SYLICa přednáška
Johanne M. Murray
(Sussex University, Genome Damage and Stability Centre)
SMC5-6 complex and replication stress
24.4. v 10.00 – A11, 205
Povinná přednáška

Metody analýzy proteinových komplexů
•- Gelová filtrace, ultracentrifugace
•- TAP-tag (a jiné tagy) purifikace a MS analýza
•
Metody analýzy protein-proteinových interakcí
- ko-imunoprecipitace, pull-down, ko-purifikace …
- (kvasinkový) dvou-hybridní systém
- BiFC, FRET, ko-lokalizace, ko-exprese
- Flourescenční anisotropie, SPR, ITC …
- ko-krystalizace, cryoEM …
- databáze (interactom a komplexy …)
- genetické metody (syntetická letalita, suprese)
Literatura: Protein-protein interactions, Golemis & Adams, CSHL Press, 2005
doc. J. Paleček: Bi9040 Biologie kvasinek
Dr. C. Hofr: Bi7230 Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii

Metody analýzy proteinových komplexů
Size exclusion.jpg 300px-Superdex_200HR_gel_filtration_column
•- Gelová filtrace (size exclusion chromatography)

GF frakce lyzátu lidských buněk –
podjednotky SMC5-6 komplexu identifikovány pomocí protilátek
- Gelová filtrace (size exclusion chromatography)
Metody analýzy proteinových komplexů

Metody analýzy proteinových komplexů
•ultracentrifugace
analytical_ultracentrifugation300x211 Analytical_ultracentrifugation 3280222_pone
Cukerný/hustotní gradient
Je třeba přesně vyvážit!

Analytical_ultracentrifugation
Cukerný/hustotní gradient
F7
A. Hrubší pouze rozdělí na kompartmenty/organely (S – soluble, M – membranové frakce … jaderná …)
B. Jemný - cukerný gradient
Lee et al, Plant Cell Phys, 2004
Metody analýzy proteinových komplexů
ultracentrifugace

Metody analýzy proteinových komplexů
•- Gelová filtrace, ultracentrifugace
•- TAP-tag (jiné tagy a protilátky) purifikace a MS identifikace
File:Taptag simple.png
MS analýza SDS-PAGE nebo roztoku
Tandem-affinity purification
(vícestupňové – vyšší čistota)
1. calmodulin-binding
(CBP)
2. TEV-proteasové místo (tobacco etch virus)
3. Protein A (váže IgG)
Tagy (myc, HaloTag …)
Zaintegrované v genomu (přirozená hladina proteinu, přirozený výskyt partnerů/komplexu …)
Protein   CBP  A
Puig et al, Methods, 2001
Pozor na kontaminace (např. chaperony)

Metody analýzy proteinových komplexů
•- Gelová filtrace, ultracentrifugace
•- TAP-tag (jiné tagy a protilátky) purifikace a MS analýza
•
File:Taptag simple.png
Tagy (a protilátky):
Myc, FLAG, V5,
S-tag, GFP,
GST, Streptactin, MBP …
Protein   Tag
- ko-imunoprecipitaci lze využít i pro analýzu protein-proteinových interakcí – uměle vnesené
konstrukty (např. transfekce plasmidů do buněk) riziko nepřímých interakcí
Protein A-protilátka

Metody analýzy proteinových komplexů
•Pro stabilní komplexy – nelze použít pro charakterizaci struktury/architektury komplexů a pro
analýzu slabých/přechodných interakcí
•
Metody analýzy protein-proteinových interakcí
- ko-imunoprecipitace, pull-down, ko-purifikace …
- (kvasinkový) dvou-hybridní systém
- BiFC, FRET, ko-lokalizace, ko-exprese
- Flourescenční anisotropie, SPR, ITC …
- ko-krystalizace, cryoEM …
- databáze (interactom a komplexy …)
- genetické metody (syntetická letalita, suprese)

Ko-purifikace
Silné interakce/komplexy – proteiny lze ko-exprimovat (může pomoci s jejich rozpustností) a
následně ko-purifikovat (více Dr. R.  Dopitová)
25
35
40
55
70
1.
15
10
25
35
40
55
70
15
10
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Elution fractions – 10ml
Elution fractions – 1,5ml
Nse3
Nse1
Nse4
1. His-tag purification
2. Strep-tag purification
Nse4
Nse3
Nse1
Nse4 protein se samostatně exprimuje málo a je nerozpustný

Ko-purifikace
Silné interakce/komplexy – proteiny lze ko-exprimovat (může pomoci s jejich rozpustností) a
následně ko-purifikovat
120411N134gelfiltr
15
25
35
40
55
70
Nse1-3-4
Nse1-3
Nse1
Gelová
filtrace
Nse3
Nse1
Nse4

Nse4 protein se dobře exprimuje
(foto-radioaktivita)
Figure1_Promega09042_44949a
PROMEGA – in vitro TNT systém
methionin S35 (pouze 2 partneři)
Pull-down (ko-imunoprecipitace)
Silné interakce
oba proteiny v TNT
Slabé interakce
bait v přebytku (bakt. exprese) a prey v TNT
Palecek et al, JBC, 2006
PAGE
PAGE => Western (anti-GST)

Charakterizace interakcí - domény
Sergeant et al, MCB, 2005
Doyle et al, Mol Cell, 2010
Ubírat či přidávat

Charakterizace interakcí – peptidové mapování
Podobně jako při ELISA
jamky jsou potažené streptavidinem
peptidy se přes biotin ukotví
Lze mapovat epitop pro protilátky (vazbu)
Peptidy jsou na N-konci biotinylované

