Základní mikrobiologicky rozbor vody Cíl: Stanovit celkový počet psvchrofilních a mezofilních bakterií Stanovit indikátorové skupiny bakterií - selektivní média (Endo agar, SB agar, mFC médium) Rozbor - složka komplexního posouzení kvality vody - státní norma (provedení, výsledky) - indikátory, ne všechny bakterie Odběr - do sterilních lahví (pitná voda - 250 ml; povrchová -150 ml) - dbát na sterilitu práce - vzorky zpracovat do 6 hod či uchovat v ledničce při 4°C max. 24 hod Sladká voda • přirozené stanoviště bakterií • zastoupení závisí na zdrojích uhlíku, dusíku a přítomnosti 02 • autochtonní (= typické) - Chromobacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Leptothrix, Spirillum, ... • půdní bakterie —> splavováním půdy (Bacillus, Streptomyces,..) - jsou limitovány koncentrací živin • střevní bakterie člověka, zvířat - fekální znečištění, výskyt krátkodobě Autochtónni vodní bakterie - typické, původní Spirillum Leptothrix Půdní - splachováním, svrchní vrstvy - limitace koncentrací živin Bacillus Střevní - krátkodobý výskyt (Enterobacteriaceae, Streptococcus) Patogenní - krátkodobě (Salmonella typhi, Shigella dysenteriae) Voda jako stanoviště OPEN MARINE - Inter tidal THffll. NL Environment Marine (32 %.} Infertldal - high energy pH = a (slighty alkaline) Dominant bacteria Mtcrveoteus Preoipitataon None Fossilizatbn potenlial Low as ■ ■m C □ HYPERSALINE LAKES Eleuthera- Guerrero Negro Environment HypersaJine (94-120 %o) ■ law energy pH = ea, a.5 (alkaline] id Dominant bacteria Precipitation Nona Fossiflzation potential Lew Eleutbera - sofl mal Giienrero Negro OPEN MARINE - aubtida Highbome Cay - Coarse-grained stromatolites Environment Marina (36 -~ high energy pH = S (slighlty alkaline) Dominant bacteria Schizothrix- Sotsnlia Precipitation Surface - continuous -laminated (coarce grained) Fossilization potential High - stromatolites HYPERSALINE LAKES ElfHjlhma - or us! on tap of microbial mal Environment Hypersalrne (90 So) - low energy pH =: ca. 9 (alkaline) Dominant bacteria Micmcoleus- Pftormidium -Entppfiyssiis - Gtoeocapss Precipitation Al surface dt microbial mat -comtirtuious - non laminated Fossilizatron potential Low to a^B rage - mud - Whociast í c ď a, a H c rn H (O i 3 11 P I« Pi n o S n n Voda jako stanoviště 0 —Oxygen (yM)-1500 0— Sulfide (mIU|>-800 O —Calcium (mM)-50 GROUPS Cyanobacteria 2HC03- + Ca2+ —+- [CH2OJ + CaCOs + 02 Fermenlation - IVU fixation Aerobic heterptrophs [CH?0] + CaC03 + 02~^ HC03- + Ca2+ FermerKatšon - Denitrification A noxy genie phototrophs 3HC03- + Ca2+ + LCHjO] + CaCOj 4- S042 Fermenlafion - synthesis of Bchio: ■ degradalion oí glycogen Sulfáte redu&ers 2[CHaO] + SO/' + OH" + Ca2+ —*- CaC03 + CO;, + + HS" Sulfide oxídizers 3HS- 4 402 + CaC03 +■ HC03" —2[CH?OJ + Ca?