Metody v genomice a proteomice
genomika
lekce 1 Izolace DNA a RNA, Separace nukleových kyselin (P. Procházková Schrumpfová)
lekce 2, 3 Manipulace s DNA (štěpení, klonování, značení..) (M. Fojtová)
lekce 4 Techniky založené na renaturaci DNA (M. Fojtová)
lekce 5 Sekvenování, analýza genové exprese (J. Fajkus)
lekce 6 Využití mutantů v genomice (J. Hejátko)
proteomika
lekce 1 Příprava proteinových izolátů, separace/frakcionace proteinů (J.Havliš)
lekce 2, 3 Hmotnostní spektrometrie proteinů (Z. Zdráhal)
lekce 4 Analýza proteinových komplexů (J. Paleček)
lekce 5 Metody makromolekulární strukturní analýzy (J. Marek)
lekce 6 Příprava rekombinantních proteinů (R. Dopitová)
• čistota
• výtěžek
• výchozí materiál
(množství, kvalita, typ buněk...)
• časová náročnost metody
• ekonomická náročnost
• izolace ve zkumavce
• kity
• automatické roboty
X
1) Metody izolace nukleových kyselin
rozpad DNA při izolaci: znečištění RNA: čistota DNA pro další aplikace :výtěžnost:
Rozrušení buněčných membrán a denaturace proteinů:
•ionogenní detergenty:
sodium dodecyl sulfát (SDS)
N-laurylsarkosin
guanidinium hydrochlorid ...
•neionogenní detergenty: (umožní rozpustit buněčnou membránu při
zachování jaderné membrány; izolace plazmidové DNA)
Triton X100
NP-40...
•mechanická lyze: (kvasinky, houby, rostliny, živočišné pojivové tkáně..)
v třecí misce v tekutém dusíku,
skleněné kuličky,
tyčové homogenizátory...
•osmotická lyze: (E.coli, živočišné tkáně: krev, mozek...)
•enzymatická lyze: (spóry, kvasinky...)
lysozyme, celuláza atd.
příklad rozpadu DNA
při mechanické lyzi
Odstranění proteinů:
proteinase K
fenol/chloroformová extrakce
F:CH:IAA (25:24:1); protřepat; stočit; odebrat vodnou fázi
CH:IAA (24:1); protřepat; stočit; odebrat vodnou fázi
Inhibitory nukleáz:
EDTA ((etylendiaminotetraoctová kyselina) chelatace dvojmocných iontů (kofaktorů nukleáz))
laurylsíran sodný a N-laurylsarkosin
Odstranění RNA:
RNáza
Odstranění polysacharidů:
rostliny, houby a některé bakterie
Extrakcí s cetyltrimetylamonium bromidem (CTAB). Kladně nabitý CTAB se
váže s negativně nabitými polysacharidy (pectin, xylan..)V závislosti na
koncentraci NaCl dochází k precipitaci DNA nebo kontaminat (při 0.7-0.8 M
NaCl jsou polysacharidy vyprecipitovány a DNA zůstává v roztoku).
Fenol: sráží proteiny přítomné ve vodném lyzátu (pro DNA pH=7)
Izoamylalkohol: zvyšuje rozpustnost fenolu v chloroformu; po skončení
protřepávání přejde fenol do chloroformové fáze.
Chloroform: organické rozpouštědlo, nemísitelné s vodou, po jeho přídavku
dochází k vytvoření dvou fází: horní vodné a dolní organické.
Protřepáváním dojde k mísení fází, po mísení se směs rozdělí na dvě fáze
– horní vodnou a dolní chloroformovou.
Vysrážené proteiny jsou na rozhraní fází.
