Translace - překlad genetické informace Složky translačního aparátu: • mRNA • 20 standardních aminokyselin (+ SeCys. Pyrrolyzin)) • molekuly tRNA • aminoacyl-tRNA-syntetázy • ribozomy • translační faktory: IF, EF, RF • ATP, GTP Struktura molekuly tRNA 2 Sekundární struktura tRNA dihydrouridinové rameno DHU-smyčka\ 3- aa akceptorové rameno PARAKODON pseudouridinové rameno smyčka antikodonové rameno Vazby, kterými vzniká terciární struktura tRNA. černé kroužky = standardní nukleotidy šedé kroužky = neobvyklé nukleotidy Srovnani struktury prokaryotickeho a eukaryotickeho ribozomu 70S Prokaryoticky ribozom MW 2,500,000 MW 1,600,000 MW 900,000 / 5S rRNA 120 nucleotides \ / 23S rRNA 2900 nucleotides 16S rRNA 1540 nucleotides 34 Droteins 21 proteins SOS Eukaryoticky ribozom 5S rRNA 120 nucleotides 28S rRNA 5.8S rRNA 4700 nucleotides 160 nucleotides MW 1,400,000 18S rRNA 1900 nucleotides -49 proteins -33 proteins 4 Sekundární struktura 16S rRNA E. coli 5 Struktura molekul rRNA (5S a 23S) ve velké ribozomové podjednotce bakterií stanovená rentgenovou krystalografií Trojrozměrná struktura rRNA a L1 proteinu v poměrné velikosti Schema sekundární struktury 23S rRNA Peptidyltransferázová aktivita 23S rRNA - ribozymu None I II III IV V VI Domain left out of the reaction mixture Purifikovaná 23S rRNA z E. coli katalyzuje vytvoření peptidové vazby mezi aminokysleinami vázanými na tRNA za tvorby dipeptidu Schopnost šesti domén 23S rRNA tvořit peptidovou vazbu. Odstranění domény V vedlo k neschopnosti vytvořit peptidovou vazbu, tj. tato doména má při vytváření peptidové vazby klíčovou funkci Struktura velké podjednotky bakteriálního ribozomu Šedě = 5S a 23S rRNA; žlutě: L proteiny rRNA zodpovídá za: 1. Strukturu ribozomu 2. Interakci tRNA s mRNA při translaci 3. Katalýzu peptidové vazby 8 Struktura ribozomu E. coli s vyznačením funkčních míst schéma ribozomu 70S £ neboli místo P neboli peptidylové A neboli aminoacylové exitu tRNA vazebné místo vazebné místo (a) 9 Standardní genetický kód Kodony První nukleotid Druhý nukleotid Třetí nukleotid U C A G U Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser N N nebo Secys A Leu Ser N (pyrrolyzin) Trp G C Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gin Arg A Leu Pro Gin Arg G A lle Thr Asn Ser U lle Thr Asn Ser C lle Thr Lys Arg A Met nebo 1 Thr Lys Arg G G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G Kodonové rodiny jsou vyznačeny modře; N = nesmyslný kodon; I = iniciační kodon; Secys = kodon pro selenocystein, UAG = pyrrolyzin Čtení genetického kódu molekulami tRNA 20 standardních aminokyselin 1 20 aa-tRNA-syntetáz i 22-45 molekulárních druhů tRNA (tj.antikodonů) I. 61 kodonů se smyslem a1 a2 | / \ tRNA tRNA! tRNA2 (2 antikodony) | / \ / \ Kolísavé párování bází 1 kodon 4 kodony 11 Kolísavé párování bazí na 5'antikodonu tRNA tRNA Antikodon V*, t-A-N /< 5' "V Kodon Jedna tRNA: AGG Dva kodony: UCU UCC Kolísavá pozice (první báze antikodonu) Třetí pozice kodonu 12 Možnosti čtení třetího nukleotidu kodonu podle pravidel kolísavého párování bází První nukleotid antikodonu Třetí nukleotid kodonu Možnost čtení