DEGRADACE PROTEINŮ V EUKARYOTICKÝCH BUŇKÁCH Lucie Kozáková PROTEOLÝZA = systém kontroly kvality proteinů Typ abnormality Příčina Nedosyntetizovaný protein mutace, inkorporace puromycinu, předčasná terminace, proteolytické štěpení Nesmyslný protein mutace, inkorporace AMK analogů, chyba v syntéze proteinu Volné podjednotky vícepodjednotkového komplexu nadměrná syntéza podjednotek Postsyntetické poškození kyslíkové radikály, intracelulární denaturace Genové inženýrství genová fúze, posun čtecího rámce, nesprávná lokalizace Špatně sbalené proteiny Intracelulární podmínky, které poškozují buněčné proteiny: • Teplota 37°C a vyšší (denaturační podmínky) • Enzymy modifikující proteiny (proteázy, kinázy) • Vysoká koncentrace solí (podporuje disociaci multimerů) • Mnoho mastných kyselin (fungují jako detergenty) • Nesbalené proteiny – vznikající polypeptidy, poškozené a mutantní polypetidy a nerozpustné inkluze mohou agregovat Proteiny se buňkách degradují různou rychlostí: • minuty - regulační enzymy • dny-týdny – aktin, myozin v kosterních svalech • měsíce – hemohlobin v červených krvinkách 2 typy degradace Lysozomální (proteázy v acidické organele) Cytozolická (v proteazomech) J Am Soc Nephrol 17: 1807-1819 (2006) http://faculty.muhs.edu/klestinski/cellcity/lysosomedata.htm Lysozomální degradace lobjev 1949 – belgický cytolog Christian de Duve lvelikost 0,1-1,2 µm lbuněčný trávící systém – enzymy pro všechny typy biologických makromolekul (proteiny, NK, uhlovodíky, lipidy) lvzniká fúzí transportních váčků vzniklých z GA s pozdním endozomem, který se tvoří endocytózou z plazmatické membrány lvakuolární struktura obsahující hydrolytické enzymy, které optimálně fungují v kyselém pH (cca 40 typů hydrolytických enzymů – nukleázy, fosfatázy, glykozylázy, lipázy, proteázy….) lkyselé pH udržují protonové pumpy lenzymy jsou syntetizovány jako prekurzory v ER a odtud přeneseny do GA l Figure 9.35. Organization of the lysosome. The Cell: A Molecular Approach. 2nd edition. (2000) lDegradace intracelulárních komponent l se označuje rovněž termínem autofagie Experimantal Gerontology 40 (2005) 622-633 • aktivují se za stresových podmínek (zj. hladovění) • MATG se aktivuje v ranných stádiích hladovění (4-6h v játrech), CMA se aktivuje po >6h (je selektivní, čímž se zabrání rozkladu esenciálních buněčných komponent při delším hladovění) • může produkovat antigenní peptidy prezentované na MHC II molekulách, rozpoznávané CD4+ lymfocyty (aktivace produkce protilátek) CYTOZOLICKÁ DEGRADACE V PROTEAZOMECH lvelký multienzymatický komplex (není to organela) na degradaci proteinů lcíleně degraduje proteiny označené polyubiquitinací l (4 a více) 26S proteazom 2004 Nobelova cena za chemii – objev ubiquitin-proteazomální degradace proteinů Avram Hershko, Aaron Ciechanover, Irwin Rose Struktura 26S proteazomu lSkládá se ze 2 subkomplexů: l20S centrální část (core particle) – vykazuje katalytickou aktivitu l19S regulační část (regulatory particle) Struktura 26S proteazomu l20S centrální část ltvar soudku → složen ze 4 spojených kruhů → 2 identické vnější α kruhy a 2 vnitřní β kruhy lkaždý kruh je složen ze 7 různých podjednotek → obecně lze složení zapsat jako: α1-7β1-7 β1-7 α1-7 lproteolyticky aktivní místo na β podjednotkách lα