Nukleové kyseliny jsou obsaženy v horní vodné fázi
odstraněny i stopy fenolu v roztoku, které by mohly interferovat např. s použitím
enzymů při dalším opracování izolovaných nukleových kyselin.
fenol/chloroformová extrakce
Srážení DNA
Adsorpce na silikát
Izolace DNA
Srážení DNA v nevodném prostředí
Izolace DNA
Ethanol
Izopropylalkohol
•díky elektrostatickým interakcím je polární molekula DNA snadno rozpustná v polární H2O
•kationty solí (např. Na+, Mg2+, Li+...) neutralizují náboj cukr-fosfátového řetězce DNA
(PO3-); DNA se stává méně hydrofilní, tedy méně rozpustnou v H2O
•elektrostatický náboj mezi ionty je v H2O díky vysoké dielektrické konstantě nízký (ionty
solí jsou víceméně volné (obklopené molekulami H2O), netvoří iontové páry); ethanol má nižší
dielektrickou konstantu a umožní tak zformování iontových párů DNA-kationt
Isopropanol vs. EtOH
•Isopropanol má nižší dielektrickou konstantu než EtOH tzn. DNA se sráží rychleji a při
nižším množství isopropanolu (35% isopropanol vs. 75% EtOH při 0.5M soli)
•Během srážení isopropanolem dochází k precipitaci většího množství solí než s EtOH
•Při použití EtOH je nutná vyšší koncentrace DNA, aby došlo ke srážení; avšak soli zůstávají
rozpustné (i při nízkých teplotách).
•Protože DNA při koncentracích nižších než 20ng/ml precipituje až při teplotě 0-4°C,
doporučuje většina protokolů mix DNA/sůl/EtOH ponechat srážet -20°C O/N nebo -80°C / 1h.
Avšak stačí 15-30min/led. Mix s isopropanolem se nedoporučuje chladit, protože dochází
k precipitaci zbytečně velkého množství solí.
•Odstranění přebytečných solí (bílé zbarvení peletu) stačí oplach peletu 70% EtOH (DNA
se začíná rozpouštět při 65%EtOH).
Výběr solí
Acetát sodný (0.3M výsl. konc., pH 5.2)
Chlorid sodný (0.2M výsl. konc.) pro vzorky s SDS, aby SDS neprecipitoval s EtOH (např.
izolace plazmid DNA...); [ale Cl- ionty mohou inhibovat následné proteinovou syntézu (např.
polymerace, in vitro translace...)]
Chlorid lithný (0.8M výsl. konc.) vhodné pro izolaci RNA; selektivně precipituje plnodélkové
RNA transkripty
Acetát amonný (2M výsl. konc.) vhodné pro odstranění dNTP; ale amnonné ionty inhibují
např. T4 PNK
polyaminy:
spermidine
spermine
Srážení DNA ve vodném prostředí
Izolace DNA
•vysoce selektivní precipitace DNA (nevhodné pro genomovou DNA, ne <50bp)
•pokud se chcete vyhnout F:CH:IAA extraci
•vhodné pro izolaci DNA-vazebných proteinů
•odmytí polyaminu oplachem peletu koncentrované solii (např. LiCl, NaOAc...)
např.:% PEG 8000 -- odstranění fragmentů menších než:
10% -- <300bp
6% -- <500bp
5% -- <700bp
4% -- <1kb
polyether:
PEG
•vhodné pro délkově selektivní DNA precipitaci
•hůře precipituje nízkomolekulární DNA (<150bp)
•různé molek. hmotnosti PEG 300 g/mol až 10,000,000 g/mol
•odmytí PEG oplachem peletu EtOH
Adsorpce na silikát
DNA se v přítomnosti chaotropních solí adheruje na silikátový povrch
eluce H2O (vhodné pro další použití (in vitro translace atd.))
TE pufrem (DNA je stabilnější)
Izolace DNA
kity pro izolaci DNA (rostlinné, živočišné...)
RNA (celková, mRNA...)
plazmidové DNA
odstranění krátkých oligo (např. dNTP po PCR reakci)
izolace z DNA gelu...