Organizmy u UCAG Kodonové rodiny Mitochondrie, Mycoplasma, chloroplasty o5U UAG Kodonové rodiny (Ser UCN, Val, Thr, Ala) Eubakterie mem5U AG Dvoukodonové sady Mitochondrie, bakterie, eukaryota m5s2U A(G) Dvoukodonové sady Eubakterie, eukaryota G UC Dvoukodonové sady Všechny G uc Kodonové rodiny Bakterie Q UC Dvoukodonové sady Eubakterie, eukaryota Hyp UCA Arg CGN Eubakterie Hyp UCA Kodonové rodiny kromě Gly GGN Eukaryota A U Thr ACU, Arg Mycoplasma, mitochondrie kvasinek C G Všude Všechny Hyp = hypoxantin; Q = queozin 05U = uracil-5-oxyoctová kyselina; m5S2U = 5-metyl-2-tiouracil; mem5U = 5-metylkarbonylmetyl-2-tiouracil; Kolísavé párování bází mezi antikodonem CGI v tRNA a třemi odlišnými (synonymními) kodony Čtení kodonů pro serin molekulami tRNA Kodon tRNA Antikodon UCU tRNASeri AGG + kolísání UCC UCA tRNASer2 AGU + kolísání UCG AGU tRNASer3 UCG + kolísání AGC Izoakceptorové tRNA jsou tRNA o různých antikodonech vázající tutéž aminokyselinu 15 Srovnání využívání kodonů silně a slabě exprímovaných genů u E. colí u u silně/slabě silně/slabě Phe Leu 39 113 151 102 12 16 71 64 Leu 26 33 -* 3 345 73 69 22 294 67 262 156 118 Met ->■ 2 140 27 130 Val 192 41 119 83 108 66 .48 123 Ser 93 87 6 12 36 49 37 s2 Pro 21 2 29 46 26 162 45 101 Thr 103 137 15 28 46 119 32 76 Ala 173 43 37 178 119 12ô 107 149 ilně/slab Tyrí 34 98 96 65 ochre amber His i Gin 19 75 38 169 95 59 90 166 Asnj i Lys 13 159 101 98 259 106 163 44 Asp< Glu 1 16 204 333 1 06 183 , 106 210 98 silně/slabě Cys opal Trp 13 23 25 34 39 66 Arg 223 101 133 27 42 Ser Arg 10 49 3 1 56 61 28 17 Gly 226 174 124 140 14 42 66 U c A G U C A G U C A G U G A G Silně exprimované geny představuje 24 druhů mRNA s celkovým počtem 5253 kodonů. Mezi tyto geny patří gen pro RNA-polymerázu, geny pro dvanáct ribozomých proteinů, několik proteinů vnější membrány a geny pro elongační translační faktory. Slabě exprimované geny představuje 18 druhů mRNA s 5231 kodony. Patří sem několik represorových genů, gen pro transponázu a B-laktamázu. Kodony, které jsou čteny jen jedinou tRNA a jejichž výběr je závislý na povaze a síle interakcí mezi kodonem a antikodonem, jsou v rámečku. Šipkami jsou označeny kodony, které jsou používány jen zřídka a mohou se podílet na regulaci genové exprese. 1( Klasifikace aminoacyl-tRNA-syntetáz První třída (acylace na C2') Druhá třída (acylace na C3') Specificita pro aminokyselinu Počet podjednotek Specificita pro aminokyselinu Počet podjednotek Arg monomerní Ala tetramerní Cys monomerní Asn dimerní Gin monomerní Asp dimerní Glu monomerní Gly tetramerní(a2(32) Ne monomerní His dimerní Leu monomerní Lys dimerní Met dimerní Phe tetramerní(a2(32) Trp dimerní Pro dimerní Tyr dimerní Ser dimerní Val monomerní Thr dimerní Např: tryptofanyl-tRNA-syntetáza Bez ohledu na společnou funkci jsou syntetázy strukturně odlišné Translace probíhá ve dvou etapách: 1. mimoribozomové (připojení aminokyseliny k její tRNA pomocí aminoacyl-tRNA-syntetázy) 2. ribozomové (na ribozomech jsou přiřazovány aminokyseliny podle sledu kodonů) Ribozomová etapa má tři fáze: 1. Iniciace translace 2. Elongace polypeptidového