podjednotky obklopují vstup pro substrát a výstup pro produkt l19S regulační část lsložena nejméně z 18 různých podjednotek, které tvoří subkomplex báze (base) a víčka (lid) lvíčko obsahuje podjednotky, které váží ubiquitinované řetězce a 2 deubiquitinační enzymy (izopeptidázy) odstraňující ubiquitiny (recyklace) lbáze obsahuje 6 ATPáz přiléhajících k vnějšímu kruhu 20S lATPázy vážou proteiny, které mají být degradovány a za hydrolýzy ATP je rozbalují a translokují do 20S Architektura proteazomu Lander et al, Nature, 2012 Průběh degradace 1.substrát určený k degradaci se naváže na 19S, kde se odštěpí polyubi řetězec a rozpadne se (ubiqutin se recykluje) 2.ATPázy linearizují sbalený protein (esenciální pro vstup do 20S, globulární proteiny jsou příliš velké) a zároveň regulují otvírání vstupního kanálku do 20S 3.po vstupu substrátu do centrální části, je polypeptid štěpen 6 proteolytickými místy (2 štěpí preferenčně za hydrofobními aa, 2 za bazickými aa, 2 za kyselými aa) na krátké peptidy 4.peptidy jsou uvolněny z proteazomu a jsou degradovány cytozolickými endopeptidázami a aminopeptidázami na jednotlivé aa a využity pro syntézu nových proteinů či metabolizmus J Am Soc Nephrol 17: 1807-1819 (2006) Imunoproteazom lexprimuje se v odpovědi na γ-INF lhybridní 26S částice: PA28-20S-19S lštěpí odlišně od 26S → tvoří větší frakci peptidů schopných sloužit jako antigenní prekurzory (8-9 zbytků) ldelší peptidy jsou transportovány do ER pomocí TAP (transpotrer associated with antigen processing), kde se nachází aminopeptidáza ERAP1 (endoplasmic reticulum aminopeptidase 1) → odštěpuje přebytečné aa z peptidových prekurzorů a zastaví se na 8-9 zbytcích (přesná délka pro vazbu na MHC I molekuly, rozpoznávané cytotoxickými CD8+ lymfocyty) l l TAP – transporter associated with antigen processing ERAP1 – endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 J Am Soc Nephrol 17: 1807-1819 (2006) Inhibitory proteazomu lBORTEZOMIB lprvní lék cílený proti proteazomu schválený pro aplikaci u lidí (mnohočetný myelom) latom boru se specificky, s vysokou afinitou váže do katalytického místa 26S proteazomu l lMG132 lsilný, membránově propustný linhibuje specificky proteazomální peptidázy ChT-L (chymotripsin-like peptidase) lpo delším působení se aktivuje JNK-1 kináza, která iniciuje apoptózu jako odpověď na buněčný stres l Ubiquitin l= APF1 – ATP dependentní proteolytický faktor l76 aa velký protein lkovalentně se pojí k cílovému substrátu lpřipojuje se k substrátu přes C-terminální glycin k –NH2 skupině vnitřního lysinu substrátu lobsahuje 7 lyz zbytků http://www.rcsb.org/pdb/ Lange et al., Science, 2008 Ubiquitin lmolekula ubiquitinu připojená k substrátu může sloužit jako bod pro připojení dalších molekul ubiquitinu přes tvorbu isopeptidových vazeb mezi C-koncem ubiquitinu s lyzinem další ubiquitinové molekuly Lange et al., Science, 2008 Monoubiquitinace lZapojena nejméně ve 3 odlišných buněčných funkcích: 1.Regulace histonů – mutanti kvasinek, kteří nemají ubiqutinační místa na H2B, nesporulují → monoubi na H2B je potřebná pro meiózu 2.Endocytóza – mnoho proteinů plazmatické membrány je monoubiquitinací downregulovaných do endocytické dráhy → degradace v lysozomech 3.Pučení retrovirů z plazmatické membrány – gag