1 Metody makromolekulární strukturní analýzy Jaromír MAREK, Centrum strukturní biologie, CEITEC MU Obsah • Předmět studia • Sekundární struktura a CD • Metody na určování terciární struktury • RTG krystalografie • NMR • Kryoelektronová mikroskopie 2 (Bio)makromolekulární strukturní analýza Organismy Buňky Buněčné struktury SSBs polymerase Molekulární komplexy helicase primase 3-D struktury Centrální dogma molekulární biologie Francis Crick 3 Centrální dogma strukturní biologie Počet struktur k určení 102103Proteinové sklady 103105Exp. určené struktury 106107Sekvence Membránové proteiny Rozpustné/ globulární proteiny Počet 4 Strukturní biologie v „postgenomické“ éře biologie DNA sekvence Proteiny Počet proteinových struktur v PDB 5 Membránové proteiny Úrovně popisu (bio)struktur 6 Primární struktura – přímé určení • MS - hmotnostní spektroskopie (mass spectrometry) • Techniky typu MALDI, Matrix-assisted laser desorption/ /ionization • Detaily - přednáška doc. Zdráhala Sekundární struktura – definice Určující interakce –strukturu stabilizující vodíkové můstky 7 Sekundární struktura – nepřímé určení • Úhly φ a ψ • Vazby zapojené v α a β strukturách β-struktury α-struktury Sekundární struktura a CD spektra • cirkulární dichroismus – různá absorpce levotočivého a pravotočivého kruhově polarizovaného světla • spektrálně závislé změny - UV oblast - 170 - 260 nm • Aditivní signál (množství, délka dráhy, složky) 8 CD - fyzikální principy • Lineárně polarizované světlo: http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo2.htm • Lin. polarizované světlo+absorpce:http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo10.htm • Superpozice záření: http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo4.htm http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo5.htm • Kruhově polarizované světlo: http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo7.htm • Lineárně vs kruhově polarizované světlo: http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo8.htm • Kruhově polarizované světlo a absorpce: http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo11.htm • Kruhově polarizované světlo a cirkulární dichroismus (=rozdílná absorpce L a P složky): http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo14.htm CD - instrumentace 9 CD - instrumentace • Výrobce – např. JASCO • Zdroj světla: Xe lampa • Dráha světla ve vzorku: ~ 1 mm • Maximálně přečištěný vzorek • Žádné dodatečné UV absorbenty • Filtrace (parazitní rozptyl na mikronečistotách) • Roztok – podmínky blízké fyziologickým CD – příklad aplikace – prion PrPc modelRTG experimentCD spektrum 10 CD – výhody a nevýhody Výhody: • nedestruktivní metoda • malé množství vzorku (200 ul @ 0.5 mg/ml) • citlivost na fyziololog. změny ovlivňující sekundární strukturu • relativně rychlá a „levná“ metoda Nevýhody: • nejde používat koncentrované absorbující pufry • relativně nízká přesnost num. analýzy podílu α/β/ struktur Hlavní oblast použití: Informace o stavu „sbalení“ (tzv. foldu), resp. sekundární struktuře makromolekulárního vzorku za podmínek blízkých fyziologickým Počet proteinových struktur v PDB 11 (Strukturní) biologie – exp. techniky 1 nm 1 µm 1 mm buňkyorganely biomolekuly Protein. „stroje“ NMR, RTG kryoEM elektronová mikroskopie AFM konvenční mikroskopie Oblasti rozlišení metod a velikostní škály objektů NMR, RTG Studium 3D struktur: sonda + vzorek Sonda: • (viditelné světlo ?) • RTG záření • vlny/částice: elektrony • radiofrekvenční vlny Vzorek: • (bio)molekuly v roztoku - NMR • (bio)molekuly zmražené v ledu -kryoEM • (bio)molekuly uspořádané v krystalu - RTG 12 Studium 3D struktur proteinů Z roztoků PDB NMR 2001 : 2 a ¼ tisíce 2008 : 7 a ½ tisíce 2013 : 8 a ½ tisíce Krystaly RTG difrakční techniky Přes 12 tisíc 44 a ½ tisíce Přes 72 tisíc Odhad: většina struktur přinejmenším globulárních proteinů (proteinů s dobře určenou terciární strukturou = výsledky CD) bude určována difrakcí RTG záření i v budoucnu. Studium 3D struktur: RTG+NMR RTG RTG Difrakční obraz Krystal: shodně orientované molekuly NMR RF RF Resonance H0 V roztoku 13 RTG krystalografie - postup (0.) Příprava rekombinantního proteinu, čištění, zahušťování… 1. Krystalizace 2. Difrakční experiment 3. Fázový problém, příprava modelu 4. Zpřesňování modelu Krystaly Krystal – periodicky uspořádaná látka Opakování motivu: • posun • rotace Krystal (bio)polymeru • oblast polymeru • oblast rozpouštědla Čistota + stabilita vzorku 14 Krystalizace proteinů • Difůzní techniky • Fázový graf Krystalizace proteinů Problém: Jak „rychle“ vypěstovat „použitelný“ krystal? • Empirie – sady roztoků • Souběžné experimenty • Malé (nanolitrové) objemy => nasazeni robotiky 15 Difrakční experiment: principy Interference = difrakce: 2d . sin θθθθ = n λ Difrakční experiment-schéma 16 Difrakční experiment: zdroj RTG Difrakční experiment: goniometr+detektor 17 Difrakční