Histologické techniky
stručný přehled
Iva Dyková

Histologická / histopatologická vyšetření
Histologické techniky
Histologická technika – soubor postupů, kterými připravíme tkáně
pro mikroskopické vyšetření - obvykle v procházejícím světle
Prohlížíme tenké histologické řezy, které získáme na základě serie postupů, k nimž patří:
§ odběr tkáňových vzorků (excize)
§ fixace
§ odvodnění a prosycení „parafinem“
§ příprava řezů
§ odparafinování, převedení řezů do vody
§ barvení
§ odvodnění
§ příprava trvalých preparátů (montování)

Odběr vzorků tkání
Excize / šetrné vyříznutí
vzorků z tkání a orgánů
(vzorek = excize)
Odběr provádíme co nejdříve, bezprostředně po uhynutí / usmrcení,
tj., z čerstvého kadaveru
Velikost vzorků – dost velké aby obsahovaly normální i alterovanou tkáň,
dost malé aby se rychle a dobře nafixovaly
Opatrný odběr, tkáně jsou křehké, snadno se poškodí např. pinzetou;
Doba fixace se řídí rychlostí penetrace fixáže do hlubších vrstev vzorku
K rutině histopatologických laboratoří patří uschování tzv. zbytkového materiálu
až do stanovení diagnozy
Dodržují se zásady přesné archivace dat o původu odebraných vzorků,
archivují se i bločky pod pořadovými čísly s označením roku
§ odběr tkáňových vzorků (excize)
§ fixace
§ odvodnění a prosycení „parafinem“
§ příprava řezů
§ barvení
§ příprava trvalých preparátů (montování)

Cílem fixace – zachovat tkáně ve stavu, který se co nejvíce podobá intravitálnímu
(konzervace struktur / morfologie i chemického složení) a umožní následné obarvení
Fixáže – chemické látky s následujícími vlastnostmi:
musí působit rychle, fixovat tkáň dříve než nastoupí post-mortální změny (autolysis),
(musí pronikat rychle i do hlubších vrstev vzorku),
měly by zabránit vyplavení rozpustných látek z cytoplasmy buněk, vzniku artefaktů,
neměly by působit nadměrné smrštění tkání a ztvrdnutí.
Jednoduché fixáže: (10% formol)
„Složité“ – z více komponent (Boiun, Davidson, FAA, atd.)
Fixace
DSCN0615
objem vzorku
objem fixáže (10x větší)
tvar fixační nádoby ! (tkáně ztvrdnou)
označení obyčejnou tužkou !
§ odběr tkáňových vzorků (excize)
§ fixace
§ odvodnění a prosycení „parafinem“
§ příprava řezů
§ barvení
§ příprava trvalých preparátů (montování)

Odvodnění
Tkáně obsahují vodu, aby mohly být zpevněny prosycením „parafinem“ musí být
odvodněny pomocí tekutin, které vodu pohlcují
Vzestupná řada alkoholů (EtOH) a impregnace organickým rozpustidlem, které
Rozpouští parafin (xylol, toluen, chloroform atd.)
Technické provedení – individuálně / v kazetách / pomalým postupem / automatikou
DSCN0588up Dscn0628 DSCN0584up
§ odběr tkáňových vzorků (excize)
§ fixace
§ odvodnění a prosycení „parafinem“
§ příprava řezů
§ barvení
§ příprava trvalých preparátů (montování)

Zalití vzorků do „parafinu“
Prosycení parafinem udržovaným v tekutém stavu v termostatu při teplotě dané
bodem tání parafinu (56-58ºC) – 3 parafinové lázně, čistý parafin pro bločky
Příprava bločků – různé tvary / typy formiček, historicky skládané krabičky
Po ztuhnutí parafinu – případná úprava bločků – odstranění nadbytku parafinu
Upevnění bločku na podložku sloužící k upevnění do mikrotomu
Dscn0624up DSCN0616up
§ odběr tkáňových vzorků (excize)
§ fixace
§ odvodnění a prosycení „parafinem“, bločky
§ příprava řezů
§ barvení
§ příprava trvalých preparátů (montování)

Mikrotomy:
Stabilní poloha bločku, horizontální pohyb nože – sáňkové mikrotomy
Stabilní poloha nože, vertikální pohyb bločku – rotační mikrotom
Úhel nože ve vztahu k bločku
Příprava histologických řezů
histol technika
Histologické řezy 4-6 mikrometrů
DSCN0598up
§ odběr tkáňových vzorků (excize)
§ fixace
§ odvodnění, prosycení „parafinem“, bločky
§ příprava řezů
§ barvení
§ příprava trvalých preparátů (montování)

histol technika histol technika histol technika DSCN0607up
Napínání řezů na vodní hladině, vhodné nastavení teploty vody, adheze na podložní sklo


Barvení histologických řezů
Rehydratace řezů – po rozpuštění parafinu organickým rozpustidlem a sestupnou řadou alkoholů
Barvičky / barviva – přírodní (karmín, hematoxylin, orcein, šafrán)
                umělá / syntetická – kyselá - cytoplasmatická (eosin)
basická - jaderná (metylenová modř)
neutrální - (červeň šarlachová)
DSCN0613
Ortochromatická / metachromatická barviva
Význam barevného indexu (C. I. No 75290)
DSCN0593up
§ odběr tkáňových vzorků (excize)
§ fixace
§ odvodnění a prosycení „parafinem“, bločky
§ příprava řezů
§ barvení
§ příprava trvalých preparátů (montování)

Barvicí postupy: přímé
            nepřímé (s použitím tzv. mořidel – kamenců = sírany Fe, Cr, Al)
             progresivní- (barvivo se nechá působit až do žádaného odstínu)
             regresivní – napřed se řez přebarví, pak se diferencuje
DSCN0606up Dyková 001up DSCN0582up
Odvodnění před zamontováním, význam projasňování řezů
Montování do kanadského balzámu ředěného xylolem

Barvení v histologii
Hematoxylin a eosin (HE)
Trichrom podle Malloryho
Van Giesonovo barvení
Metoda podle Giemsy
likvidace trichr Acanth 636 270 VanGieson 002 Weigert 001

Identifikace specifickýchn struktur
(kolagen, elastická vlákna, sekrety, pigmenty atd.

Speciální /selektivní barvení identifikované struktury/ komponenty
Van Gieson kolagen, hladký sval
Perls železo
Hall žluč
Schmorl melanin
Mucicarmín muciny
PAS glykogen, kys. mukopolysacharidy
Bodian axony
Luxol fast blue myelin

Diagnostické postupy v histopatologii
Založeny na mikroskopickém vyšetření
Histopatologické diagnózy versus etiologické diagnózy
Čím je výsledek histopatologického vyšetření limitován:
 determinace patogenních agens / etiologie lezí;
                              souvztažnost jevů, versus  „počitačové diagnózy“
39 512