Ekotoxikologické biotesty: rozdělení, přehled, použití.
Doc. Ing. Blahoslav Maršálek, CSc.,
Oddělení experimentální fykologie a ekotoxikologie, Botanický ústav AVČR,
Květná 8, 603 65 Brno, Marsalek@brno.cas.cz , Tel/Fax 05 43241911
a RECETOX – Výzkumné centrum pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii,
Masarykova univerzita Kamenice 3, 618 00 Brno, Marsalek@recetox.muni.cz
Úvod
Biotest nazývaný také jako bioassay je definován jako „zkouška“ využívající
biologický systém, který zahrnuje expozici organismu testovaným materiálem a
stanovuje odpověď organismu. Chapman (1995a) rozlišuje dva druhy biotestů: test
toxicity, který měří efekt (např. akutní, subletální, chronickou toxicitu) a
bioakumulační test, který měří jev. Biotest je starý snad několik tisíc let. Již faraoni
používali "služeb" ochutnávače aby se uchránili před traviči. Ve středověku se
podezřelý pokrm zkoušel na psovi či vězni. Dnes je jako testovací organismy používá
široká škála organismů (bakterie, sinice, řasy, vyšší rostliny, vodní a půdní
organismy, mechy a lišejníky, ale také teplokrevní obratlovci, především hlodavci,
ptáci, volně žijící zvěř a ve zdůvodněných případech i primáti.
Ekotoxikologie je relativně nový pojem integrující ekologické a toxikologické
disciplíny. Původně byly testy toxicity, jejich metodické postupy, testovací organismy
a endpointy vybírány na základě neekologických faktorů, protože ekologické byly
obecně nevýznamné. První environmentální problémy, které se objevily, byly akutní
a viditelné, zahrnovaly např. hynutí organismů např. vlivem nedostatku kyslíku a
vedly k aplikaci převážně rybích druhů při testování vody.
Původní problémy byly relativně jednoduché, zahrnovaly polutanty typu organické
hmoty, kovů a pesticidů. V průběhu století se však znečištění stalo komplexnějším a
nyní zahrnuje směsi chemikálií ve více environmentálních složkách (voda, půda,
tkáně, atd.). Efekty znečištění se již netýkají pouze mortality, ale do popředí se
dostávají dlouhodobější a obtížněji detekovatelné vlivy jako mutagenicita,
karcenogenita, vlivy na růst, reprodukci, atd. To vede i k mohutnému rozvoji různých
metod stanovujících příčiny a efekty znečištění a ke změně regulačních opatření z
nápravy škod způsobených na ekosystému k prevenci a ochraně zdraví ekosystému
(Chapman 1995b). V současné době jsou známy desítky milionů organických
sloučenin. Spolu s dalšími přírodními sloučeninami produkovanými a
modifikovanými organismy a anorganickými látkami tvoří směsy, jejichž toxicitu nelze
predikovat, ani efektivně monitorovat sofistikovanými instrumentálními metodami
analytické a environmentální chemie, které jsou povětšinou cíleny na určitou látku.
Proto má biotest jako nespecifický, relativně levný, screeningový test (toxicity,
úživnosti, biodegradace, biokumulace apod.) v ekotoxikologii své důležité
místo.
Původní problémy byly relativně jednoduché, zahrnovaly polutanty typu
organické hmoty, kovů a pesticidů. V průběhu století se však znečištění stalo
komplexnějším a nyní zahrnuje směsi chemikálií ve více environmentálních složkách
(voda, půda, tkáně, atd.). Efekty znečištění se již netýkají pouze mortality, ale do
popředí se dostávají dlouhodobější a obtížněji detekovatelné vlivy jako mutagenicita,
karcenogenita, vlivy na růst, reprodukci, atd. To vede i k mohutnému rozvoji různých
metod stanovujících příčiny a efekty znečištění a ke změně regulačních opatření z
nápravy škod způsobených na ekosystému k prevenci a ochraně zdraví ekosystému
(Chapman 1995b).
Hodnocení zdraví ekosystému probíhá na třech základních úrovních
biologické organizace: individuální, populační a na úrovni společenstva. Testy
toxicity, které zaujímají individuální úroveň, se zaměřují letální, nebo subletální na
biochemické a fyziologické odpovědi organismu k environmentálnímu znečištění.