E.coli
•nutná řádná lyze
•nepřekračovat kapacitu kolon
a jejich výhody /nevýhody
CTAB SDS
Izolace rostlinné genomové DNA
výtěžnost genomové DNA udaná výrobci a realita se mohou lišit o řád(y)
•homogenizace v třecí misce
•nutno odstranit zbytky buněčných stěn
•izolace v SDS / CTAB pufru
toto není slibovaných x ug DNA
"rychlo-izolace" DNA vhodná pro přímou PCR
•u rostlin přímá izolace genomové DNA z listového disku a následná PCR
nefunguje příliš dobře -záleží spíše na konkrétní kombinaci primerů
A-izolace kitem
B-"rychlo-izolace"
dvojice primerů: 1 2 3
RNA
RNázy - všudypřítomné a velmi odolné enzymy, štěpící RNA. Materiál i vodné roztoky musí
být zbaveny RNáz (oplach EtOH, DEPC (Diethylpyrocarbonát; kovalentně modifikuje His,
Cys a Tyr))
Skladování RNA vždy při -70 ºC (ochrana proti působení RNáz)
Zhruba 95% objemu NK v buňce tvoří RNA.
odstranění RNA: po izolaci NK přidám RNázu (nutno znovu přečistit F:CH extrakcí, vysrážet DNA
EtOH)
izolace RNA: stejný postup jako u DNA
Pro extrakci se používá kyselý fenol pH=4 (DNA přejde do organické fáze a ve vodné fázi
zůstane spíše RNA)
až 95% celkové NK tvoří RNA
ribosomální RNA
špatně RNázovaná genomová DNA
„Birnboimova metoda“
• alkalická denaturace (pH=12) v přítomnosti
SDS – denaturuje plasmidová i bakteriální
DNA
• neutralizace (KAc, pH 5.5) – plasmid
renaturuje, dlouhá bakteriální DNA ne
• centrifugace – plasmidová DNA v roztoku,
genomová DNA je vázána na proteiny, které
v tomto prostředí precipitují
• (RNase A), precipitace ethanolem
Kolonkové kity – založeny na tomto principu +
kolonka
Izolace plasmidové DNA
Separace plasmidové DNA a bakteriální genomové DNA, založena na rozdílné velikosti molekul
Izolace DNA pomocí CsCl gradientu
300 000 x g, 12 hodin
v zatavených polypropylenových zkumavkách
v přítomnosti EtBr
Izolace mitochondriální DNA
diferenční centrifugace
1) ctfg.krátce s nízkými otáčkami např. 3000 g / 5–10 min.;
pelet:pelet: obsahuje zbytky buněčných stěn, jádra, intakní plastidy, škrobová
zrna...
supernatantsupernatant:: mitochondrie...
2) ctfg. dlouze a delší čas (např. 10,000 g / 10–20 min.); hrubý
mitochondriální extrakt
peletpelet: obsahuje mitochondrie, peroxizómy, zbytky membrán plastidů
gradientová centrifugace
ctfg. v gradientu roztoku Percolu. Intaktní mitochondrie vytvoří separovaný
prstenec oddělený od ostatních kontaminant zhruba v 25–30%.
osmotická lyze buněk v pufru pH=7
(rostlinná tkáň: sacharóza nebo mannitol 0.2–0.5 M, živočišná tkáň: 0.15 M KCl)
EDTA- inhibuje proteolytické enzymy
BSA (Bovine serum albumin) - vychytává fenolické látky uvolněné např. z vakuol,
váže mastné kys, inhibice proteáz..
PVP (Polyvinylpyrrolidone) - absorbuje fenolické látky
Izolace chloroplastové DNA
diferenční centrifugace
1) ctfg.krátce s nízkými otáčkami (např. 1500 g / 15 min.);
peletpelet obsahuje plastidy, zbytky buněčných stěn, jádra,
škrobová zrna
gradientová centrifugace
ctfg. v gradientu roztoku Percolu (např. 2600g/14h nebo 3
6500g/1h)Chloroplasty vytvoří separovaný prstenec
oddělený od ostatních kontaminant mezi 35-např.55%.
