní fáze omezen molekulární pohyb - anizotropie chemického posunu, výrazný efekt přímé dipolárnía kvadrupolární interakce 100% koncentrace vzorku spektra „přesycena'' informacemi - vývoj technik ssNMR pro jejich extrakci Interakce jaderného spinu energie interakce spinu reprezentovaného operátorem Tz s okolím vyjadřují jednotlivé členy spinového hamiltoniánu H Vnější pole Para magnetická interakce RF pole Bx (RF pulz) Nepárový elektronový spin Indukované pole elektronové —1 ustoty Elektron Magnetický dipól druhého jádra Kvadrupól jádra Přímá spin-spinová interakce Hnn Pole generované pohybem molekuly D-konstanta Nepřímá spin-spinová interakce = J-coupling H, V-konstanta Anizotropní interakce v pevné fázi - CST Jaderné magnetické stínění Stínící konstanta - tenzor XX O xy Lab 0 °1 PAF o = o yx O yy °yz diagonalizace s 0 0 = ť7PAF ? °zx °zy ,0 0 ^33 J ^XX °: i0' Bind ~ Vy* 0 K^zx {.BoJ 11 Bmá,z-°zzBa PRÍČINY ANIZOTROPIE CHEMICKÉHO POSUNU ■ PPAF 33 Laboratorní kartézská souřadná soustava nahrazena hlavními osami (PAF = principle axes frame). • omezený molekulární pohyb plně nekompenzuje nesférický charakter elektronové hustoty molekul • různé orientace mikrokrystalů v práškovém vzorku Gu0 = +cr22 +cr33) izotropní stínění Anizotropní interakce v pevné fázi - CST Jaderné stínění Kubická symetrie - magický úhel Chemický posun v práškovém spektru ASYMETRICKÁ MOLEKULA AXIÁLNĚ SYMETRICKÁ MOLEKULA PRÍČINY ANIZOTROPIE CHEMICKÉHO POSUNU • omezený molekulární pohyb plně nekompenzuje nesférický charakter elektronové hustoty molekul • různé orientace mikrokrystalů v práškovém vzorku Anizotropní interakce v pevné fázi - DD spinový pár 15N - 1H v axiálně symetrickém okolí -práškové spektrum • v pevné fázi se díky omezenému pohybu interagujících spinových párů projevuje přímá dipolární interakce (dosah 10 Ä) • prášková spektra odpovídají náhodným a v čase konstantním orientacím mezijaderného vektoru r/s vůči směru B0 • signál je v ideálním případě rigidního krystalu štěpen na Pakeův dublet odpovídající a a P stavu interagujícího partnera Závislost signálu na orientaci izolovaného spinového páru Rotace vzorku pod magickým úhlem 9 = 54.7° kubická symetrie systému: v čase se všechny orientace vlivem rotace zprůměrují do hodnoty magického úhlu - vynulování členu (3cos20 -1) potlačení heteronukleární dipól-dipólové interakce a složky anizotropie chemického posunu —> zúžení signálů resp. rozpad práškového spektra na jednotlivé rotační signály Rotace vzorku pod magickým úhlem - MAS poskytnout informace o anizotropii jaderného stínění resp. chemického posunu - určení složek tenzoru ô Rotace vzorku pod magickým úhlem e) • rozlišené reziduálni rotační signály mohou poskytnout informace o anizotropii jaderného stínění resp. chemického posunu - určení složek tenzoru ô 250 200 150 100 50 0 «<-J/ppm Heteronukleární dekapling DD = -^^(3cos20-lU Att r, is I Š nÁs) )-/ s z z z z < cu u OJ > cu 500 Hi Stat.c COOH 1H decoupling <- CH 13kHi CH2 | 5 KHZ l . .1 2 to . t l l i .t . ... .i_._. O 10 kfU 13 C spektrum práškové směsi glycinu a alaninu i JL O -10 Mk • umožňuje téměř zcela potlačit heteronukleární dipolární interakce v ss NMR spektru • založen na kontinuálním ozařování interagujícího jádra, např. 1H rezonance, 180° pulzy o stejné fázi —> rotace magnetizace způsobí vyprůměrování spinové složky HDD do nulové hodnoty Anizotropní interakce v pevné fázi • v homonukleárním spinovém páru (např. 1H-1H) hamiltonián dipolární interakce navíc zahrnuje skalární součin vektorů operátorů magnetizace • podmínka zachování celkové energie systému nebrání přenosu energie v okamžiku synchronního flip-flop přechodu mezi dvěma interagujícími jádry o blízké rezonanční frekvenci • jde o koherentní velmi rychlý proces přenosu