řetězce 3. Terminace translace 1. Mimoribozómová etapa: Nabíjení tRNA aminokyselinou 1. Vytvoření aminoacyladenylátu 2. Přenos aminokyseliny na tRNA aa + ATP-► aminoacyl-AMP + PPi aminoacyl-AMP + tRNA-►aminoacyl-tRNA + AMP 19 Vznik aminoacyl-tRNA působením aminoacyl-tRNA-syntetázy /Amidů ATP □cid sire site i RNAsitr- 3 vazebná místa na aa-tRNA-syntetáze 1. aa + ATP --- aa-AMP + PP Vznik aminoacy laděny lát u 2. aa-AMP + tRNA vznik aa~tRNA tRNA s nabitou aminokyselinou 1. pro aa 2. pro tRNA 3. pro ATP Vazba správné tRNA je stabilizována konformační změnou enzymu, která umožní rychlou aminoacylaci. Pokud je navázána chybná tRNA, ke konformační změně nedojde. Výsledkem je pomalejší reakce a disociace tRNA. Přenos na ribozom 20 Ribozomová etapa translace - 3 fáze 1. Iniciace translace - vazba mRNA a první aa~tRNA na ribozom 2. Elongace polypeptidového řetězce - průběžné přiřazování aminokyselin do rostoucího polypeptidového řetězce podle kodonů na mRNA 3. Terminace translace - zakončení syntézy polypeptidového řetězce, odpoutání mRNA z ribozomu a jeho rozpad na podjednotky 21 Zařazování metioninu do polypeptidu během iniciace translace a během její elongace u prokaryot - odlišné vlastnosti tRNA vázajících Met Podobá se spíše peptidyl-tRNA formyl fMet-tRNAfMet IF2 30S Vazba na iniciační kodon AUG v P místě r bozomu EF-Tu Kompletní ribozom, vazba v A-místě Vazba na kodon AUG pro Met uvnitř genu fMet—protein Deformylace (deformyláza) fMet (aminopeptidáza) 22 Metionin je po vazbě na fmet-tRNAi formylován na formylmetionin, který je po začlenění do polypeptidu deformylován na metionin, který může být následně z N-konce polypeptidu odstraněn h h n c-cooh 2 blokuje NH2-skupinu h h f ormyl h ch transformyláza ch cooh ch CH S ch deformyláza aminopeptidáza metionin N-formylmetionin 23 A) Struktura iniciátorové tRNA B) Formylace metioninu na iniciátorové tRNA H II Formylated amino acid I'ormvl I ' Met I A C C CH3SCH2CH2 — C — NH 2 CH3SCH2CHg - C-NH-C-H c=o I c=o o I formylace G-C C-G G-C G-C í 111) 1U O Met-tRNAr G-C C G G C C s GUUGG U A A A C U GGD CG AG i • • • GCUC A G U G G T¥ C 10-formyl tetrahydrofolate N-formyl-Met-tRNAf. tetrahydrofolate A U-A C-G G-C G-C "< G-C C A U A C . U A Sekvence umožňující vstup do P místa 24 Tři fáze translace u prokaryot Ribosome 3. Terminace mRNA mRNA tRNAand Qji amino acid j «■ (formylmethionine) j f~ Initiation factors Initiation factors (regenerated) and GDP Elongation factor Tu (regenerated), GDP Peptidyltransferase Elongation factor G (regenerated) and GDP 1. Iniciace Elongation factor G and GTP 25 Iniciace translace u prokaryot (E. coli) Vazba mRNA na 16S-rRNA AUUCCUCCACUAG I I I I I I I I I I I G G U G A U C 16S-rRNA A G G A A U G Shineova-Dalgarnova sekvence RBS Iniciační kodon P místo mRNA Shineova-Dalgarnova translační sekvence iniciační kodon 5' •• AACAC AUUAUCC UCGACUCGTAU 3' 16S rRNA "V oblast párování bází o. ^UUGGCGUCCAA' CAAl 5' konec Elongace polypeptidového řetězce (1) V™y Aminoacyl-tRNAvstupuje do místa A ribozo™. AlUjGlGjC j1a| - cw B is EF-Tu-GTP: vnáší aa-tRNA do místa A, při tvorbě peptidové vazby je GTP