Nukleární magnetická rezonance
Řešení prostorové struktury molekul
Homogenizace magnetického pole -
shimování
• vliv okolí a nehomogenního vzorku - B0 různé v jednotlivých částech vzorku - různé rezonanční frekv.
-CH2-
Homogenizace magnetického pole -
shimování
• homogenní B0 - shodné rezonanční frekvence pro stejné atomy, např. CH2 skupina v EtOH.
B
o
-CH,-
B
o
■CH
B
o
-CH,-
-CH-
Správně nashimovaný vzorek
homogenní B0
Homogenizace magnetického pole -
shimování
• homogenita se docílí korekčními, tzv. shimovacími cívkami
• korekční cívky jsou umístěny kolem vzorku v různých směrech
Homogenizace magnetického pole
shimování
y2x2
xzJ
B0
2V2
Bf
Stabilizace magnetického pole -lockování ("locking")
• B0 se mění v čase
• pro stabilizaci B0 se používá tzv. field lock
• korekce B0 podle změny polohy signálu 2H
Stabilizace magnetického pole -
lockování
rezonancn
pozice
deuteria
při změně mag. pole - změna rezonanční frekvence
přístroj indukuje přídavné pole v opačném směru a vrátí rezonanční frekvenci napůvodní hodnotu
• pro měření 2H, lockování na 19F
Stabilizace magnetického pole-lockování ("locking")
Průřez NMR spektrometrem
			i	1	li
4					
izolační vrstva ^
vnitřní Dewarova ^ nádoba pro hélium
vnější Dewarova ^ nádoba pro dusík
plnění hélia
plnění dusíku
k supravodivá * cívka
N M R ky vety
Klasické kyvety
Klasické kyvety
• průměr: 1, 3, 5,10 mm
• délka: 7 - 8 palců
• objem vzorku pro 5 mm kyvetu 500-600 til
• vyrobeny z borosilikátového skla
Shigemi
• velikosti stejné jako klasické kyvety
• cca poloviční objemy - 200-300 |il pro 5 mm
• vysoké dno, do kyvety se zasouvá pístek
• vyrobeny jsou z materiálu s podobnou magn. susceptibilitou jakou má roztok
NMR sondy
kyveta se vzorkem se pouští do sondy
obsahuje cívky laděné na frekvenci jednoho nebo více jade při daném magnetickém poli
další cívka zabezpečuje gradientní pulzy
jsou konstruovány pro různou velikost NMR kyvet
kryosondy - prostor cívek je chlazen asi na 20K -> zvýšena citlivost cívky díky snížené úrovni tepelného šumu
Vývoj NMR spektrometrů
25.00 —i
S 20.00
(ň
o
Q.
O 'S
<D C O)
S
o
15.00 -A
10.00
OJ 5.00
>
0.00
900 +
800
750
600
27
500
470.
400 36<T +
300 ♦
200
30 40 60
i   i   i~r~ i" | ; i   i   i—i——I—r
1950    1955    1960    1985    1970    1975    1980    1985 1990
1995    2000     2005 2010
Rok uvedení na trh
Řešení struktury
• Konstituce
— vzájemné vázání atomů
— H-H interakce přes 2-4 vazby - COSY, TOCSY
— H-C jednovazebné interakce - HETCOR, HSQC, HMQC
— H-C interakce přes 2-4 vazby - LR-HETCOR, HMBC
— C-C jednovazebné interakce - INADEQUATE
• Konfigurace, konformace
— konfigurace na dvojných vazbách
— určení dihedrálních úhlů
— H-X-Y-H interakční konstanty-dihedrální úhly
— NOE - meziatomové vzdálenosti
— chemický posun
Řešení struktury
Dihedrální úhly
• Karplusova rovnice:   3JIS = A ■ cos2 O + B ■ cos O + C
• velikost ./-interakční konstanty závisí m.j. na torzním úhlu mezi interagujícími atomy
