‹#› Metody genomiky a proteomiky, Lekce 3 METODY ZALOŽENÉ NA HYBRIDIZACI NUKLEOVÝCH KYSELIN ‹#› 2 http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/nucleic.php HYBRIDIZACE NA Southernův přenos northern blotting (hybr. RNA) slot-, dot-, blot-hybridizace in situ hybridizace ‹#› 3 PŘENOS DNA / RNA NA MEMBRÁNU – KAPILÁRNÍ Příprava gelu před blotováním: DNA: kyselá depurinace (0.25 M HCl) alkalická denaturace (0.4 M NaOH), blotování v NaOH + neutralizace (3 M NaAc, pH 5.5), blotování v 10xSSC RNA: MÍRNÁ denaturace (0.05 M NaOH), blotování ve 20xSSC ‹#› 4 PŘENOS DNA / RNA NA MEMBRÁNU – KAPILÁRNÍ Přenos DNA / RNA na nylonovou membránu: (srovnání s nitrocelulózovou) mechanicky odolná pozitivně nabité membrány, blotting v alkalickém prostředí - kovalentní vazba DNA na membránu (UV crosslink, zapékání při 80°C) vazba krátkých fragmentů (< 50 pb) vyšší pozadí ‹#› 5 PŘENOS DNA / RNA NA MEMBRÁNU – ELEKTROBLOTTING semi-dry blotting: www.frilabo.pt www.isogen-lifescience.com ‹#› 6 PŘENOS DNA / RNA NA MEMBRÁNU – VAKUOVÝ Kimura et al., Nature Protocols 2010 ‹#› 7 HYBRIDIZACE V pufrech s vyšší koncentrací solí, s detergentem (SDS) RNA:RNA > RNA:DNA > DNA:DNA Značená ssRNA: vysoká afinita k homolognímu úseku silný signál X citlivost próby k RNázám ‹#› 8 HYBRIDIZACE Teplota hybridizace: • obsah CG • délka hybridizační próby • homologie mezi próbou a sekvencí na membráně • koncentrace solí • pH • složení hybridizačního pufru (formamid, PEG 6000, dextransulfát) • • CG CG AT t t ‹#› 9 HYBRIDIZACE Teplota hybridizace a koncentrace solí: Vodné roztoky: Tm = 69.3 °C + 0.41(%G+C)°C CG 40% Tm = 85.7 °C CG 45% Tm = 87.5 °C CG 60% Tm = 93.9 °C Roztoky solí (SSC): EffTm = 81.5 + 16.6(logM(Na+)) + 0.41(%G+C) - 0.72(%formamide) 1% „nehomologie“ snižuje Tm o 1.4 °C Teplota hybridizace Tm – 20 °C ‹#› 10 HYBRIDIZACE Formamid: snižuje Tm (hybridizace RNA), hybridizace při ~ 42 °C PEG 6000: Dextran sulfát: Komerční hybridizační pufry: vysoce senzitivní a SPECIFICKÁ hybridizace při nízké teplotě (42 °C) molekuly próby síťují – zvýšení citlivosti (10 – 100x) Próba > 100 pb: hybridizace při ~ 65 °C Oligonukleotidy: hybridizace při ~ 55 °C Stringence: nastavení podmínek hybridizace a odmývání, reflektuje homologii sekvencí a typ próby Vysoká stringence: homologní sekvence (~95%) a delší próby; 0.2xSSC, 65 °C Nízká stringence: 2xSSC, 55 – 65 °C, homologie ~80% ‹#› 11 HYBRIDIZACE RNA: RNA:RNA – vysoká Tm – hybridizační pufry s formamidem, odmývání při vysoké stringenci Všechny reagencie a použité nádobí musí být RNase-free Hybridizace a odmývání: hybridizační pece: Trigon Plus ‹#› 12 HYBRIDIZACE Detekce radioaktivního signálu: fosfo-imagery: energie je „uložena“ ve fotostimulačních krystalech (BaFBr:Eu2+) ground state Eu2+ beta energy stored during exposure energy stored in bromine vacancies unstable state Eu3+ photons of blue light, 390 nm red laser, 633 nm Fuji-Film ‹#› 13 HYBRIDIZACE Detekce neradioaktivního signálu: chemiluminiscence, fluorescence Chemiluminiscenční substrát pro detekci alkalické fosfatázy: CDP Star (Sigma) mfcd02094611 + light AP nestabilní intermediát http://www.sigmaaldrich.com/ ‹#› 14 HYBRIDIZACE Detekce neradioaktivního signálu: chemiluminiscence, fluorescence Chemiluminiscenční substrát pro detekci peroxidázy: Luminol http://www.anthromed.org/Article.aspx?artpk=74 ECL – enhanced chemiluminiscence ‹#› 15 VYUŽITÍ HYBRIDIZACE • PLAQUE HYBRIDIZATION identifikace pozitivních