hydrolyzován na GDP EF-G-GTP: zajišťuje translokaci ribozomu o jeden kodon Elongace (2) pokr. předchozího obrázku Opakování kroků 1-3 j Translokace ribozomu o jeden kodon rostoucí potypeptidový řetězec Elongační fáze translace 1. aa-tRNA (druhá a všechny další) vstupuje do místa A a váže se svým antikodonem na kodon mRNA v A místě 2. Vytváří se peptidová vazba mezi poslední aminokyselinou rostoucího polypeptidu a aminokyselinou vázanou na tRNA, která se posunuje do místa P. Začíná translokace ribozomu. 3. Ribozom se posunuje na mRNA o jeden kodon, prázdná tRNA ze uvolní z místa E 4. Do místa A vstupuje další aa-tRNA 2. krok Účast translačních faktorů při zajištění přesnosti translace 1. aa~tRNA pevně vázaná na EF-Tu se přechodně váže s kodonem v A-místě 30S. 2. aa~tRNA se nachází v hybridním místě, párování kodon-antikodon vede k hydrolýze GTP navozené EF-Tu. Chybné zařazení tRNA zpomaluje hydrolýzu a aa~tRNA tak může opustit ribozom ještě před vytvořením peptidové vazby. Časový prostoj mezi vazbou aa~tRNA na kodon a její dostupností pro elongaci zvyšuje přesnost translace 3. V případě zařazení správné aa~tRNA dochází k disociaci EF-Tu a aa~tRNA se tak dostává do místa A a může se účastnit elongace peptidového řetězce. 4. Na ribozom do (nebo poblíž) místa A na 50S se váže EF-G +(GTP) a urychluje pohyb tRNA do hybridních míst A/P a P/E. 5. Kontakt EF-G s ribozomem stimuluje GTP-ázovou aktivitu EF-G - dochází ke konformační změně EF-G, pomocí níž je tRNA přesunuta z hybridního místa A/P do místa P a proces translace tak posune o jeden kodon = translokace ribozomu. Rychlost syntézy: 2-20 aminokyselin/sec Terminace syntézy polypeptidového řetězce Termínace translace 1. Do místa A se dostává terminační kodon na mRNA 2. V místě A se na terminační kodon váže terminační (uvolňovací) faktor (RF1,RF2 n. RF3 3. Změna aktivity peptidyltransferázy vede k uvolnění karboxylového konce peptidového řetězce z P místa, volná tRNA se přesouvá do E místa a opouští ribozom 4. Ribozom disociuje na podjednotky, které se mohou účastnit dalšího cyklu translace Struktura lidského terminačního faktoru eRFI a jeho podobnost s molekulou tRNA terminační faktory = molekulární mimikry 34 Zakončení translace molekulou tmRNA tmRNA (transfer/messenger) mRNA s neúplnou délkou - chybí STOP kodon Pozastavený ribozom na mRNA Short message (~10aa) age Stop codon tmRNA navázaná v A místě ribosome stalled on broken mRNA H2N <2§> WĚ tmRNA broken RNA rejected * -4—.1 elongation resumes using codons of tmRNA IOOOOOOOOOOO incomplete protein 11-amino acid tag Degradace peptidu specifickou tag-proteázou Inkorporace selenocysteinu do polypeptidového řetězce - čtení bifunkčního kodonu UGA serine i A C U seryl-tRNA synthetase seíeřiocysteine tRNA SELB se lenocystei ne-specif ic translation factor serine enzymatically converted to selenocysteine Speciální tRNASec selenocysteine »- added to growing peptide chain Potenciální stop kodon UGA Speciální sekvence pro SELB (Element SECIS) Vnášení tRNA-sec na vnitřní stop kodon UGA a) U bakterií b) U savců Single protein binds tRXA-Sec and šlem - loop mRNA Vlásenka