rozpad DNA při izolaci: znečištění RNA: čistota DNA pro další aplikace :výtěžnost:
2) Elektromigrace
• metoda využívaná k separaci makromolekul na základě náboje, konformace nebo velikosti
• migrace nabité částice v elektrickém poli je úměrná jejímu celkovému náboji, velikosti a tvaru
2) Elektromigrace
v = q.E / f
rychlost
celkový náboj
intenzita el. pole
frikční (třecí) koeficient
(popisuje tvar a velikost molekuly)
• metoda využívaná k separaci makromolekul na základě náboje, konformace nebo velikosti
• migrace nabité částice v elektrickém poli je úměrná jejímu celkovému náboji, velikosti a tvaru
pI > pH kladný náboj
pI < pH záporný náboj
2) Elektromigrace
v = q.E / f
rychlost
celkový náboj
intenzita el. pole
frikční koeficient
(popisuje tvar a velikost molekuly)
Celkový náboj molekuly:
•malé částice s velkým nábojem – velká pohyblivost
•velké částice s malým nábojem – malá pohyblivost
• metoda využívaná k separaci makromolekul na základě náboje, konformace nebo velikosti
• migrace nabité částice v elektrickém poli je úměrná jejímu celkovému náboji, velikosti a tvaru
Tvar: ohyby, struktury...v = q.E / f
rychlost
celkový náboj
intenzita el. pole
frikční koeficient
(popisuje tvar a velikost molekuly)
• metoda využívaná k separaci makromolekul na základě náboje, konformace nebo velikosti
• migrace nabité částice v elektrickém poli je úměrná jejímu celkovému náboji, velikosti a tvaru
2) Elektromigrace
DNA vs. RNA
x
v = q.E / f
rychlost
celkový náboj
intenzita el. pole
frikční koeficient
(popisuje tvar a velikost molekuly)
• metoda využívaná k separaci makromolekul na základě náboje, konformace nebo velikosti
• migrace nabité částice v elektrickém poli je úměrná jejímu celkovému náboji, velikosti a tvaru
2) Elektromigrace
• agarózová
Elektroforéza
• horizontální
vhodné pro rozlišení dlouhých fragmentů DNA a RNA (1kb ssDNA ~ 330 kDa)
(>400 bp)
• polyakrylamidová
vhodné pro rozlišení krátkých fragmentů DNA nebo sekvencí lišících se záměnou
jednoho nukleotidu (<400 bp)
vertikální kapilární
Polyakrylamid:
většinou vertikální separace
Agaróza:
většinou horizontální separace
•agar se získává z buněčných stěn červených řas
•slovo agar pochází z malajského slova agar-agar = medúza
agar je směsí agarózy a agaropektinu
•agaróza je neutrální lineární polymer agarobiózy (disacharid D-galaktóza and 3,6-
anhydro-L-galaktopyranóza)
•agaropektin je heterogenní směsí malých větvených molekul s navázanými sulfáty,
které se oddělují od agarózy pomocí náboje
Terciání struktura agarózy je dvojšroubovice se schopností akomodovat vysoké množství
vody (až 99.5%).
agarózová elektroforéza
Agaróza je prodávána v několika úrovních čistoty podle množství zbytkových nabitých
sulfátových a karboxylových skupin, jejichž ionty mohou migrovat ke katodě a způsobovat
jev zvaný elektroendoosmóza (EEO).
•V přítomnosti nabitých sulfátových a karboxylových skupin vzniká elektrická dvojvrstva
•Mobilní část iontů se pohybují směrem k elektrodě, dochází ke vzniku proudění
•EEO je způsobena tokem vody, která je pod vlivem těchto volných iontů unášena směrem ke
katodě.