polyprotein běžný u retrovirů, je esenciální pro štěpení membránově vázaných částic během pučení. Uvnitř gag je krátká sekvence – L doména důležitá pro pučení a uvolnění částic. Tato sekvence je bohatá na prolin a může vystupovat jako interakční motif pro E3 ligázu Nedd4. Gag protein je monoubiquitinovaný, což je závislé na L doméně. Polyubiquitinace lmolekulární polibek smrti J (vedoucí k degradaci proteinů) lgeny ubiquitin proteazomálního systému tvoří přibližně 5% genomu ldráha vedoucí k ubiquitinaci substrátu je vícekroková a zahrnuje enzymy: lE1…aktivační enzym lE2…konjugační enzym lE3…specifická ubiquitin ligáza ldeubiquitinační enzymy lJe závislá na ATP! Nalepa et al., Nature Reviews, 2006 Polyubiquitinace lAktivace ubiquitinu 1.tento krok vyžaduje vazbu ATP do ATP-vazebného místa na E1 2.adenylace C-konce volného ubiquitinu enzymem E1 3.rychlý cis transfer ubiquitinu vázaného na E1 z AMP do aktivního místa cysteinu na E1 s následným uvolněním AMP 4.adenylace další molekuly ubiquitinu stejným E1 1. lVazba E2 konjugačního enzymu l přenos aktivovaného ubiquitinu z aktivního cysteinu E1 na katalytický cystein E2 l Nalepa et al., Nature Reviews, 2006 Polyubiquitinace lPolyubiquitinace l E3 (ubiquitin ligáza) rozpozná substrát a zároveň komplex E2-Cys-Ub → dochází k přenosu ubiqutinu na Lys substrátu a polyubiquitnaci → substrát se z E3 uvolní, je rozpoznán proteazomem a následně degradován http://www.youtube.com/watch?v=jo8gx61BR-Y Nalepa et al., Nature Reviews, 2006 Typy E3 ubiquitin ligáz lSpecificky určují, který substrát bude ubiquitinovaný l l3 hlavní třídy: lRING (Really interesting new gene)-finger E3 lHECT (homologous to E6-AP COOH terminus)-domains E3 lU-box E3 E6 protein kódovaný lidskými papilomaviry, cílí p53 pro degradaci v proteazomu. Vyžaduje k tomu ještě E6 assiciated protein (E6-AP) a společně poskytují protein ligázovou aktivitu při přenosu ubi na p53 RING-finger E3 ligázy lobsahují 7 cysteinů a 1histidin nebo 6 cysteinů a 2 histidiny, které drží dva atomy zinku v charakteristické konformaci (do kříže) l l2 velké podtřídy: ljednoduché RING-finger E3 – na stejném polypeptidu obsahují RING finger doménu i doménu pro vazbu substrátu l lcullin-base RING-finger E3 – využívají RING box protein 1 (RBX1) a RBX2 v komplexu s různýmy cullin-dependentními substrátovými proteiny Nalepa et al., Nature Reviews, 2006 RING-finger E3 ligázy lMDM2 lhlavní ubiquitin ligáza p53 („ochránce genomu„ - zabraňuje mutagenezi a následně karcinogenezi zástavou buněčného cyklu nebo apoptózou, asi 50% všech lidských nádorů obsahuje mutaci v genu p53) lonkogenní RING-finger protein, jehož exprese je transkripčně indukována proteinem p53 → negativní smyčka (MDM2 degraduje p53) lMDM2 ovlivňuje p53 nejméně 3 mechanismy: lfyzicky blokuje N-terminální transaktivační doménu p53 lpodporuje transport p53 z jádra, což ho udržuje daleko od jeho cílových genů lubiquitin – dependentní degradací lmůže působit působit jako ubiquitin ligáza i pro jiné antionkogenní proteiny lvyskytuje se jako homodimer MDM2/MDM2 nebo jako heterodimer MDM2/MDMX RING-finger E3 ligázy lSCF ubiquitin ligázy l= SKP1-Cullin-F-box lmultipodjednotkový komplex, který využívá specifický faktor (F-box) k rozpoznání substrátu (obvykle fosforylovaný) lkomplex