Pozorování bakteriálních endospor
a negativní barvení
Cíl:
Nativní preparát – tvar, velikost a umístění endospor
(fázový kontrast)
Negativně barvený preparát – pozorování skutečné velikosti a tvaru
buňky, tvorby řetízků, pouzder, kapsulí
Barvení pouzder – Kongo červeň, metylenová modř
Kultury k pozorování:
Bacillus megaterium CCM 2007
Bacillus sphaericus CCM 1615
Paenibacillus polymyxa CCM 1459
Bacillus cereus CCM 2010
Bacillus thuringiensis CCM 19
Negativní barvení
• Obarvení pozadí, buňky nezbarvené, obrys v obarveném
pozadí → stanovení pouzder, slizů, velikost buňky
– Nigrosinem
• Pouzder a kapsulí
Pouzdro: polysacharidy; hlavně u klinických izolátů, chrání před
vysycháním a nepříznivými faktory, látková výměna s vnějším
prostředím, maskování antigenu, větší odolnost, faktor virulence
Azotobacter vinelandii CCM 289
Bacillus thuringiensis CCM 19
Negativní barvení
(Kongo červeň+methylenová modř)
cysty
buňka s
pouzdrem
cysty
buňka s
pouzdrem
buňka s
pouzdrem
Negativní barvení - pouzdro
• Růstový cyklus
– asymetrický
– binární dělení
buněčné formy:
vegetativní buňka
spora
cysta
• Sporulace NENÍ odpověď na nepříznivé
podmínky, ale přípravou na ně!!!!
• sporulují převážně G+ rody
Spora – klidové stadium
Dipikolinát - termorezistence
Proteiny stabilizující DNA
Odlišný peptidoglykan
Reparační enzymy při germinaci
• bílkoviny pláště – význam v chemotaxonomii
• pouze 1 spora v buňce u prokaryot
• často toxigenní a alergenní
(kontaminace potravin), ale i
pro vakcinaci, bioinsekticid
• ověření sterilizace
B. stearothermophilus – spory vydrží
při 120°C až 12 min
• značná odolnost
• umístění spory a tvar– důležitý taxonomický znak
Bacillaceae – 3 morfologické skupiny
Klíčení spory
• přítomnost vody, aminokyselin, vitamínů, zahřátí, …)
• asi 10 min (aktivace spory, vlastní klíčení, diferenciační fáze)
• inhibice klíčení v mediu: D-alanin, MgCl2
Pozorování spor
• Fázový kontrast
(barvitelné a světlolomné až po vzniku
kortexu spory, předtím je při fázovém
kontrastu nelze vidět)
• Nomarského kontrast
– plastický povrch buňky
• barvení buněčné stěny
– jen pro pozorování vyklenutí
• spory jsou barvitelné za tepla,
barvení Schaffer-Fulton (jasné pole)
B. thuringiensis
B. thuringiensis
B. cereus
B. megaterium
B. sphaericus
Postup
• Negativní barvení – nigrosin
– do kapky vody nanést kličku kultury (Azotobacter nebo Bacillus)
– přidat kapku nigrosinu
– rozmíchat, rozetřít druhým sklíčkem a nechat zaschnout
– pozorovat s imerzí v jasném poli (1000x)
• Barvení pouzder (Azotobacter) Kongo červení
– do kapky Kongo červeně nanést bakteriální kulturu a rozetřít po sklíčku
– po zaschnutí se preparát na několik sekund převrství HCl, která se
následně slije
– preparát se osuší filtračním papírem, převrstvit na 3 min metylenovou
modří
– barvivo slít a pozorovat s imerzí v jasném poli (1000x)
• Nativní preparát (Bacillus)
– do kapky vody rozmíchat kličku kultury, přikrýt krycím sklem
– pozorovat do 5 min při fázovém kontrastu (1000x)
• B. sphaericus – kulaté, terminální, ztlušťují buňku
• B. thuringiensis – oválné, subterminální,
nevyklenují
• B. cereus – centrální, oválné, nevyklenují
• B. megaterium – kulaté, subterminální, nezduřují
• Paenibacillus polymyxa – centrální, velké,
vyklenující
Fázový kontrast
fotky
ze cvičení
Bacillus cereus
• centrální, oválné, nevyklenují
Bacillus megaterium
• kulaté, subterminální, nezduřují
Bacillus subtilis
• Oválné, neztlušťuje buňku
Bacillus thuringiensis
– oválné, subterminální, nevyklenují
Subtermínální
umístění
Paenibacillus polymyxa
• centrální, velké, vyklenující
Ztlušťuje buňku
Centrálně umístěná spora
Negativní barvení - nigrosin
Bacillus subtilis Bacillus thuringiensis
Řetízek buněk
Barvení pouzdra – Kongo červeň
Azotobacter
Buňka obarvená
metylenovou modří
Pouzdro z polysacharidů
(dextran) je pro barvivo
nepropustné
Negativní barvení
(Kongo červeň+methylenová modř)
cysty
buňka s
pouzdrem
cysty
buňka s
pouzdrem
buňka s
pouzdrem