• konstanty A, B, C závisí na typu interagujících atomů
J-konstanta   rozsah hodnot (Hz)
A
B
W3C) (13C,13C) PN/H) (15N,13C) (WH) ('H^C)
(WH) ('H^C)
125-250 30-80 70-110 2-20 -20-5 -10-15
0- 18
1- 10
Studium konformací
Karplusova rovnice
- pro popis konformace molekuly
- umožňuje získat hodnoty dihedrálních ůhIú
3jIS = A ■ cosz O + B ■ cos O + C
-1-1-1-h-
0° 90° 180° 270° 360c
cis trans cis
Studium konformací
relativní zastoupení a a ß anomeru anisotropní efekt anomerních
D-glukopyranosy v roztoku protonu
Dihedrální úhly
1,2-disubstituované ethany:
}(trans)    >      J(c/s)       >  J(gauche) >J(90°)
*0
H
alkeny:
i(trans) > i(cis)
3)(trans): 14-20 Hz
H
cyklohexan v židličkové konformaci:
Haa)    >      Hae)    ~ j(ee) H H
3J(c/s): 6-14 Hz
}{aa): 10-16 Hz O ~ 180°
J(ae)~J(ee):3-5 Hz O * 60°
Dihedrální úhly
konfigurace na dvojné vazbě:
C2H5 —O
CH(CH3)2
3J(c/'s): 6 Hz
3J(ůrans): 13 Hz
CH(CH3)2
konfigurace na dusíku s volným elektronovým párem:
H
HOH^N): ~ 14 Hz
Meziatomové vzdálenosti
• využití NOE interakcí
• NOE klesá se šestou mocninou meziatomových vzdáleností (NOE~ 1/r6)
• pro malé, rychle rotující molekuly: NOE > 1
• pro velké, pomalé molekuly, ve viskózních rozpouštědlech: NOE < 1
-i
Měření NOE
A:
180°s 90'
	tm	
		
selektivní inverze
B:
90'
<-►
1
diferenční spektrum A-B:
NOE výstavbová křivka
• intenzita NOE závisí na směšovacím čase tm
• měřením NOE při různých časech tm získáme výstavbovou křivku
• čím delší je tm, tím je NOE menší v důsledku podélné relaxace a spinové difúze
i
max
Spinová difúze
u sousedících spinu ve vzorku dochází ke krizové relaxaci
ozáření jádra 1 indukuje pozitivní NOE na jádru 2 a dále negativní NOE u jádra 3
oo
28%
O O
-13%
Výpočet vzdálenosti
směrnice a výstavbové křivky v bodě 0 -rychlostní konstanta křížové relaxace
nutné zvolit vhodné tm, aby ještě nedocházelo ke spinové difúzi
H
O
max
rab-známa, referenční vzdálenost rac - měřená neznámá vzdálenost o - rychlostní konstanta křížové relaxace
°ab>°ac 00 rab 6
rac = rab * OW^ac)176
1.2 1.4 1.6 1.8
22 2.4 2.6 2.6
Výpočet vzdálenosti
4a OMe 4a 2,58 Ä OMe
0 200 400 600 800 1000
mixing time
Výpočet vzdálenosti
zjednodušený přístup na základě intenzit signálů zjištění intenzity NOE
- integrace
xvi • r\        i      v •       ,       •       f i      v xv \
- výska signálu (pri stejné polosirce) h
rab = rref
ab 'ac
_i_
lac °^ rac
-6
^ac ~ ^ref * O-ac/^-ref) ^
Relativní citlivost NMR experimentů
ID experimenty
Množství vzorku (mg)
13C pH}
13C DEPT
ID 13C-13C INADEQUATE
0,004
4
5
75
2D experimenty	Množství vzorku (mg)
il-PH COSY	0,5
delayed COSY	1
phase-sensitive COSY	1
HETCOR	10
long-range HETCOR	20
HSQC, HMQC	2
HMBC	4
NOESY	8
homonuclear 2D 7-resolved	1
heteronuclear 2D7-resolved	40
2D 13C-13C INADEQUATE	300
Přibližně pro 12ti hodinové měření na 400 MHz spektrometru
DOSY
Diffusion-Ordered Spectroscopy
90 180