obsahuje: lCullin (CUL) – slouží jako kostra při uspořádávání ubiqutinové mašinerie a substrátu lRBX – RING finger protein, interaguje s C-koncem CUL1, interaguje s E2 konjugačním enzymem lSubstrátově specifický modul – rozpoznává a váže substrát llidský genom obsahuje přibližně 68 F-box proteinů a každý cílí substrát pro degradaci Nalepa et al., Nature Reviews, 2006 RING-finger E3 ligázy lAPC/cyklozom (Anaphase promoting complex) l1,5MDa komlex (nejméně 13 podjednotek – obsahuje i cullin a RING podjednotku, vzdálený příbuzný SCF ligáz) ls APC/C přechodně asociují E2 enzymy UBCH5 nebo UBCH10 laktivita závisí rovněž na koaktivátorech (obsahují typické sekvence: C-box, IR tail – zprostředkují vazbu k APC/C, WD40 doména – rozpoznává substrát pro APC/C) – např. CDC20 (cell division cycle homologue 20), který je aktivní od prometafáze do telofáze lv metafázi APC/CCDC20 iniciuje ubiquitinaci securinu (malý protein, funguje jako co-chaperon a jako inhibitor separázy) → aktivovaná separáza štěpí Scc1 podjednotku kohezinu (drží sesterské chromatidy pohromadě), což umožňuje rozchod sesterských chromatid l Nalepa et al., Nature Reviews, 2006 U-box E3 ligázy lU-box motif je strukturně podobný RING-finger doméně a váže E2 enzymy lU-box neváže ionty kovu, prostorovou konformaci určují intramolekulární vodíkové vazby lCHIP (carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein) – důležitý pro odstraňování abnormálních proteinů jako je špatně sbalený CFTR u cystické fibrózy a tau proteiny (polyglutamin repeat proteiny), které se vyskytují u některých neurodegenerativních chorob lmálo prozkoumané HECT E3 ligázy lHECT doména (homologous to E6-AP COOH terminus) byla poprvé objevena u ubiquitin ligázy p53, E6-AP, která asociuje s E6 HPV (human papillomavirus) onkoproteinem a cílí p53 pro degradaci v buňkách exprimujících HPV-E6, ale ne v neinfikovaných (dalším substrátem pro degradaci je např. proto-onkogen c-myc) lmutace kolem aktivního místa E6-AP – Angelmanův syndrom (Happy puppet, Angel child) – mentální retardace, tuhá, nemototrná chůze, absence řeči, nadměrný smích, záchvaty lrole v HPV indukované rakovině děložního čípku – HPV16 a HPV18 jsou vysoce onkogenní díky degradaci p53 a přispívají maligní transformaci epiteliálních buněk děložního čípku N-terminální katalytická doména (obsahuje aktivní místo cysteinu-žlutě) ohybová doména Ubc vazebná doména Ubc7 Protoonkogen – strukturní gen euk. buňky, jehož produkt se podílí na regulaci dělení buněk a jejich diferenciace Onkogen – protoonkogen pozměměný nebo aktivovaný tak, že vyvolává nádorovou transformaci buněk onkoprotein – je produktem exprese onkogenu Příklady HECT E3 ligáz l nrm2690-f1 Rozdíl mezi HECT a RING E3 ligázami lRozdíl v přenosu ubiquitinu na substrát: lHECT – obsahují konzervovaný katalytický cystein, který funguje jako akceptor ubiquitinu z E2. Ubiquitin je následně přenesen na specifický lyzin substrátu lRING – fungují jako „lešení„, které usnadňuje interakci mezi E2 a substrátem Nature Reviews Molecular Cell Biology 10, 398-409 (June 2009) SUMO lsmall ubiquitin-related modifier lubiquitin-like protein lzapojen do řady buněčných procesů jako transkripce, struktura chromatinu, opravy DNA lpodobně jako ubiqutin (neproteolytický) reguluje