je součástí kódující sekvence mRNA H,N—C — COOH CH2 OH serin CIL I " S I II Cysteine m RNA Vlásenka je součástí 3'netranslatované mRNA H HaN — C — COOH CH, II SEI.EXOCYSTĽINE I ^*e* 1 Translace u eukaryot r>HIfidn malá ribosomální podjednotka s navázanými iniciačními laktory 1. na čepičku na mRNA se postupně navážou elF-4F, elF-4A, a elF-4B (dohromady tvořící CBP-protein) 2. Je vyhledán iniciační kodon a Met-tRNAmet je umístěna proti němu (v P místě) 3. Uvolní se iniciační faktory a připojí se podjednotka 60S 4. Začíná fáze elongace EF-1 a EF-2 (analogy EF-Tu, Ts) vazba mRNA mRNA AUG čepička RNA Met Iniciační tRNA se pohybuje podél mRNA, a hledá první triplet AUG faktory disociují naváže se velká ribosomální podjednotka navaze se aminoacyl-tRNA (1. krok) tvoří se první peptidnvá va^ba (2. krok) elF4A a B se podílejí na rozmotání sekundární struktury mRNA elF6 udržuje ribozom v disociovaném stavu 1. u baktérií se iniciační komplex tvoří přímo na sekvencích ohraničujících AUG 2. u eukaryot nejdříve 40S rozpozná 5' konec mRNA a pak se pohybuje k iniciačnímu místu, kde se spojuje s 60S elF-2 initiator tRNA small ribosomal subunit with initiator tRNA bound AAAAAAAAI^. relF-4G « mRNA elF-4E 5' cap additional initiation factors mRNA AUG INITIATOR tRNA MOVES ALONG RNA SEARCHING FOR FIRST AUG igďpI (pí + elF-2 AND OTHER INITIATION FACTORS DISSOCIATE AMINOACYL-tRNA BINDS |Met|(aa) (step1) FIRST PEPTIDE BOND FORMS (step 2) Iniciace translace u eukaryot eIF-4G je vázán na polyA-konec RNA a na eIF-4E vázaný na čepičku = překládány budou jen mRNA s úplnou délkou Standardní signální sekvence exportovaných proteinů i Pozitivní , , Hydrofobní doména Oblast štěpení zbytek proteinu doména i místo štěpení vedoucí (signální) peptidaza 40 Kotranslační export proteinů u bakterií 41 Syntéza extracelulárních a membránových proteinů preprotein = polypeptid se signálním peptidem na N-konci SRP odstraněn a recyklován 42 Translokace proteinu membránou do vnitřního prostoru endoplazmatického retikula COOH Začlenění transmembránového proteinu do membrány ER Posttranslační procesy 1. Kotranslační úpravy * deformylace * odštěpení aminokyselin z N-konce aminopeptidázou * chemické modifikace aminokyselin (hydroxylace, fosforylace, acetylace, aj). * tvorba disulGdových můstků - vznik terciární struktury připojení cukerných zbytků (oligosacharidů) - glykozylace, vznik glykoproteinů * vznik sekundární a terciární struktury 2. Posttranslační úpravy * v\ štěpení peptidů (proinzulin > inzulín) * tvorba kvarterní struktury (spojování protomerů do aktivních oligomerů) * přidání prostetických skupin, koenzymů apod. (hemoglobin) * posttranslační štěpení polyproteinů (polypeptidovy prekursor > peptid, např. ACTH) * proteinový sestřih (vyštěpení IVPS - intervening protein sequence), vytvoření nové peptidové vazby 3. Sestavování oligomerních proteinů a nadmolekulárních struktur (nekovalentní interakce mezi rozpoznávacími místy polypeptidových řetězců) * tvorba organel (membrány aj) účast chaperonů a chaperoninů při sestavování struktur 4. Samosestavování (spontánní seskupení proteinových