+ + SS04z- Fermenlation - denilríflcation Fermenters (e.g. ethan o í) SfCI-tjOj 4- CaCC3 + Hj,0 —+■ HC03J + Cé 0—Oxygen (uM)-1500 0-Sulfide (llM)-800 Air Voda jako stanoviště IGURE 6.10 Schematic representation of a typical lake showing jmmon designations based on sunlight. Other designations for zones are based on features such as temperature, oxygen concentra-and pH, However, the most common are those shown here larily because of the controlling influence sunlight has on these ivironments. Water lipid layer Protein-polysaccharide layer .Bacteríorií *TWJ 0 10 nm 0.1 um 1.0 um Lower L--.____^: Lower neuston Up to 10 um 10 02mg/l I Tbermocline 25 Temp°C FIGURE 6.12 Idealized profiles of temperature and oxygen in a temperate region, eutrophic lake. Stratification is due to thermal warming of the upper layers in the summer months. Cooling of the upper layer in the fall and early winter breaks the mixing barrier and allows the sediment zone to be reoxygenated. (Adapted from Wetzel, 1983.) Sinice - Cyanobacteria • schopnost fotosyntézy (fotoautotrofové) tylakoidy (chlorofyl), fykobilizomy • Gram-negativní typ buněčné stěny • glykokalyx = vnější obal, kapsula z polysacharidu či polypeptidů • tvorba vláken či koloniálních forem • plynné měchýřky - vznášení se ve vodě • karboxyzómy - enzym RUBISCO • voda, půda, ale i extrémní podmínky (pouště, polární oblasti) diferencované buňky - heterocysty - fixace N2 - akinety - klidové stádium - baeocyty- reprodukční funkce Sinice a „vodní květ" Pro rozvoj - fosfor, vyšší teplota + pH + živiny Nostoc Spirulina = Arthrospira Anabaena Chroococcus Cyanobacterium m — m - , -, 1» */r *V.. Microcystis Sinice • „vodní květ" a cyanotoxiny • Spirulina - vitamínové tablety • pokrmy - velké množství bílkovin • pigmenty - barviva (pozorování biologických dějů v buňkách) • Více info http://www.sinicearasv.cz/oro-vsechnv www.sinice.cz Moře a oceány tolerance k soli, teplotě, tlaku součást planktonu, koloběh prvků extremofilové - hlubokomořské příkopy Thiomargarita namibiensis Marinobacter Colwellia Winogradského sloupec • demonstruje různé úlohy mikroorganizmů v přírodě: aktivita jednoho mikroorganizmu umožňuje růst jiného a naopak • sloupec je kompletní, soběstačný a recyklační systém, který je doplňován pouze světelnou energií Sheathed bacteria Cyanobacteria Purple non-5 bacteria Purpte 6 bacteria Green S bacteria Desu Ifo vibrio Clostridium HHM] ii'Miiri i-', nit" i "jl p.-.r iii'i Winogradsky Column: Microbial Ecology in a Bottle S, -^.i V Win.i^r.i.Jikr I Pit- IW> Ute Lh-[pI N Wrofridiicy wh or* at lit: -ni — KrrtjKpif.nn w r.utf mr arpnini nund in ÍLVnřfc-. hirfro íů*ipiLii*ift O'c -:l Ur vCidUrvn fa ixd to hOŮW flrpflrHTp; fcT>Ti nanjru-ti3l i mrianiďi modal al ů pond er:ll iiEDon irat il nw ulid .-. YYii=Ki icbV whim II a ■ ■j "(.