•Dochází k neselektivnímu a tedy nežádoucímu pohybu částic
EEO - Elektroendoosmóza
Rozlišení agaróz:
Low-melting agarózy
Snížený bod tání ze standardních ~90°C na nižší teploty
• zvýšení koncentrace agarósového gelu na koncentraci
až ~4%, vhodné pro separaci menších molekul DNA
•méně "pevné" gely
•izolace DNA z gelu bez DNA denaturace
•in-gel PCR
•in-gel ligace
Agarósa pro "pevné" gely
•pulsed field gel elfo. (PFGE)
viz. dále
"běžná" agaróza low-melting agaróza
Nejčastěji používané pufry:
TBETBE Tris/kyselina boritá/EDTA
•optimální pro rozlišení molekul fragmentů DNA od 0.1- to 3-kb
•kys.boritá je silný inhibitor mnoha enzymů
•vhodná při vysokém napětí (>150 V)
TAETAE Tris/kyselina octová/EDTA
•optimální pro rozlišení DNA od 12 kb to 50 kb
•má nižší pufrovací schopnost než TBE, ale je možno použít separovanou DNA pro
další enzymatické aplikace (při vyloučení EDTA)
•při nižším napětí dostaneme lepší rozlišení
•TAE pufr je vhodný pro separaci DNA s nadšroubovicovitým vinutím
pozn.: při separaci DNA s nadšroubovicovitým
vinutím nutno použít vhodný marker
Nejčastěji používané pufry:
TBETBE Tris/kyselina boritá/EDTA
•optimální pro rozlišení molekul fragmentů DNA od 0.1- to 3-kb
•kys.boritá je silný inhibitor mnoha enzymů
•vhodná při vysokém napětí (>150 V)
TAETAE Tris/kyselina octová/EDTA
•optimální pro rozlišení DNA od 12 kb to 50 kb
•má nižší pufrovací schopnost než TBE, ale je možno použít separovanou DNA pro
další enzymatické aplikace (při vyloučení EDTA)
•při nižším napětí dostaneme lepší rozlišení
•TAE pufr je vhodný pro separaci DNA s nadšroubovicovitým vinutím
Další méně používané pufry:
TPETPE Tris(base)/kyselina fosforečná/EDTA
TTE TRIS-TAPS-EDTA
TTE Tris-Taurine-EDTA ...
Nanášecí pufry:
zvýšení hustoty nanášeného vzorku:
•glycerol
•Ficoll
•sacharóza
barva:
•bromfenolová modř
•xylen cyanol
•Orange G
•kresolová červeň
H2O nebo pufr (např. TAE, TBE...)
výběr vhodné nanášecí barvy:
vizualizace: EtBr barva: BF,XC
vizualizace: Syber Gold barva: Orange G
1) fluorescenční vizualizace
Ethidium bromide (2,7-diamino-10-ethyl-9-phenylphenanthridinium bromide)
• Excitační maximum je kolem 590nm, avšak využivá se absorbce UV
záření při 254, 302 a 366 nm. Emisní max. je 605 nm.
•interkalací do hydrofóbního prostředí DNA se díky zbavení se molekul
H2O zvýší síla fluorescence zhruba 10x
•limit detekce DNA pouhým okem je zhruba 10ng/band
•ssDNA je nutno dávat na gel zhruba 5x více než dsDNA
•interkalace EtBR dsDNA každých 2.5 pb
•EtBr retarduje mobilitu DNA zhruba o 15%
•EtBr inhibuje polymerizaci PAGE gelů
•běžná koncentrace používaná při barvení agarózových gelů je 0.05 µg/ml
Vizualizace DNA:
díky EEO putuje EtBr k anodě
Syber Green I
•absorbuje UV 250 nm a 300 nm avšak nejsilnější absorbční max má v rozmezí modrého
světla (λmax = 497 nm)
•emituje zelené světlo (λmax = 520 nm)
•Při použití 300 nm transiluminátoru lze detekovat méně než 60pg dsDNA/band
•Při použití specielního epi-iluminátoru (254nm) lze detekovat již 20pg dsDNA/band
•tzn. SYBR green I je 25x senzitivnější než EtBr
•využití při real-time PCR
Syber Green II na detekci ssDNA/RNA
•Při použití specielního epi-iluminátoru (254nm) lze detekovat již 100 pg RNA nebo
ssDNA.
•Při použití 300 nm transiluminátoru je možno detekovat zhruba 500 pg RNA/band.