Jejich výhodou je, že jsou stabdardizované, mohou indikovat „včasné varování“, na
druhé straně jim chybí dlouhodobá ekologická významnost a jejich interpretace může
být irelevantní přírodním podmínkám (Wong a Dixon 1995).
Definice a popis biotestu.
Principem biotestu je kontakt (akutní, chronický apod.) testované látky, směsného,
či přírodního vzorku za určitých, předem definovaných a kontrolovatelných
podmínek s detekčním systémem (zkušebním organismem, tkání, populací,
společenstvem apod.). Z jeho reakce potom usuzujeme, zda testovaná látka je
toxická, zda vzorek vody obsahuje využitelné živiny, zda je za těchto podmínek
sledovaná substance rozložitelná atd.
Biotest většinou nemůže podat informaci která látka a v jakém množství je v
příslušném vzorku, to je vyhrazeno až chemické analýze, může však velmi
jednoduše a rychle říci, zda je či není ve vzorku biologicky aktivní, či sledovaný jev
ovlivňující látka/látky.
Biotest lze definovat jako proces, při němž je testovací systém (tkáně, organismus,
populace apod.) exponován v přesně definovaných podmínkách různými
koncentracemi zkoumané chemické látky nebo směsného či přírodního vzorku.
Ekotoxikologické biotesty jsou pak takové biotesty, které pro stanovení
sledovaného jevu využívají detekční systémy (organismy, tkáně apod.), které jsou
relevantní (umožňují interpretaci, mají dostatečnou výpovědní hodnotu apod.) pro
sledované ekosystémy či matrice (vodní, půdní ekosystémy, chemické látky, odpady
apod.). Z tohoto popisu je zřejmé, že například nebezpečné vlastnosti odpadů
popisované v Zákoně o odpadech jako akutní toxicita, nebo tzv. pozdní účinek
(embryotoxicita, mutagenita, teratogenita apod.) je cílena na ve vztahu k člověku,
nikoliv k životnímu prostředí a nelze je uvádět mezi ekotoxikologické biotesty. Proto
je v zákonech a normách ekotoxicita uváděna zvlášť a vždy by měla sledovat a
definovat účinky testované substance na úrovni producentů, konzumentů a
destruentů, protože ekosystém si lze představit jako řetěz: praskne-li jeden jediný
článek (je jedno který), řetěz není funkční (a ekosystém je poškozený). Kdybychom
například testovali insekticid pomocí jediného testu , např. na bakteriích, nebo
řasách, pravděpodobně nestanovíme toxické účinky. Je však zřejmé, že závěr:
vzorek je netoxický je nesprávný, protože byla opomenuta skupina konzumentů. Zdá
se to jasné. Přesto dnes stále existují firmy a laboratoře, které výsledky jednoho
trstu (např. Mikrotox) vydávají za výsledky ekotoxikologického testování.
Současným trendem je vyvíjet takové metodiky ekotoxikologických biotestů, , které
jsou miniaturizované, plně validovatelné a umožňují tedy sledovat nepříznivý vliv
látek na živé organizmy za standardních, reprodukovatelných podmínek. Metody
musí umožnit srovnání účinků různých látek či různých organizmů mezi sebou a
především srovnání odpovídajících výsledků z různých laboratoří. Vysoký stupeň
standardizace ekotoxikologických biotestů je samozřejmostí, která je však často
interpretována zároveň jako nevýhoda, protože laboratorní podmínky jsou často
vzdáleny přírodním podmínkám, což je nutno brát v úvahu při interpretaci výsledků
testů. Ekotoxikologické biotesty pak poskytují podklady pro ekotoxikologické studie,
hodnocení rizik apod.
