Izolace vybraných skupin půdních mikroorganizmů Cíl: izolace a průkaz 3 skupin mikroorganizmů (ve vzorku komplex MO) z různých zdrojů půdy (cílová skupina MO se nemusí nacházet v každém vzorku) za selektivních podmínek kultivace 1. Izolace rodu Azotobacter 2. Izolace rodu Clostridium 3. Průkaz celulolytických bakterií Azotobacter G-, tvorba cyst, aerobní, tvorba pigmentu, nesymbiotická fixace dusíku • bezdusíkaté médium (enzym nitrogenáza → dokáže dusík fixovat ze vzduchu) • Ashbyho agar – hodně živin, bez dusíku • http://www.sci.muni.cz/mikrob/Miniatlas/azoto.htm Clostridium – anaerobní bakterie, spory jsou schopny vyklíčit v anaerobním prostředí bujonu pod parafinem, vegetativní buňky usmrceny pasterizací G+, tyčky, tvorba spor, produkce toxinů, výskyt v prostředí C. tetani C. perfringens C. septicum • Celulolytické bakterie (Cytophaga, Cellvibrio, Cellfalcicula, Sporocytophaga,..)– průkaz s jediným zdrojem uhlíku (lístečky s celulózou – noviny, buničina, filtrační papír) • Ukazatel úrodnosti Relativní zastoupení aerobních, fakultativně anaerobních bakteriálních rodů, které se běžně vyskytují v půdě <5Mycobacterium <5Xanthomonas <5Staphylococcus 2-12Micrococcus 2-12Corynebacterium 1-20Flavobacterium 1-20Alcaligenes 1-20Agrobacterium 3-15Pseudomonas 7-67Bacillus 5-60Arthrobacter %Rod Rozklad celulózy • Celulóza - nejběžnější polysacharid v rostlinném opadu, rozklad významnou měrou určuje rychlost přeměny rostlinné hmoty v půdním prostředí • Aerobní rozklad v půdě - úplná respirace, mineralizace organických látek, zisk velkého množství energie (Cytophaga, Sporocytophaga, Cellulomonas, aktinomycety, mikromycety) • Anaerobní rozklad v půdě - máselné kvašení, k. máselná, k. octová, další organické kyseliny, etanol, CO2, H2O (Clostridium), může navazovat produkce metanu (metanové bakterie), CO2+ H2= CH4 – význam: mineralizace v zamokřené půdě – komposty, chlévská mrva – čištění odpadních vod (anaerobní vyhnívání kalů) – výroba bioplynu Není to čistě nitrobuněčný proces! Půda: vliv na zastoupení MO → roční období, půdní typ, dostupnost živin, vody O2, pH, minerály, textura půdy, hloubka • autochtonní MO = typické pro dané prostředí (např. Agrobacterium, Streptomyces) – vždy přítomny v signifikantním množství, nezávisle na množství živin – dlouhodobě na nízké metabolické aktivitě, rychle využívají sebemenší zvýšení koncentrace živin • alochtonní (zymogenní) MO = v daném prostředí se vyskytuje sezónně – závisí na periodickém nárůstu množství živin, běžně přítomny pouze v nízkých počtech – počty závidí na kolísání živin v půdě Agrobacterium Streptomyces Streptomyces Myxobakterie Chondromyces Funkce MO: humifikace, mineralizace, produkce i spotřeba látek, fixace N2 (volná a pevná symbióza), koloběh prvků, bioremediace Průkaz MO → charakteristické reakce (redukce SO4, rozklad močoviny, fixace N2) • Výskyt patogenů primárních (Clostridium) i oportunních Symbiotická fixace dusíku POSTUP • Clostridium – 10 g půdy + 100 ml destilované vody → třepání 10 min – filtrace extraktu přes dvojitý filtrační papír (vrchní část extraktu) do baňky – přelít do zkumavky → 15 min vodní lázeň, 75-80°C – 1 ml extraktu pipetovat do sterilního MPB – převrstvit 1 ml sterilního parafínu • Azotobacter – popsat misku na dno – nadrobit půdu na misku, neotáčet!! • Celulolytické MO – plastové misky, popsat víčko – trochu udusat, přiložit lístečky (buničina, noviny, filtrační papír) a navlhčit půdu i lístečky v misce vodou • !! Hodnocení – Clostridium,Azotobacter – po týdnu – celulolytické MO – po 1., 2. a 3. týdnu kultivace