podjednotek) * ribozomy * morfogeneze virů (sestavení virových kapsidů) 45 Modifikace aminokyselin Dekódováním mRNA při translaci je možno do bílkoviny vybrat jen asi 20 aa - z bílkovin lze však vyizolovat až 100 různých modifikovaných forem aminokyselin: a) hydroxylovaný prolin a lyzin b) fosforylovaný serin, treonin, tyrozin c) karboxylovaná kys. glutamová d) acetylovaný lyzin e) metylovaný lyzin a prolin adenylovaný tyrozin glykozylované zbytky modifikace lipidickými zbytky * zbytky nenasycených mastných karbonových kyselin (acylace: 12C - laurylace, 14C - myristylace, 16C - palmitylace) * zbytky polyizoprenového charakteru (iso/prenylace: 15C - farnesylace, 20C - geranylgeranylace) Mnohé modifikační enzymy se nacházejí v ER a Golgiho Mikrozomální aparátu, někdy však dochází ke změnám až mimo buňku. frakce 46 Průběh vzniku funkčního proteinu Sbalování, vazba kofaktorů (nekovalentní interakce) Kovalentní modifikace (glykozylace, fosforylace, acetylace aj) Vazba dalších proteinových podjednotek Kotranslační sbalování proteinu Sbalená C-terminální mRNA ribosome 48 Sbalování proteinů za účastí chaperonů Nesbalený protein Správně sbalený protein Molekulární chaperony/chaperoníny • speciální skupina proteinů podílejících se na sbalo-vání polypeptidů (zabraňují chybnému sbalování) • hlavní rodiny chaperonů: proteiny hspóO a hsp70 Ohsp70: rozpoznávají krátké úseky polypeptidů tvořené hydrofobními aminokyselinami během jeho syntézy na ribozomu O HspóO (GroE; Hsp60/Hsp10): vytvářejí soudkovité struktury, v nichž se upravují kompletně nasyntetizované proteiny Dva obecné mechanismy působení chaperoninů Hsp70 B) Protein released and partially folded Folded protein GroE Unfolded protein GroE-type chaperone Folded protein Účast chaperonů na procesu sbalování proteinů správně sbalený poiypeptid Hsp70 se váže na hydrofobní oblasti (GroEL, GroES) proteinu a zabraňuje jeho agregaci. Další úlohy: • transport • disagregace denaturovaných hsp = heat shock protein proteinů (např. Hsp60) 52 Posttranslační úprava proinzulínu Proteinový sestřih srovnání způsobů odstraňování intronů a inteinů mRNA Exon 1 Exon 2 Translation Protein ExLdnl Intem Extern 2 tĚĚÉ Transcription Dna Transcription rna Exon 1 Intron Exon 2 Extein 1 Intein Extein i spitcimo of rna TION Inteiny byly zjištěny u kvasinek, řas, bakterií a archeí - obvykle je přítomen jen jeden intein, výjimečně dva Ar Fl From From exon 1 ;ntcin From exon 2 SPHOINgÄ PROTEI m Intein katalyzuje své vlastní vyštěpení 54 Průběh sestřihu inteinu probíhá ve dvou krocích 1. Extein 1 je uvolněn a připojen k cysteinu exteinu 2 - vzniká větvený intermediát 2. Intein je vyštěpen a oba exteiny se spojí peptidovou vazbou do zralého proteinu Inteins are currently known in more then 200 types of proteins with diverse in functions. These proteins include metabolic enzymes, DNA and RNA polymerases, proteases, ribonucleotide reductases, and vacuolar-type ATPases. Final protein formed Sestřih inteinu (proteinový sestřih) íntein-containing gene Transcription Intein DNA jumps Cut by the intern Genová konverze Intein homing N-extein Sestřih Sekvenčně-specifická