lokalizaci proteinů a aktivitu, ve většině případů reguluje protein-proteinové interakce lu savců 4 homology (SUMO-1, -2, -3, -4) lobvykle fungují jako monomery (SUMO-1, -2, -3 tvoří polymery in vitro, funkční relevance in vivo nebyla pozorována) GENES & DEVELOPMENT 18:2046–2059 SUMO lvazba na substrát jako u ubiquitinu – kovalentní připojení k substrátu přes isopeptidovou vazbu mezi C-koncem glycinu SUMO a lyzinem substrátu lpouze jeden E2 konjugační enzym – Ubc9 lmodifikace proteinů SUMOylací i ubiquitinací je dynamický a reverzibilní proces lSUMO specifické proteázy – štěpí SUMO prekurzory i odstraňují SUMO ze substrátu (kvasinky:Ulp1 → lidské homology: SENP1, SENP2, SENP3, SENP6 GENES & DEVELOPMENT 18:2046–2059 SUMO GENES & DEVELOPMENT 18:2046–2059 SENP1 SENP2 SENP3 – nucleolus SNP6 – cytoplasma SUMO lproteiny mohou být modifikovány SUMO nebo UBI, často s odlišnými následky lv některých případech SUMO kompetuje s UBI nebo acetylací na lyzinovém zbytku NEDD8 lhraje kritickou roli při aktivaci E3 cullin-RING ligáz – kovaletním připojením NEDD8 k jádru cullinu → nedynylace lNEDD8 – 9KDa, E1 – NAE (AppBp1/UBA3), E2 – UBC12, UBE2F lnedynylace cullinů umožňuje správné prostorové uspořádání těchto ligáz pro vazbu E2-E3 komplexu vyžadovaného pro ubiquitinaci substrátu lprvním krokem nedynylace je aktivace NEDD8 – lidská deneddyláza 1(DEN1)/SENP8 – odstraňují 5aa z C-konce NEDD8 prekurzoru ldenedylace cullin-RING ligáz je zprostředkována přes COP9 signalozom (CSN) lCAND1 – váže denedylovaný cullin, blokuje vazebné místo pro adaptory a NEDD8 a působí tak jako inhibitor cullinů, balanc mezi nedylací a denedylací může být ovlivněn dostupností adaptorových proteinů a substrátu, např. vyšší hladina Skp2 a p27 substrátu zvyšuje hladinu nedylovaného CUL1 (vyšší hladina Skp2 způsobuje překonání inhibičního efektu CAND1) NEDD8 NEDD8 Onemocnění spojené s poruchami degradace proteinů lneurodegenerativní choroby: lHuntingtonova choroba – na základě genetické informace se tvoří proteiny, které obsahují opakující se sekvence glutaminů za sebou, které nejsou katalytická místa v proteazomu schopna štěpit – glautaminové sekvence se hromadí jako toxické, intraceleulární inkluze lParkinsonova choroba – tvoří se agregáty α-synleucinu (cytozolický presynaptický protein) v neuronech, mohou být selektivně odstraněny v lysozomech (pomocí chaperon-zprostředkované autofagie). U Parkinsona se vyskytuje mutantní forma α-synleucinu, která se váže na lysozomy, ale není do nich přenesena lAlzheimerova choroba – selhání makroautofagie, v autofagických vakuolách se hromadí Aβ-amyloidní peptidy (toxické produkty proteolýzy při AD) a ukládají se v mozku lneschopnost aktivovat makroautofagii je běžnou vlastností některých typů rakoviny prsu a vaječníků (nerovnováha mezi syntézou a degradací proteinů) lakumulace lipofuscinu v lysozomech (intralysozomální negradovatelný pigment), obvykle je známkou stárnutí, je spojován různými onemocněními sítnice, včetně makulární degenerace lve stáří se snižuje proteazomální aktivita v orgánech jako je srdce, plíce, játra, ledviny a CNS, což přispívá k akumulaci poškozených proteinů a chorobám spojeným s touto akumulací http://www.philgalfond.com/wp-content/uploads/ethics-scale.jpg Be balanced…J