Makroskopické a mikroskopické
pozorování bakterií
Cíl – zjištění morfologie bakteriálních kultur z
minulého cvičení
Gramovo barvení
Pozorování preparátů (Gram, nativní preparáty)
• Při správně provedeném křížovém roztěru jsou na misce
patrné jednotlivé kolonie, které můžeme pozorovat a
hodnotit.
Smíšená kultura (transtracheální efuse koně)
organizmus kolonie na MPA růst v MPB
tvar okraj profil zbarvení blanka zákal vločky sediment zbarvení
Escherichia coli
CCM 3954
Pseudomonas
putida
Serratia
marcescens
CCM 303
Kocuria rosea
CCM 839
Micrococcus
luteus
CCM 169
Bacillus cereus
CCM 2010
Staphylococcus
aureus
SA 812
Saccharomyces
cerevisiae
Saccharomyces
cerevisiae
Saccharomyces
pastorianus
Některé morfologické znaky je ale třeba posuzovat
v mikroskopickém preparátu (nativní preparát, vlhká
komůrka, vitálně barvené preparáty, negativně barvené
preparáty, atd.).
Fluorescenční mikroskopie
Fixace i barvení mírně buňku deformují! Charakteristický tvar zůstává, ale
pro měření přesné velikosti buněk nutno využít nefixovaný preparát negativně
obarvený (barví se jen okolí buňky, nikoli ona samotná
Barvivem zvýrazníme tvar buňky (jednoduché barvení buněčné stěny), či
zjistíme, zda je živá (vitální test). Její struktury rozlišujeme diferenciačním
barvením a to jak morfologické útvary (spory, stěny), tak chemické složky
(barvení volutinu, glykogenu, škrobu..). Diagnostické barvení nám pak pomáhá
identifikaci (Gramovo, acidorezistentní...).
Postup barvení:
• Připravíme nátěr bakteriální kultury, vysušíme a fixujeme plamenem.
• Preparát ponoříme do krystalové violeti na 30 sec.
• Opláchnout vodou.
• Preparát ponoříme do Lugolova roztoku na 30 sec.
• Opláchnout vodou.
• Odbarvit etanolem či acetonem 20-30 sec.
• Opláchnout vodou.
• Preparát ponoříme do safraninu na 30-60 sec.
• Opláchnout vodou, osušit, pozorovat pod imerzí.
G+ tmavě fialová/modrá až modročerná barva
G- červené či růžové zbarvení
Nejčastější chyby: příliš hustý nátěr, silný oplach vodou (spláchnutí)
sušení preparátu za tepla – t.j. uvaření buněk
příliš dlouhé odbarvování alkoholem nebo acetonem
!!! Jaké bakteriální rody Gramovým barvením neobarvíme?
→ rody bez buněčné stěny (mykoplazmata), spirálovité bakterie, silně
acidorezistentní rody (např. mykobakterie)
Buněčná
stěna!!!!!!
Kvasinky
G+ G-
G+/- tvar buňky charakteristické
shluky/dvojice/tetrády
Escherichia coli
CCM 3954
Pseudomonas putida
Serratia marcescens
CCM 303
Kocuria rosea
CCM 839
Micrococcus luteus
CCM 169
Bacillus cereus
CCM 2010
Staphylococcus aureus
SA 812
Saccharomyces cerevisiae
Mikroskopický preparát
Gramlabilní kultura (Acinetobacter)
Postup
•Zhodnocení růstu z minulého týdne
(roste x neroste x kontaminace)
•Zhodnocení morfologie kolonií (velikost, tvar, profil,okraje, povrch,
transparence, pigmentace, vůně, změny média, …)
•Tekuté půdy (sediment, blanka, zákal, vločky, zbarvení)
•Gramovo barvení (čistá + směsná kultura) + pozorovat všechny
kultury ve cvičení (zápočet!)
•Nativní preparát (fázový kontrast)
•Pozorování pod mikroskopem
•Vyhodnocení G+ x G-, tvar buňky (kok, tyčka, spirily, hvězdice, prostéky,
pupeny,..) + uspořádání (diplokoky, streptokoky, tetrády, sarciny, hrozníčky,..)