endonukleáza Štěpení genu bez inteinu v místě, kam se má začlenit intein Konzervativní sekvence aminokyselin Intein-minus gene 140-850 aa +/- homing endonuclease gene (HEG) 56 TŘI SESTAVOVACÍ ŘADY ocásek hlava I s.6.7.8.10.25,26. { 27.28.29.48,51.53 | 11 vlákna ocásku 37.38 bazálni destička ' bazálni - destička spojená s proteiny dutiny ocásku připojení obalového prcsäeinu Čísly jsou označeny strukturní geny, kterými jsou kódovány proteiny fága kompleíní T^'\ vlákna ocásku kompletní fágový virion + labilní faktor Buněčné mechanismy monitorující kvalitu proteinů po translaci Proteinové agregáty Správně Správně sbalen sbalen bez s pomocí cizí pomoci chaperonů Neúplně sbalená forma je rozložena v proteazomu 58 Odbourávání proteinů v proteazomech (eukaryota) Schéma cyklu ubikvitinu Eí = enzym aktivující ubikvitin. £2 = enzym přenášející aktivní ubikvitin sbalený protein na sbalený protein. Protein určený k odbourání ~ Označení ubikviíinem za účasti enzymu E2. -19s Aktivace ubikvitinu enzymem B1. 20 s proteáza 19 s Odbouráni proteinu proteázou. fragmenty centrální cylindr aktivní místa proteáz 19S „cap" - váže označené proteiny Označování proteinů ubiqutinem A. Aktivace ubiquitinu prostřednictvím enzymů El, E2 a E3 ubiquitin SH ubiquitin -activating enzyme COO" s-c=o AMP binding to ubiquitin ligase p>Tp, B. Připojení ubiquitinu na cílový protein ubiquitin ligase primed with ubiquitin e-amino group on lysine side chain degradation signal on target protein target protein bound to ubiquitin ligase first ubiquitin chain added to target protein target protein with multiubiquitin chain Ubiquitin či ubikvitin (z lat. ubique, všude) je malý globulární protein o délce 76 aminokyselin, přítomný ve všech eukaryotických buňkách, který reguluje rozklad jiných proteinů v proteazomu, lyzozomu či ve vakuole. V určitých případech však také stimuluje endocytózu, vnitrobuněčný transport a podílí se na udržování struktury chromatinu (ubiquitin se váže se na histony).[l] Ubiquitin se zpravidla připojí na protein, který má být rozložen (degradován), tento proces navázání ubiquitinu se označuje jako ubiquitinace. Váže se glycinem (na svém C-terminálním konci) k lysinu na proteinu určeném k degradaci.[l] Po připojení ubiquitinu je označený protein degradován proteasomem 26S. Tato degradace je specifická a přesně cílená, je tedy často využívaná pro specifické odstranění proteinů signálních drah. Proteiny degradované proto, aby jejich aminokyseliny, případně peptidy mohly být použity jako stavební kameny, bývají degradovány spíše nespecificky proteázami. Mechanismus připojení Na cílový protein, určený k degradaci, se ubikvitin váže pomocí tří enzymů, aktivačního El, konjugačního E2 a ligačního E3. Ligační enzym se spojí s cílovým proteinem. Aktivační enzym nejprve ubikvitin aktivuje na účet ATP a poté ho předá konjugačnímu enzymu, který se spojí s komplexem, tvořeným ligačním enzymem spojeným s cílovým proteinem určeným k degradaci. V tomto komplexu tvořeným E2, E3, ubikvitinem a cílovým proteinem pak dojde k navázání ubikvitinu na cílový protein. E2 a E3 se recykluje.[2] 61