kolonií kolonie na agaru v v otisk na membránu lyze bakterií, denaturace DNA neutralizace prot.K promytí fixace hybridizace se značenou sondou ‹#› 16 VYUŽITÍ HYBRIDIZACE • SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM identifikace záměn jednotlivých nukleotidů Predispozice k chorobám, predikce odpovědi na léčbu SNP v genu pro apolipoprotein E – predispozice pro Alzheimerovu nemoc Bioinformatické databáze pro SNP: dbSNP (NCBI) Human Gene Mutation Database International SNP Map Metody analýzy: sekvenování hybridizace SSCP (single strand conformation polymorphism) RFLP (restriction fragments length polymorphism) ‹#› 17 https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/sscp-analysis DETEKCE SNP • SSCP (SINGLE STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM) ‹#› 18 DETEKCE SNP • RFLP (RESTRICTION FRAGMENTS LENGTH POLYMORPHYSM) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechRFLP.shtml ‹#› 19 DETEKCE SNP • identifikace ekotypů http://www.ecoseeds.com • RFLP (RESTRICTION FRAGMENTS LENGTH POLYMORPHYSM) ‹#› 20 ANALÝZA METYLACE DNA 1.Digesce metylačně citlivou restrikční endonukleázou 2.Elfo na agarózovém gelu 3.Blotting na nylonovou membránu 4.Hybridizace s radioaktivně značenou sondou 5.Detekce signálu ‹#› 21 ANALÝZA METYLACE DNA Fojtová et al., 1998 ‹#› 22 ANALÝZA METYLACE DNA Sma I - CCCGGG Fojtová et al., 2006 ‹#› 23 ANALÝZA DÉLKY TELOMER Terminal restriction fragments (TRF) 1.Štěpení genomové DNA frekventně štěpící RE, která nemá rozpoznávací místo v telomerové repetici (TTAGGG, TTTAGGG) Tru I (Mse I) TTAA Hae III GGCC Rsa I GTAC 2. Elfo na agarózovém gelu 3. Blotting na nylonovou membránu 4. Hybridizace s radioaktivně značenou sodnou (telomerový oligonukleotid) 5. Detekce hybridizačního signálu ‹#› 24 ANALÝZA DÉLKY TELOMER Fojtová et al., 2011 Telomery A. thaliana, ecotype Wassilevskija ‹#› 25 Shakirov and Shippen, 2004 ANALÝZA DÉLKY TELOMER ‹#› 26 ANALÝZA DÉLKY TELOMER Majerová et al., 2011 Telomery TBY-2 (suspenzní tkáňová kultura tabáku) Roberts et al., 2011 Slezina, dospělé myši Izolace vysokomolekulární DNA (HMW DNA), PFGE (pulse field gel electrophoresis) ‹#› 27 FISH – FLUORESCENČNÍ IN SITU HYBRIDIZACE ‹#› 28 FISH – FLUORESCENČNÍ IN SITU HYBRIDIZACE LNA (locked nucleic acid) sondy metylénový můstek – vyšší teplotní stabilita nižší flexibilita vyšší hybr. interakce sekvence bází LNA Tm GTGATATGC 0 29 °C GTGATATGC 3 55 °C GTGATATGC 9 64 °C ‹#› 29 FISH – FLUORESCENČNÍ IN SITU HYBRIDIZACE PNA (peptide nucleic acid) sondy 203px-PNA_en N-(2-aminoethyl)-glycinové monomery spojené peptidovou vazbou Silná vazba PNA:DNA (bez elektrostatické repulse) Hydrofobní 121011 N tabacum telom 1df FISH Telomery Nicotiana tabacum, © T. Mandáková ‹#› 30 FISH – FLUORESCENČNÍ IN SITU HYBRIDIZACE Identifikace intersticiálních (interních) telomerových sekvencí 121011 N tabacum telom 1df FISH Telomery Nicotiana tabacum, © T. Mandáková Uchida et al., 2002 Telomery A. thaliana, Široký et al., 2002 ‹#› 31 KOMPARATIVNÍ GENOMOVÁ HYBRIDIZACE http://atlasgeneticsoncology.org/ ‹#› 32 CHROMOSOME PAINTING Vizualizace velkých chromosomových segmentů se specifickými fluorescenčně značenými DNA sondami (BAC). Savci, ptáci, plazi, hmyz – identifikace chromozomálních aberací (diagnostika), chromosomové přestavby (evoluční studie) Rostliny – velký počet chromosomově nespecifických signálů (vysoká komplexita rostlinných genomů) ‹#› 33 Lysák et al. 2006 CHROMOSOME PAINTING