■ L trVrrEK rCT ld"VtrUELIfJI ■ siTO**d ««p53«" a*J pní—k* eH nnboJan and mraikn ir itd nJa-nfctaJ marid. h II a dint damm unban al Ltn nKriidic environment ■ ■•"•TY */*.p^*^pA'^l T***" 4p p*ppjp^.p\il»|iPPjmw4^ ii^ui TIip; ii»tj i '* *WH i cpnr LUikftn i«4 trjrjpvd wlir. *w ootume' »p g&ffi&fl ws p ^fct-Ui vWi^SH ťrWř-rv 7 cel,5j.tpj." w irwybrjiSii Ljt^r ís- íTVWlfsJw lei graft*** pWKftfag p. rtra&fosri ffiragitt&ff íSgrasí Jsy mrtNbi -jsssosfcL Sulfide Oxygen High Anaeraťc °j Energy C(J CHjO CH,0 CHO X X X X X X X CO * HO Ok fs>- CHO CO, CI rj CHp CM 0 h 2. ",5 s so. Sunlight Chemicil u* *» Strife «*» htUMgenM í&»fJiís» *i ar#**ffi> *** «.i.ia ijiWumtsj».j *i dAcaitf fetdHsilM.{dttiWMsHtfld **» fcr *» *» (Ne «»(*JJ!}«» wpiwfcs seeíísqá fern *s «** tetsis W» mm- s^es and «■* toSttwi «v»if 4m fettWSt •«***> ft rf^rrfeNpHfe? tw**«if fNMMnflv jfiHtttaMwrngifr Aw»*l«wip!fl *ri éM«MMM)lr 0»(*6** or mM**, Wtef**b^«Ouiai» Mti tarift to? *stf íSíSfeíffissjrřís «f McaMuiMe !ijiaa'«toi Asms tm ímm mísiííW «*-ssfte. Obecné znečištění: Psychrofilní-do 20°C; indikují přítomnost organických látek rozložitelných bakteriemi při nízkých teplotách; běžný výskyt Mezofilní- znečištění mikroflórou teplokrevných živočichů a člověka, včetně patogenů Fekální znečištění: Koliformní bakterie - obyvatelé tlustého střeva, čeleď Enterobacteriaceae (G- tyčky), nejčastěji E. coli - značí znečištění fekáliemi, možný výskyt střevních patogenů —> rozšířit rozbor o jejich stanovení - většinou oxidáza negativní, laktóza pozitivní Enterococcus sp. (G+ koky) - trávící trakt člověka i živočichů, vyšší termorezistence, odolnost k fyzikálním a chemickým vlivům - důležitý ukazatel fekálního znečištění - ale výskyt i běžně v prostředí TYEA (trypton, kvasničný extrakt, agar) - univerzální půda (pro celkový počet) - kultivace při 22 a 37°C ENDO agar - fuchsin zabije G+ a kolonie koliformních bakterií zbarví červeně - laktózu využijí koliformní bakterie (lac+); Schiffovo činidlo (acetaldehydy) - kultivace při 37°C mFC - laktóza; anilínová modř a žlučové soli inhibují G+ a termotolerantní bakterie zbarví modře - kultivace při 44°C SB agar (Slanetz-Bartley); azid sodný = selektivní činidlo pro enterokoky - indikátor TTC (tetrazolium chlorid) - červený či vínově červený střed kolonií s růžovým okrajem - kultivace při 37°C, kultivace při 44°C inhibuje streptokoky ENDO agar - bazický fuchsin eliminuje G+ • kolonie koliformních bakterií zbarví červeně s kovovým leskem • laktózu využijí koliformní bakterie (lac+) -Schiffovo činidlo (acetaldehydy) • Laktózu neštěpící —> růžové kolonie (obligátní patogeny) E. cH ■.-.v.-.v I—■■ .-i 1111111 m I i'i j i: 111 E. faecalis Slanetz Bartley agar • azid sodný = selektivní činidlo pro enterokoky • indikátor TTC (tetrazolium chlorid) - červený či vínově| červený střed kolonií s růžovým okrajem • kultivace při 37 či 44°C(enterokoky jsou termorezistentní streptokoky nejsou) -7RAS0 ■ mFC medium • laktóza je zkvašována • selektivní činidlo: anilínová modř a žlučové soli inhibují G+ a termotolerantní bakterie zbarví modře • kultivace při 44°C - teplotní test načerstvé znečištění mFC agar Colonies that are light to dark blue, in whole or part, are counted as fecal coliforms Postup: • PITNÁ VODA - neředěný vzorek a 10_1 (neočekáváme kontaminaci) • POVRCHOVÁ VODA - ředění 10"1 a 10"2 (očekáváme výskyt bakterií) TYEA: 1 ml vody do misky, přelít cca 15 ml temperovaného média (1 vzorek = 2 misky) ENDO, mFC agar: 0,1 ml vzorku na agar SB agar: povrchová 0,1 ml vzorku na agar; pitná - filtrace Kultivace: TYEA-22° C TYEA, ENDO, SB -37°C mFC, SB-44°C Hodnocení: Počítání kolonií na 1 ml - pozor na přepočet!!! (0,1 x 1 ml na misku!!!) Enterokoky počítat na 100 ml Voda pro hromadné zásobování (více než 100 osob) nesmí obsahovat více než: 200 psychrofilních a 20 mezofilních bakterií na 1 ml 0 koliformních či enterokoků na 100 ml Voda pro individuální zásobování (studny; méně než 100 osob) nesmí obsahovat více než: 500 psychrofilních a 100 mezofilních bakterií na 1 ml 0 koliformních či enterokoků v 10 ml Požadavky na mikrobiologické a biologické analýzy Objednatel:_ _T^p vzorku: Zakázka: č. Rozsah analýz kráceného rozboru pitné vody podle 252/2004 pitná voda balená voda upravovaná z povrchového zdroie náhradní zásobování, studny Escherichia coli 0 KTJ/100 ml 0 KTJ/250 ml 0 KTJ/100 ml 0 KTJ/100 ml kaliform ní bakterie 0 KTJ/10Q ml 0 KTJ/100 ml 0 KTJ/100 ml Clostridium peříringe ns 0 KTJ/100 ml Pseudomonas aeruginosa 0 KTJ/250 ml počty kolonii při 22 X 200 KTJ/1 ml 500 KTJ/1 ml 200 KTJ/1 ml 500 KTJ/1 ml poety kolonii pít 36 X 100 KTJ/1 ml 20 KTJ/1 mi 100 KTJ/1 ml 100 KTJ/1 ml Rozsah analýz základního rozboru pitné vody podle 252/2004 pitná voda balená voda upravovaná z povrchového zdroje náhradní zásobováni, studny Cscrrenctlia coli Q KTJ/100 ml 0 KTJ/250 ml 0 KTJ/100 ml 0 KTJ/100 mi koliformnl bakterie 0 KTJ/10O ml 0 KTJ/100 ml 0 KTJ/100 ml Clostridium perfrlngens 0 KTJ/100 ml Pseudomonas aeruginosa 0 KTJ/250 m! počty kolonii při 22 "C 200 KTJ/1 ml 100 KTJ/1 ml 200 KTJ/1 ml 500 KTJ/1 mi [pocty kolonii při 36 X 20 KTJ/1 ml 20 KTJ/1 ml 100 KTJ/1 m 100 KTJ/1 ml jenterokoky 0 KTJ/100 ml 0 KTJ/250 ml 0 KTJ/100 ml 0 KTJ/100 ml Rozsah analýz rozboru teplé vody i Dodle 262/2004 teplá voda nemocnice leajonely 10O KTJ/100 ml 0 KTJ/50 ml počty kolonii při 36 X 200 KTJ/1 ml Rozsah analýz rozboru teplé vody z individuálního zdroje pro hygienu zaměstnanců podle 252/2004 atypicka mykobakteria 0 KTJ/1 OD ml Escherichia coli 0 KTJ/100 ml legionely 100 KTJ/100 ml potty kolonii pn36X 200 KTJ/1 ml Pseudomonas aeruginosa 0 KTJ/100 ml Staphylococcus aureus 0 KTJ/1 OD ml Rozsah analýz balené vody podle 275/20Q4 Escherichia coli 0 KTJ/250 mí kollfofmní bakterie 0 KTJ/250 ml enlerokoky 0 KTJ/250 rnl Pseudomonas aeruginosa 0 KTJ/250 ml sh f i titany redukující slfevni sporulujici 0 KTJ/50 ml anaeróbni bakterie počly kolonií při 22 CC 100 KTJ/1 ml pocly kolonií pfi 36 "C ZO KTJ/1 ml Rozsah analýz rozboru povrchové vody podle 61/2003 pro rozlišení způsobu úpravy na jiinou vodu povrchová voda povrchové voda na koupaní A1 A2 A3 cilová hodnota přípustná hodnota kolifurmni baklc-ňe 50 KTJ/100 ml 50DO KTJ/100 ml 50000 KT J,' 