GelGreen excitace při UV(254nm), modrým světlem(470 nm) nebo laserem (488
nm); nutno přidat zelený filtr
GelRed excitace při UV(302 nm); stačí EtBr filtr
Gel Star
Sybr Safe fluorescenční λmax při 280 a 502 nm; emisní λmax 530 nm
.
.
.
•absorbuje UV 250 nm a 300 nm avšak nejsilnější absorbční max má v rozmezí modrého
světla (λmax = 497 nm)
•emituje zelené světlo (λmax = 520 nm)
•Při použití 300 nm transiluminátoru lze detekovat méně než 60pg dsDNA/band
•Při použití specielního epi-iluminátoru (254nm) lze detekovat již 20pg dsDNA/band
•tzn. SYBR green I je 25x senzitivnější než EtBr
•využití při real-time PCR
Syber Green I
Test buněčného barvení:
Amesův test:
Avšak dle Ohta et al., 2001 je SYBR green v bakteriálních buňkách ošetřených UV
zářením více mutagenní než EtBr...
Toxicita DNA vizualizačních barev
Nejčastěji používaná radioaktivní značka: 32P
-koncové značení DNA (výměna 5´ koncového fosfátu za radioaktivně značený pomocí
polynukleotid kinázy)
-značení celých sond („nick translace“ : značení DNA radioizotopy metodou posunu zlomu)
2) radioaktivní vizualizace
Vizualizace DNA:
vhodné pro vizualizaci malého množství DNA:
(southernův n. nothernův přenos na nylonovou membránu, hybridizace s radioaktivně
značenou sondou)
EtBr
celková DNA
koncové značení
telomerická DNA
znač. nick transl.
chloroplast. DNA
pozn. pozor na množství separované DNA:
při velmi malém množství DNA má na mobilitu DNA vliv také EEO, přítomnost
interkalačních činidel a samotné malé množství DNA
elfo bez EtBr
(radioaktivní vizualizace telomerickou sondou)
elfo s EtBr
(radioaktivní vizualizace telomerickou sondou)
Při nepřítomnosti denaturujících činidel si RNA zachovává
sekundární struktury, které znemožňují separaci podle velikosti.
Formaldehydový denaturační gel: (pro RNA)
agarózu rozvařit v DEPC H2O (zabrání se degradaci RNA);
10X MOPS pufr: 0.2M MOPS pH 7
50mM NaAc
10mM EDTA
doplnit na výsl. 1% formaldehyd
Separace RNA:
agarózu nutno rozvařit v H2O (v přitomnosti NaOH se agaróza nerozvaří);
po schládnutí přidat NaOH
50X Alkalický pufr: 1.5M NaOH
50mM EDTA
separační pufr je 75mM NaOH
Denaturující alkalické gely: (pro DNA)
SSCP (jednovláknového konformačního polymorfismu)
Separace jednovláknové DNA na nedenaturujícím
polyakrylamidovém gelu při nízké teplotě. DNA řetězec
se sbalí podle vnitřních komplementarit. Mobilita DNA v
gelu závisí na konformaci. Malá záměna může vést ke
změně sbalení, které lze někdy odlišit pomocí SSCP
Separace DNA lišících se v jedné bázi:
Separace DNA molekul v polyakrylamidovém gelu. Gel obsahuje lineární gradient
formamidu a močoviny. Dvouvláknová DNA putuje rychlostí určenou její molekulovou
hmotností do doby, než vstoupí do té části gelu, kde je taková koncentrace
denaturačních látek, že způsobí denaturaci dsDNA na jednovláknové molekuly.
