Práce s bakteriofáqem Cíl: Stanovit titr fágového lyzátu metodou dvouvrstvého agaru Bakteriofágy • Podskupina virů infikující bakterie —> menší než bakterie • Velice početná skupina • Užívání i k léčbě - vyhubí bakterie • Rozdíly v rozmezí hostitele • Virulentní X temperované fágy - jiný životní cyklus • Velikost 15-300 nm • Genom 2 - 200 kb 72 Životní cyklus fága Heads are packed with DNA. Empty phage heads are synthesized. The phage DNA directs the cell's metabolism to produce viral components— proteins and copies of phage DNA. Collars, sheaths, and base plates have been attached to heads. Tail fibers are added last. Bacterial cell lyses, releasing completed infective phages. Phage attaches to receptor site on another bacterial cell /) wall, penetrates it, and inserts its DNA. Binary fission is completed; each cell has the phage DNA incorporated. Phage is replicated along with the bacterial DNA prior to binary fission. O o Virulentní fág - lytický ŽC 1. Adsorpce virionu na povrch citlivé buňky 2. Penetrace nukleové kyseliny do buňky 3. Replikace fágové DNA, syntéza bílkovin fága a kompletace nových virionů 4. Uvolnění virionů do prostředí - lyže buňky 5. Infekce další buňky tekuté médium - projasnění, tzv. fágový lyzát (zbytky buněk, virové částice, nenapadené buňky, vylité obsahy buněk) nárůst na misce - plaky Plaka = potomstvo 1 fágové částice Tvorba plak A phage infects a single cell ma lavn of sensitive, graving bacteria. Phage reproduces in the cell, typically yielding about 5U progeny phage per infected cell. Lysis of the cell releases phage into the medium The phage diffuses through the medium and infects adjacent cells. L Phase reproduces in these cell, Sing 50 addiuona progeny phage per infected cell. These cells lyse, releasing more phage vhich can then diffuse outward and infect the surrounding cells. Lysis of the cells results in a circular cleanng in the Javn of bacteria. This region of visible lysis is called a plaque. Transdukce • Přenos genetického materiálu z jedné bakteriální buňky do druhé pomocí virové částice • Horizontální výměna genetické informace 1. 2. 3. ŕ/-\ /-\ s-\\ \ ss-í v-i ^-' 4. » 5. _ 6. - &b ■ Bacterial DNA ■ Viral DNA Virion (1) přisedne na povrch buňky a (2) jeho DNA se dostává dovnitř, kde se (3) formují nové viriony, z nichž některé mohou obsahovat DNA hostitelské buňky. Pokud (4) takové viry přisednou na buněčnou stěnu další bakterie a (5) vstříknou do ní geneticky materiál, který nesou, může se (6) tento procesem crossing-overu začlenit do bakteriálního chromozomu Fágová terapie Lyže bakterií - náhrada ATB _______ Specifita virů na rody/druhy/kmeny - léčbě musí předcházet správná diagnóza původce onemocnění Výhody - Bakterie si v dlouhodobém horizontu nedokáží vytvořit rezistenci k bakteriofágům, protože fágy rovněž mutují a některé z těchto mutací pomohou překonat bakteriální rezistenci („nikdy nekončící závod") - Fágy jsou vysoce specifické, konkrétní fág (nebo úzká skupina fágů) je schopen infikovat pouze konkrétní bakteriální kmen (nebo úzkou skupinu kmenů), a tak chrání mikroflóru organismu - Příprava a výroba bakteriofágových preparátů je mnohem levnější než zavedení nového antibiotika - Produkce fágových preparátů je nesrovnatelně rychlejší než zavádění nových antibiotik Příprava fágového lyzátu • 2 ml narostlého 24h inokula S.aureus SA 812 očkujeme do 100 ml čerstvého MPB v provzdušňovací lahvi a za intenzivního provzdušňování pokračujeme v kultivaci další 4h při stejné teplotě (30 °C) • Po 4h aseptický přidáme 10 ml sterilního 0,22% CaCI2 a 5 ml zásobního lyzátu fága 812 a pokračujeme v kultivaci • Po 60 min přemístíme provzdušňovací láhev do temna a pokojové teploty • Za 12 - 24h se médium vyčeří, ale zůstane určitý počet necitlivých buněk, Droto se lyzát sterilizuje přídavkem chloroformu (5-10 kapek na 10 ml yzátu) 1 - 2 hod • Lyzát se přenese do baňky a uchovává se při 4°C (v této formě se významně nemění počet aktivních fágových částic po dobu 1 - 2 měsíců) Příprava hostitelských buněk • ze zásobní kultury S.aureus SA 812 naočkujeme 20 ml sterilního MPB (ve 100 ml baňce) a kultivujeme 24 hodin při teplotě 30°C Stanovení počtu virionů • Lyzát fága 812 zředíme ve sterilním Tris HCI pufru (0,1 ml lyzátu / předchozího ředění do 0,9 ml pufru, na každé ředění používáme čistou pipetu, dobře mícháme) • Připravíme si sterilní zkumavky, které budou obsahovat 3 ml 0,7% MPA, rozvařeného a vytemperovaneho na 50°C • K hostitelským buňkám se sterilně přidají 2 ml 0,22% CaCI2 (do 20 ml), poté se pipetuje 0,3 ml inokula do každé zkumavky • Na misky s 2% MPA se pipetuje 0,1 ml příslušných ředění fága • Miska se ihned zalije obsahem jedné zkumavky, krouživým pohybem se agar promíchá s napipetovanou kapkou a ve vodorovné poloze nechá utuhnout • kultivace při 30°C 12 - 24 hodin Hodnocení • počítáme počet plak na miskách s nejvhodnějším ředěním (20 - 200; méně než 10 plak nehodnotíme) • Výsledek je v PFU/ml Příklad vypočtu: • Na 3 Petriho miskách naočkovaných 0,1 ml vzorku ředěného 105se vytvořil následující počet plak: 122, 132, 139. Aritmetický průměr z těchto hodnot je 131. • Titr lyzátu je: 131 * 105 = 1,31 * 107 v 0,1 ml tedy 1,31 .108 v 1 ml neředěného vzorku Toto číslo ve skutečnosti vyjadřuje počet fáqových částic schopných vytvářet plaky, nikoliv absolutní počet virionu, výsledek se proto uvádí v tzv. PFU = plaques forming units. Titr našeho fágového lyzátu je tedy 1,31 .108 PFU/ml. 0,1 ml 0,1ml 0,1ml 0'lml 0,1ml 0,1ml Tris HCl pufr 05 ml 0 D 0 f ígový lysí it celý obsah zkumavky 3ml MPA 0,7% - 1 Q ll I2 I3 I4 Is I í mpa \ í mpa\ / mpa \ / mpa\ í mpa \ / mpa \ I 2