magnetizace prostorem, homonukleární interakce proto zapříčiňuje tzv. spinovou difúzi D-interakce vs. 7-interakce Přímá spin-spinová interakce Nepřímá spin-spinová interakce šíří se přes prostor - přímá interakce jaderných dipólů velikost závislá na orientaci mezijaderného vektoru vůči vnějšímu magnetickému poli uplatňuje se v pevné fázi popř. orientovaných mediích v podobě reziduálního dipolární interakce v roztoku důležitý relaxační mechanismus - NOE zprostředkována valenčními elektrony nezávislá na orientaci ani velikosti vnějšího magnetického pole uplatňuje se v roztoku, v pevné fázi překryta intenzivnějšími DD popř. kvadrupolárními interakcemi magnituda v řádu desítek Hz magnituda v řádu desítek kHz Anizotropní interakce v pevné fázi Kvadrupolární interakce Zeeman -(3cos26>-l) -(35cos46>-30cos26> + 3) 2 8 projevuje se u jader s jaderným magnetickým spinovým číslem s > 1/2 - jaderný spin se může vyskytovat ve 2s + 1 energetických stavech tato jádra mají nesférickou distribuci jaderného náboje - kvadrupólové štěpení rezonančního signálu způsobí interakce magnetického momentu s gradientem elektrického pole kvadrupólové štěpení dosahuje až řádů MHz a jeho závislost na orientaci spinového systému vůči B0 je popsána vedle harmonické funkce i složkou druhého řádu, MAS neumožňuje zcela odstranit (double rotation) Q=yHB1H Q=ycB íc Křížová polarizace Cross-Polarisation (CP) LH 15 13C hnací silou je přímá dipól-dipólová interakce, využívá tendence magnetizace proudit z vysoce polarizovaného systému (velké yu např. 1H) do systému málo polarizovaného (malé ys, např. 13C) rezonanční podmínku lze pro heteronukleární spinový pár splnit díky Hartman-Hahnovu experimentu - založen na současném ozařováním obou jader r/ poli o odpovídajících frekvencích, což vyvolává precesní pohyb obou spinu kolem směru těchto polí, amplitudy těchto rf polí jsou nastaveny tak, aby došlo k vyrovnání frekvencí obou precesních pohybů a ustavení tzv. dipolárního kontaktu v homonukleárním systému je flip-flop cross-polarizační přechod podstatou spinové difúze Cross-polarizační (CP) experiment LH 13C Q=yHB1H Q=ycB íc 90° pulzem je excitován 1H vysoce polarizovaný spinový systém během CP periody jsou magnetizace obou systému udržovány ve shodném směru rf polí (spin-lock) bez vývoje chemického posunu - polarizace se přesouvá z 1H do 13C spinového systému během akvizice 13C signálu je DD interakce potlačována dekaplovací pulzní sekvencí na 1H CP experiment představuje významný stavební blok řady pulzních sekvencí v ssNMR - umožňuje až lOOOx zvýšení citlivosti n/2 13C CP/MAS experiment CP B IH B ic Decoupl lig I 9 = 54.7' Kombinace CP experimentu a rotace pod magickým úhlem (MAS) MAS - eliminace anizotropních interakcí CP - zvýšení citlivosti CP/MAS- základ sofistikovanějších experimentů v pevné fázi Dekapling během akvizice - eliminace štěpení 13C NMR spekter jádrem 1H Kubická symetrie - magický úhel CP/MAS experiment • intenzita DD interakcí mezi 1H a 13C závisí na prostorové blízkosti jader a rychlosti reorientace mezijaderného vektoru vůči B0 klesá v řadě: CH2 > CH > CH3 (rotace) > C (vzdálené protony) • (A) Během spinového echa dojde k rozfázování koherence signálu CH2 a CH vlivem DD interakce, jež je v těchto spinových systémech nejrychlejší. • (B) Na inverzi fáze CP spinlokovacího bloku 1H rezonance nejrychleji reagují CH2 skupiny - inverze signálů, následované CH (signál po optimalizaci blízko nule) . 2D ssNMR spektroskopie HETCOR INADEQUATE n/2Homonukleární decoupling 13C CP ]p~ Decouplig CP 13c Např: • DD interakce: 1H - 13C korelační heteronukleární experiment HETCOR • J-interakce: 13C-13C INADEQUATE, HMQC-V-MAS korelace CSA a DD interakce: orientované systémy- PISEMA ssNMR spektroskopie Rotory -Zr02