DGGE (denaturační gradientová gelová elektroforéza)
TGGE (denaturační gelová elektroforéza teplotním gradientem)
PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis)
•Standardní gelová elfo rozliší DNA fragmenty do 75kb;
větší fragmenty putují pospolu
•separace v měnícím se elektrickém poli (orinetace
pólů o 90°; 120°; 180° atd.)
důležité parametry:
délka pulzu; orientace; chlazení; pufr; agaróza s nízkým EEO
Separace velkých DNA molekul:
Separace DNA struktur:
2D elfo
první rozměr:
při nízkém napětí v nízkoprocentní agaróze dochází k separaci DNA
molekul dle velikosti, bez vlivu struktury
vyříznu pruh DNA, který chci separovat a vložím na vrchol nového gelu
druhý rozměr:
při vysokém napětí ve vysokoprocentní agaróze v přítomnosti EtBr
dochází je mobilita silně ovlivněna tvarem molekul a složitostí struktur
Měření koncentrace izolované DNA:
odečet množství DNA z gelu:
měření spektrofotometricky:
A = ε.c.l
A = absorbance (bez jednotek)
ε = extinkční koeficient (M-1cm-1) (konstanta pro každou DNA)
c = koncentrace (M)
l = tloušťka kyvety (většinou 1cm)
Neznáme-li extinkční koeficient, můžeme pro určení koncentrace DNA o vysoké
molekulární hmotnosti použít zjednodušeného předpokladu:
roztok dsDNA o absorbanci 1.0 při 260nm má koncentrací 50 µg/mL
ssDNA 33 µg/mL
RNA 40 µg/mL
měření DNA v
kyvetách:
měření spektrofotometricky:
A = ε.c.l
A = absorbance (bez jednotek)
ε = extinkční koeficient (M-1cm-1) (konstanta pro každou DNA)
c = koncentrace (M)
l = tloušťka kyvety (většinou 1cm)
Neznáme-li extinkční koeficient, můžeme pro určení koncentrace DNA o vysoké
molekulární hmotnosti použít zjednodušeného předpokladu:
roztok dsDNA o absorbanci 1.0 při 260nm má koncentrací 50 µg/mL
ssDNA 33 µg/mL
RNA 40 µg/mL
měření velmi malých
objemů DNA:
měření DNA v
kyvetách:
vysoká absorbance:
260 nm nukleové kyseliny
280 nm proteiny
nízká absorbance NK a proteinů:
230 nm
měření spektrofotometricky:
poměr A260/280
pro DNA: 1.8
pro RNA: 2.0
pokud je poměr >1.8 je vzorek kontaminován RNA
<1.75 je vzorek kontaminován proteiny
poměr A260/230
jiný poměr naznačuje kontaminaci např. fenolem, solemi,
EDTA, močovinou, TRIzol, guanidinium HCl...
pro DNA: 1.5-1.8
Absorbance by měla být mezi 0.1-1.0
1. http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2660&ID=5139&Men
4. http://bitesizebio.com/articles/the-basics-how-phenol-extraction-works/
http://openwetware.org/wiki/Image:Phenol_chloroform_gDNA_ex_tail_vs_liver.JPG
6. http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/manip/conc.html
http://openwetware.org/wiki/Ethanol_precipitation_of_nucleic_acids
http://www.flickr.com/photos/damon_tighe/4799892345/
9. http://dnature.co.nz/mini-plant-DNA/
http://www.bio.davidson.edu/courses/Molbio/MolStudents/spring99/lauren/geneclean.html
10, http://www.qiagen.com
http://www.sigmaaldrich.com
http://fantendo.wikia.com/wiki/New_Super_Mario_Bros._Delta/Enemies
http://www.123rf.com/photo_11293706_e-coli-bacteria-isolated-on-white-background-vector-illustration.html
http://mi9.com/wallpaper/3d-human-figure_233/
http://pathogensandpassageways.blogspot.cz/2011/07/extractions.html
11. http://www.mn-net.com/
12. http://www.sigmaaldrich.com
14. http://www.carolina.com/dna-extraction-quantification-reagents-supplies/plasmid-dna-isolation-reagent-system/211310.pr
15. http://course1.winona.edu/sberg/241f00/Lec-note/DNA.htm
16. http://drwyckoff.wordpress.com/