100 nil 200 KTJ/1 ml 500 KTJ/1 DO ml 100DD KTJ/100 ml enlerokoky 20 KT J/100 ml 1000 KTJ/100 ml 10000 KT J/100 mí 40 KTJ/1 ml 100 KTJ/100 rnl 4D0 KTJ/100 ml tarmololeraniní kuliformni bakterie 20 KT J/100 ml 2000 KTJ/100 ml 2Q00Q KTJ/100 ml 20 KTJ/1 mt 100 KTJ/100 ml 2000 KTJ/100 ml salmonely 0 iedínců/5000 ml 0 jedinců/5000 ml /1000 ml 0 KTJ/100D mi mikroskopický obraz: živé org, 50 jedinců/1 ml 3000 jedí nc«/1 ml lOOOO jedinců/1 mí Rozsah analýz rozboru povrchové vody podle ČSN 75 7221/98 trieda I irida II tľlda III iřida IV třída V en [e rokoky < 6 KTJ/1 ml < 13 KTJ/1 ml < 25 KTJ/1 ml < 46 KTJ/1 ml >46 KTJ/1 ml termololerailni Koliformní bakterie < 40 KTJ/1 ml <; 1 00 KTJ/1 ml * 50Q KTJ/1 ml < 1000 KU/1 ml =■1000 KTJ/1 ml Rozsah analýz rozboru povrchové vody pro kou pal i sté podle 135/2004 koupáni ve volné přírodě povrchový zdroj pro jmélá koupaliště umélá koupaliuté teplá voda vyrobená z vody jiné kvality než vody pilné cílová hodnota limitní hodnota kuliformni bakterie 500 KTJ/100 mí 10000 KTJ/100 ml lermotolerantní koUformni bakterie 100 KTJ/100 ml 2000 KTJ/100 ml enterokoky 100 KTJ/100 ml 400 KTJ/100 ml 1 KTJ/1 m t salmonely 0 KTJ/1000 ml 0 KTJ/1000 ml Escheiictiia coli 2 KTJ/1 ml 0 KTJ/100 mt 0 KTJ/100 ml Pseudamonas aemojnusa 3 KTJ/1 ml 0 KTJ/100 ml 0 KTJ/100 mi počly kolonii při 22 °C 500 KTJ/1 mí míly kolonii při 36 "C 100 KTJ/1 ml 200 KTJ/1 ml Siaphytococcus aureus 0 KTJ/100 ml 0 KTJ/1O0 ml leginnely 0 KTJ/1 ml 100 KTJ/100 ml Oslatnl parametry jednotka želez ité bakterie Utr Poznámky: nitrifikatni bakterie litr denřtrifikačni bakterie Litr trůf cký potenciál mfl/l lesl akutní toxicity na bezobratlých TU Vypracovala H Mlejnková 21 1.2003 lest akutní toxicity na řasách TU Opraverifi H Mlejnková 15.6.2004 PCR identifikace E. coli OM V současnosti platné rozbory vody Indikátorova skupina označeni kultivace konfirmace typ vody půda teplota doba barva kolonii půda/test teplota doba baiva kolonii koliformní bakterie TC modif. ENDO a-gar 36±2;C 21±3hod.= když nevyrostou tak 44=4 hod syté červené kolonie s tmavé červenou spodní častí a. červené kolonie s kovovým leskem cytochrom -oxidazový 2 min ne modré zbarvení (koliformní bakterie) povrchové: odpadni eDterokoky ENT Slanetz-Bartley agar 36=2;C 44=4 hod. červené= kaštanové nebo ružové kolonie, celé zbarvené či s barevným středem žluč-eskulin -azidový agar 44±0=5CC 2 hod tříslove hnědé až černé zbarveni okolí (enterokoky) povrchové, odpadnL pitné koliformní -E.coU TC Laktoza-TTC agar 36±2;C 21=3 hod. žluté kolom e cyt ochrom -oxidazový 3 min ne modré zbarvení (koliformní bakterie) pitné termo tolerantní a E. coli FC M-FC agar 44±0:5:C 21=3hod.= když nevyrostou, ta 44=4 hod. modré kolonie (fekální koliformní bakterie) MUG 36±2:C 3 hod. modře íluoreskující (E. coli) povrchové a odpadni Ku Itivova tělně MO HP C tryptone yeast extract agar 22=2;C 68=4 hod. všechny kolonie povrchové; odpadnL pitné 36=2:C 44=4 hod. všechny kolonie pitné