experiment: instrumentace na MU Kryokrystalografie – mj. eliminace radiačního aj. rozpadu vzorku Difrakční experiment: interpretace dat Nabitá částice je v poli rovinného monochromatického záření sekundárním zdrojem elektromagnetického pole I I e m r cQ Oi= 4 2 2 4 2 sin ϕ Rozptyl na protonech je nevýznamný (je 18372x slabší), difrakcí RTG záření studujeme elektronovou strukturu látky Krystalová elektronová hustota je obráceným Fourierovým obrazem strukturních amplitud ( ) [ ]ρ π π( ) ( )exp . exp ( )* * * , ,* r r r r r= − = − + + =−∞ +∞ ∑∫ F i d V F i hx ky lzhkl h k lV 2 1 2 F(r) je komplexní veličina přímo neměřitelná, měříme jen její velikost => Fázový problém krystalografie 18 Difrakční experiment: vlnění, amplituda+fáze Difrakční experiment: limitované rozlišení geometrické limity na počet naměřených dat dRes = λ θ/ sin22 sind θ λ=Res σ λ/2 (θ),sin š íRozli en [Å] rychlé + přesné měření => co nejintenzivnější zdroj RTG ( ) [ ]ρ π π( ) ( )exp . exp ( )* * * , ,* r r r r r= − = − + + =−∞ +∞ ∑∫ F i d V F i hx ky lzhkl h k lV 2 1 2 „šum“ detektoru 19 Fázový problém • cíl krystalografie– zjistit 3-D model studované (makro)molekuly • prostředek – určit při difrakčním experimentu ztracenou informaci o fázích strukturních amplitud, pak Fourierovou transformací získat mapy elektronových hustot • nejjednodušší metoda – fázový problém vůbec neřešit, využít podobnost studovaného sytému se systémem s již známou 3-D strukturou (MR, molecular replacement). • nutná je poměrně velmi vysoká podobnost mezi modelem a studovaným systémem (AA identita cca 30% a lépe, AA podobnost 50% a lépe) • kanály rozpouštědla (krystalograficky neuspořádané vody) • relativní stabilita terciální struktury globulárních proteinů při interakci jejich interakci s „malými“ molekulami • nutnost opakovaných měření s různými dobře difraktujícími izomorfními deriváty • podobnost struktur proteinů s jejich Se-Met analogy Fázový problém: SeMet proteiny + kovové deriváty proteinů 20 Strukturní model: vliv rozlišení Nebezpečí: hlavní nebo vedlejší řetězec => chybně postavený model Strukturní model: zpřesňování Startovní model Minimalizace K Výpočet nových strukturních faktorù Výpočet nových map elektronové hustoty Manuální úprava modelu Nelineární problém – iterativnost, konvergence Kritérium správnosti : R-faktory R F K F F o c o = −∑ ∑ H H H H H 21 RTG krystalografie: výstupy monokrystal – velikost ~10-4 m, V ~10-10-10-12 m3 krystalová mřížka - mřížkové parametry ~10-8 - 10-9m - V ~10-24-10-27 m3 - typicky 2-8 „molekul“ v buňce strukturní model – „průměrná“, rovnovážná struktura (ze souboru 1012-1018 molekul) Teplotní aj. pohyby –„teplotní faktory“ (B, ev. U) teplotní elipsoidy (ORTEP) – pravděpodobnost výskytu NMR spektroskopie NMR – nukleární magnetická rezonance „nukleární: jádra izotopů s nevykompenzovanými spiny 1H, 13C, 15N • „magnetická“: externí (silné) magnetické pole • „rezonance“: pohlcování (+ vyzařování) záření (RF pásmo) je zesilováno na rezonančních frekvencích 22 NMR spektroskopie: instrumentace Proteinový vzorek: objem cca 300-600 µl, mM koncentrace, čistota + stabilita NMR spektroskopie: chemický posuv Chemický posuv (chemical shift) – posun resonanční frekvence (vůči standardu) Modifikace signálu: změny magnetického pole + „chemického prostředí“ 23 NMR spektroskopie: multi D experimenty Korelační ovlivňování se blízkých magnetických momentů Experiment: COSY + NOE spektroskopie COSY – korelační spektroskopie – korelují momenty vazebně blízkých jader (např. z jednotlivých AA) - 1D NOESY - „nuclear Overhauser effect“ spektroskopie – zdroj 2D a 3D informací o „blízkých“ (d ≤ 5 Å) jádrech NMR spektroskopie: multi D experimenty FT NMR: NMR s Fourierovou analýzou Multi D experiment: několik budících pulsů 24 NMR spektroskopie: „nepřímá“ 3-D data Korelační experimenty – „přiřazení“/indentifikace píků vůči primární struktuře NOE experimenty – distanční informace o blízkých jádrech Výsledek: ansámbl možných řešení Komplementarita experimentálních technik NMR RTG krystalografie Výpočetní metody + metodiky „budoucnosti“ : kryoEM, … Limitace technik: velikost studovaného systému, rychlost, možné „slepé” uličky, ... 25 KryoEM: transmisní elektronová mikroskopie • elektronová mikroskopie –> vakuum • transmisní –> tenký vzorek • vzorek za „přirozených“ podmínek -> Vzorek (monovrstva náhodně umístěných a náhodně orientovaných vzorků) je zmražený v (amorfním) ledu fixovaným v podpůrné mřížce KryoEM: počítačová rekonstrukce obrazu pohledy na „různé“ vzorky „náhodným“ směrem slabý/zašuměný signál 26 KryoEM: počítačová rekonstrukce obrazu 3D obraz : počítačová rekonstrukce z (mnoha) 2D pohledů Strukturní informace: integrovaný přístup Povrchová obálka alfaviru působícího „Chikungunya“ horečku. Mr = 25 MDa Červená+žlutá – 240 dimerů protein. heterokomplexu E1/E2 - výsledek RTG Virion. obálka – šedá – výsledek kryoEM