Anja Rödiger et al., Journal of Plant Physiology, Vol. 167, Issue 8 , 15 May 2010, Pages 620–624 , Simultaneous isolation of intact mitochondria and chloroplasts from a single pulping of plant tissue
17. http://pc8-27.edus.uwindsor.ca/samples/WebSite/chloro.html
22. http://knowledgatism.blogspot.cz/2011/01/dna-electrophoresis.html
http://www.recman.cz/en/ionosep_2002.htm
http://web.natur.cuni.cz/~pcoufal/cze.html
http://www.bio-rad.com
http://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/Techniques/TechElectrophoresis.htm
23, https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/polyacrylamide-matrix
http://ocw.mit.edu/courses/biological-engineering/20-109-laboratory-fundamentals-in-biological-engineering-fall-2007/labs/mod1_2/
24. http://students.washington.edu/uwfarm/2011/02/10/food-science-2-0-fragments-of-heredity/
25. http://www.eurobiotechproject.net/doc/wp7/ELECTR1.pdf
27. humgen.wustl.edu
Analysis of supercoiled DNA by agarose gel electrophoresis using low-conducting sodium threonine medium
Tomomi Ishido et. al., Analytical Biochemistry, Vol. 400, Issue 1 1 May 2010, Pages 148–150
29. http://www.thermoscientificbio.com/nucleic-acid-electrophoresis/2x-rna-loading-dye/
http://delliss.people.cofc.edu/virtuallabbook/LoadingGel/LoadingGel.html
http://www.gendepot.com/kb/subview.php?sel_a=25&sel_b=43&sel_c=&idx=325&sel_page=sub_view_new
30. http://darwin.wcupa.edu/beneski/bio-515/f09/mohanty/Main/TPM3
31. http://www.innovateus.net/innopedia/what-does-sybr-green-mean
http://en.wikipedia.org/wiki/File:SYBR_Green_I_spectra.png
32. http://www.innovateus.net/innopedia/what-does-sybr-green-mean
http://en.wikipedia.org/wiki/File:SYBR_Green_I_spectra.png
33. http://www.biotium.com/product/product_info/safety_report/GR%20&%20GG%20safety.pdf
Ohta T, Tokishita S, Yamagata H. (2001). "Ethidium bromide and SYBR Green I enhance the genotoxicity of UV-irradiation and chemical mutagens in E. coli.". Mutat Res. 492 (1-2): 91–7.
34. http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/gene15.php
http://bioweb.wku.edu/courses/biol350/enzymetools7/review.html
37. http://www.bio-rad.com/webroot/web/html/lsr/products/electrophoresis/product_overlay/global/electro_dgge.html
https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/sscp-analysis
38. http://www.nal.usda.gov/pgdic/Probe/v2n3/puls.html
40. http://www.hellma-analytics.com/text/130/en/micro-volume-analysis-traycell.html http://eshop.eppendorfna.com/product/view/507/ mOzgova et al. The Plant Cell Vol. 22: 2768–2780, August 2010
41. http://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/e12b12ef-e6e2-4ae3-9faa-fd4bfb60ccca/SmartSpec-Plus-Spectrophotometer
http://www.biochrom.co.uk/product/24/biochrom-wpa-biowave-ii-uv-visible-spectrophotometer-with-life-science-methods.html
http://cs.wikipedia.org/wiki/Soubor:Spektrofotometr.jpg
http://www.eastport.cz/genova-plus-life-science-jenway-bibby-scientific.html
42. http://iopscience.iop.org/2043-6262/3/4/045012/article
...a příště
Miloslava Fojtová
Manipulace s DNA (štěpení, klonování, značení, ...)
Enzymy používané v molekulární biology (restrikční endonukleázy typu I, II, III;
metylačně citlivé enzymy, izoschizomery)
Vektory (bakteriofágy, plasmidy, cosmidy, umělé bakteriální a kvasinkové
chromozómy)
Klonování do plasmidu (ligace s tupými a kohezními konci, transformace
s použitím chemicky kompetentních buněk, transformace elektroporací,
screening)
Radioaktivní a neradioaktivní metody značení nukleových kyselin.
Děkuji za pozornost