Rozdělení ekotoxikologických biotestů
V recentních mezinárodních monografiích zabývajících se touto problematikou
najdeme nejrůznější a značně nejednotné dělení ekotoxikologických biotestů. Zde
uvádím základní přehled těch nejčastějších:
Dle doby expozice dělíme ekotoxikologické biotesty na akutní, semiakutní
(semichronické) a chronické
Dle pokročilosti designu testovacího systému (Také 4 generace biotestů)
• 1. generace -klasické (standardní)
• 2. generace -mikrobiotesty
• 3. generace -biosenzory, biosondy a biomárkry
• 4. generace – on-line systémy s dálkovým
přenosem dat
Dle trofické úrovně testovacích organismů producenti, konzumenti, destruenti
Dle testované matrice: voda, půda, vzduch, sediment, odpad, chemická látka
Dle spektra testovacích organismů:Jednodruhové (Single Species), Vícedruhové
(Multi Species s přírodními populacemi i laboratorní směsi kultur)
Dle typu testovaného vzorku: čisté chemické látky (hydrofilní, hydrofobní, těkavé),
směs látek (známých i neznámých), přírodní vzorky (většinou neznámé, směsné,
s neznámými interakcemi - nejsložitější interpretace)
Dle způsobu přípravy vzorku: definované koncentrace chemických látek,
testování výluhů přírodních vzorků (extrakce org. rozpouštědly, DMSO, vodou, různé
pH, teplota atd.) , semipermeabilní membrány, přímé testy (Direct Tests, Solid Phase
Tests, Whole Effluent etc.)
Dle stupně komplexnosti detekčního systému
Od nejjednodušších k nejsložitějším: enzymy, biosondy, buněčné a tkáňové kultury
in vitro , intaktní živý organismus, populace, micro/mezo kosmos, terénní
experimenty. Zde vývoj chápání ekotoxikologických biotestů pokročil - původní
definice uznávala pouze vliv látek na živé organismy, dnes s pronikáním 3. generace
ekotoxikologických biotestů jsou uznávány pro hodnocení rizik také biotesty na
úrovni suborganismální.
Dle způsobu vyhodnocování: letální efekty (mortalita, imobilizace), subletální
efekty (chování organismů – např. rychlost a směr pohybu), hodnocení fyziologické
aktivity (fotosyntetické asimilace, enzymatická aktivita, efekty na membránách,
přírůstky – délka kořene, počet buněk v populaci, nebo hmotnost organismu,
náchylnost k napadení chorobami, škůdci či parazity apod)., reprodukční aktivita,
malformace a teratogenita atd.
Specielní testy pro hodnocení rizik v životním prostředí
V určitých, jasně definovaných případech, kdy je pro konkrétní interpretaci nutno
stanovit jiné, než běžné (toxické, letální) efekty na testovací organismus, máme
k dispozici řadu specielních biotestů pro stanovení např. těchto parametrů: trofie,
mutagenita/genotoxicita nejen na bakteriích, ale také na rostlinnách, volně žijících
zvířatech a rybách, teratogenita, například na obojživelnících - Xenopus laevis,
embryotoxicita a reprodukční testy na rybách, korýších, obojživelnících, ptácích
apod.
Další biotesty: Tento přehled je směřován na ekotoxikologické biotesty.
Biokoncentrace/ biokumulace a testy pro hodnocení biodegradability nepatří mezi
ekotoxikologické biotesty ve smyslu stanovování toxických a letálních efektů
v původním významu, takže ač se jim v tomto příspěvku nebudu podrobněji věnovat
je dobré vědět, že patří mezi biotesty ekotoxikologického hodnocení chemických
látek i přírodních a odpadních vzorků.
Přehled ekotoxikologických biotestů tak, jak je uvádí některé mezinárodní
agentury
Většina vyspělých států má své agentury, které vydávají a aktualizují normy a
metodiky také v oblasti ekotoxikologických biotestů. V USA je to U.S. EPA, a ASTM,
v Kanadě je to například Environment Canada, ve Francii AFNOR, v Německu DIN
apod. Česká republika patří jednoznačně mezi státy, které jsou pokročilé i v této
oblasti, ale současná situace může být pro nezasvěcené uživatele nejasná.
V současné době jsou v platnosti ČSN (Česká státní norma), ale současně jsou
platné nově přijímané normy, které v procesu harmonizace předpisů s EU přijímáme
a také jsou platné normy, které jsme přejali jako členové OECD. Jak je z níže
uvedeného přehledu patrné, běžně se lze setkat s normou, která má označení ČSNEN-ISO.
Jde o nové normy přejímané z ISO a platné pro EU. Aby to nebylo
jednoduché, jsou současně platné například také tzv. oborové normy pro jednotlivé
rezorty, či odvětví. Příkladem mohou být Oborové normy pro vodní hospodářství,
které mají označení TNV.