Charakterizace interakcí – peptidové mapování
Podobně jako při ELISA
jamky jsou potažené streptavidinem
peptidy se přes biotin ukotví
File:Elisa10.jpg

Charakterizace interakcí – peptidové mapování
Nse4 peptidy


Charakterizace interakcí – „alanin scan“
Zjistili jsme jak interaguje Nse4 s Nse3 na detailní úrovni


Metody analýzy proteinových komplexů
•Pro stabilní komplexy – nelze použít pro charakterizaci struktury/architektury komplexů a pro
analýzu slabých/přechodných interakcí
•
Metody analýzy protein-proteinových interakcí
- ko-imunoprecipitace, pull-down, ko-purifikace …
- (kvasinkový) dvou-hybridní systém
- BiFC, FRET, ko-lokalizace, ko-exprese
- Flourescenční anisotropie, SPR, ITC …
- ko-krystalizace, cryoEM …
- databáze (interactom a komplexy …)
- genetické metody (syntetická letalita, suprese)

Uetz and Finley, 2005
Traven et al.: EMBO Report, 2006
Při studiu mechanismů transkripce v kvasinkách S. cerevisiae byl vyvinut tzv. Y2H
Na spínaní/regulaci metabolismu galaktosy se podílí transkripční faktor Gal4p – váže specifické
sekvence v promotorech genů (Gal enzymů) a aktivuje jejich transkripci
Dvou-hybridní systémy (kvasinkové)

Gal4p
Transkripční komplex
Luban & Goff, CO Biotech, 1995
DB
DB
AD
AD
DB
AD
DB
AD
- DNA-vazebná doména (DB) bez
aktivační domény (AD)
není schopna aktivace transkripce
 Je možné propojit domény jakýmkoli
linkerem a transkripci reaktivovat

>

Gal4p
DB
AD
DB
AD

plasmid
(TRP1)
plasmid
(LEU2)
Transformace plasmidů do kvasinek
MaV203 kmen navíc obsahuje URA3 reporter gen – lze tedy selektovat na uracilovou auxotrofii +
reversní systém tj. mutanty disruptující interakce (na FOA)
- Testuje se schopnost růstu kvasinek na médiu bez histidinu (nebo adeninu – červená/bílá)
- lze použít i pro hledání proteinových interakčních partnerů (screen knihovny)
Kvasinkový kmen

His3
His3
Nse3
Nse4

His3
His3


“alanin scan” konzervovaných AMK ukázal hydrofobní kapsu na povrchu Nse3
Do níž se váže hydrofobní šroubovice Nse4 proteinu
Pomocí in silico (MD) analýzy byl vytvořen model dimeru Nse3-Nse4 (docking)

Reversní systém (Y2H)
-Při použití URA3 reportéru lze použít toxickou 5-fluoro-orotátovou kyselinu (5-FOA) k negativní
selekci tj. interakce povede k záhubě kvasinek, zatímco mutanty neschopné interakce na FOA plotnách
porostou (mutanty nebo syntetické látky)
Vidal & Endoh, T in Biotech, 1999
je vhodnější pozitivní selekce (screenovat na rostoucí kvasinky)

Split-hybrid systém
page4-split-hybrid
represor
bez represoru

Klasický dvojhybridní systém
Trojhybridní systém
– heterotrimerní proteinové komplexy
- posttranslační modifikace
Trojhybridní systém
- proteinový inhibitor interakce
Trojhybridní systém
– RNA interakce
- ligand/receptor

Analýza vazby protein-RNA (Y3H)
SenGupta et al, PNAS, 1996
Tři fúzní makromolekuly
(2x protein a 1x RNA)

Vazba ligand-receptor (Y3H)
FK506
Licitra & Liu, PNAS, 1996
dexamethasone
glucocorticoid receptor - FKBP12
Tři fúzní makromolekuly
(2x protein a 1x nízkomolekulární ligand)

CytoTrap 2-hybridní systém
Kvasinkový cdc25-2 ts mutant - hSOS (guanine exchange factor) aktivuje RAS pokud je ukotven na
membránu v jeho blízkosti
- jeden partner je myristylován a ukotven na membránu a druhý (interakční) partner je fúzován k
hSOS
Cell growth
Cur Biol (1998) p. 1121

•- Y2H systémy mají výhodu selekce – přežití kvasinek – je možné je využít pro hledání nových
partnerů
Metody analýzy protein-proteinových interakcí
- ko-imunoprecipitace, pull-down, ko-purifikace …
- (kvasinkový) dvou-hybridní systém
- FRET, BiFC, ko-lokalizace, ko-exprese
- Flourescenční anisotropie, SPR, ITC …
- ko-krystalizace, cryoEM …
- databáze (interactom a komplexy …)
- genetické metody (syntetická letalita, suprese)

File:Fluorescence resonance energy transfer.jpg
Förster/fluorescence resonance energy transfer
File:FRET Jabolinski Diagram.svg

File:Final copy.jpg
Bimolecular fluorescence complementation - BiFC
Propojuje se zpět fold/struktura nikoli 2 domény jako u Y2H
(lokalizace proteinů do tkání, buněčných kompartmentů …)
Pekarova et al, Plant J., 2011

File:Final copy.jpg
Bimolecular fluorescence complementation - BiFC
Protein-fragment complementation
Shekhat & Ghosh, CO in ChB, 2011

Dihydrofolát reduktása/methotrexát
Aktivní DHFR je vytvořena propojením dvou separovaných částí enzymu – odbourává pro kvasinky
toxický methotrexát
Tarrasov et al, Science, 2008
Lze selektovat tj. použít pro screen