V následujícím přehledu jsou staženy z internetu seznamy norem vybraných
agentur, které se touto problematikou zabývají. Již z přehledu je patrné, že se
agentury v jednotlivých normách nejen překrývají, ale především se liší v detailech
způsobu provedení, složení medií i době expozice.
Všimněte si prosím, že kromě ekotoxikoogických biotestů, které jsou běžné
v ČR (dafnie, řasy, klíčení semen, ryba) jsou například u OECD již od roku 1984
platné normy pro stanovení toxicity na včely, žížaly, volně žijící ptáky apod. Tyto
testy se v ČR také používají, povědomí odborné veřejnosti o těchto testech však není
takové, jako je tomu u testů pro stestování vodních ekosystémů. Z předložených
přehledů je také patrný trend ve vývoji ekotoxikologických biotestů v posledních cca
10 letech: stále větší důraz je kladen na testy prolongované, chronické a
subchronické, při hodnocení efektů se stále více klade důraz na subletální efekty a
vlivu sledovaných substancí na reprodukci.
Zdroj:
http://www.oecd.org/EN/document/0,,EN-document-524-14-no-21-6717-524,00.html
Sekce 2: Effects on Biotic Systems, další lze najít v serii Testing and Assessment
Guidance Monographs
201 Alga, Growth Inhibition Test (Updated Guideline, adopted 7th June 1984)
202 Daphnia sp. Acute Immobilisation Test and Reproduction Test (Updated Guideline,
adopted 4th April 1984)
203 Fish, Acute Toxicity Test (Updated Guideline, adopted 17th July 1992)
204 Fish, Prolonged Toxicity Test: 14-Day Study (Original Guideline, adopted 4th April 1984)
205 Avian Dietary Toxicity Test (Original Guideline, adopted 4th April 1984)
206 Avian Reproduction Test (Original Guideline, adopted 4th April 1984)
207 Earthworm, Acute Toxicity Tests (Original Guideline, adopted 4th April 1984)
208 Terrestrial Plants, Growth Test (Original Guideline, adopted 4th April 1984)
209 Activated Sludge, Respiration Inhibition Test (Original Guideline, adopted 4th April 1984)
210 Fish, Early-Life Stage Toxicity Test (Original Guideline, adopted 17th July 1992)
211 Daphnia magna Reproduction Test (Original Guideline, adopted 21st September 1998)
212 Fish, Short-term Toxicity Test on Embryo and Sac-Fry Stages (Original Guideline,
adopted 21st September 1998)
213 Honeybees, Acute Oral Toxicity Test(Original Guideline, adopted 21st September 1998)
214 Honeybees, Acute Contact Toxicity Test(Original Guideline, adopted 21st September
1998)
215 Fish, Juvenile Growth Test (Original Guideline, adopted 21st January 2000)
216 Soil Microorganisms, Nitrogen Transformation Test (Original Guideline, adopted 21st
January 2000)
217 Soil Microorganisms, Carbon Transformation Test (Original Guideline, adopted 21st
January 2000)
OECD normy , které jsou v současnosti ve schvalovacím řízení
202 Daphnia sp., Acute Immobilisation Test (Updated Guideline, October 2000)
Daphnia Compilation Document
208 Terrestrial (Non target) - Plant Test: s plevelnými druhy rostlin
208A: Seedling Emergence and Seedling and Seedling Growth
208B: Vegetative Vigour Test" (Draft Updated Guideline, July 2000)
* Supporting Background Document: A Comparative Review of Terrestrial NTP Test Methods
218 Sediment-Water Chironomid Toxicity Test Using Spiked Sediment
(Draft New Guideline, February 2001)
219 Sediment-Water Chironomid Toxicity Test Using Spiked Water (Draft New Guideline,
February 2001) PDF
220 Enchytraedae Reproduction Test(Draft New Guideline, March 2000)
221 Lemna sp. Growth Inhibition Test (Draft New Guideline, October2000) Lemna
Compilation Document
222 Earthworm Reproduction Test (Eisenia fetida/andrei)
(Draft New Guideline, January 2000)
ISO (International Standardization Organization ) nabízí standardizované metodiky a
normy pro nejrůznější činnosti spojené s ekotoxikologickými biotesty (od vzorkování,
přeprava vzorku, konzervace a uchovávání vzorků, metody extrakce a přípravy, zpracování
biotestů pro vodní ekosystémy, půdu, odpady apod.). Plný přehled je nad rámec nejen
tohoto článku, ale také celého sborníku. Proto doporučuji čerpat vždy čerstvé informace
z níze uvedených internetových stránek. Zde pro představu uvádím část norem spojených
s ekotoxikologickými biotesty pro vodní ekosystémy.
Zdroj: www.iso.org/iso/en
ISO 6341:1996 Water quality -- Determination of the inhibition of
the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera,
Crustacea) -- Acute toxicity test
ISO 7346-
1:1996
Water quality -- Determination of the acute lethal
toxicity of substances to a freshwater fish
[Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprinidae)] -- Part 1: Static method
ISO 7346-
2:1996
Water quality -- Determination of the acute lethal
toxicity of substances to a freshwater fish
[Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprinidae)] -- Part 2: Semi-static method
ISO 7346-
3:1996
Water quality -- Determination of the acute lethal
toxicity of substances to a freshwater fish
[Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei,
Cyprinidae)] -- Part 3: Flow-through method
ISO 7827:1994 Water quality -- Evaluation in an aqueous medium of
the "ultimate" aerobic biodegradability of organic
compounds -- Method by analysis of dissolved
organic carbon (DOC)
ISO 8192:1986 Water quality -- Test for inhibition of oxygen
consumption by activated sludge
ISO 8692:1989 Water quality -- Fresh water algal growth inhibition
test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum
capricornutum
ISO 9408:1999 Water quality -- Evaluation of ultimate aerobic
biodegradability of organic compounds in aqueous
medium by determination of oxygen demand in a
closed respirometer
ISO 9439:1999 Water quality -- Evaluation of ultimate aerobic
biodegradability of organic compounds in aqueous
medium -- Carbon dioxide evolution test
ISO 9509:1989 Water quality -- Method for assessing the inhibition
of nitrification of activated sludge micro-organisms
by chemicals and waste waters
ISO 9887:1992 Water quality -- Evaluation of the aerobic
biodegradability of organic compounds in an
aqueous medium -- Semi-continuous activated
sludge method (SCAS)
ISO 9888:1999 Water quality -- Evaluation of ultimate aerobic
biodegradability of organic compounds in aqueous
medium -- Static test (Zahn-Wellens method)
ISO 10229:1994 Water quality -- Determination of the prolonged
toxicity of substances to freshwater fish -- Method
for evaluating the effects of substances on the
growth rate of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss
Walbaum (Teleostei, Salmonidae))
ISO 10253:1995 Water quality -- Marine algal growth inhibition test
with Skeletonema costatum and Phaeodactylum
tricornutum
ISO 10634:1995 Water quality -- Guidance for the preparation and
treatment of poorly water-soluble organic
compounds for the subsequent evaluation of their
biodegradability in an aqueous medium
ISO 10706:2000 Water quality -- Determination of long term toxicity
of substances to Daphnia magna Straus (Cladocera,
Crustacea)
ISO 10707:1994 Water quality -- Evaluation in an aqueous medium of
the "ultimate" aerobic biodegradability of organic
compounds -- Method by analysis of biochemical
oxygen demand (closed bottle test)
ISO 10708:1997 Water quality -- Evaluation in an aqueous medium of
the ultimate aerobic biodegradability of organic
compounds -- Determination of biochemical oxygen
demand in a two-phase closed bottle test
ISO 10712:1995 Water quality -- Pseudomonas putida growth
inhibition test (Pseudomonas cell multiplication
inhibition test)
ISO 11348-
1:1998
Water quality -- Determination of the inhibitory
effect of water samples on the light emission of
Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) -- Part 1:
Method using freshly prepared bacteria
ISO 11348-
2:1998
Water quality -- Determination of the inhibitory
effect of water samples on the light emission of
Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) -- Part 2:
Method using liquid-dried bacteria
ISO 11348-
3:1998
Water quality -- Determination of the inhibitory
effect of water samples on the light emission of
Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) -- Part 3:
Method using freeze-dried bacteria
ISO 11733:1995 Water quality -- Evaluation of the elimination and
biodegradability of organic compounds in an
aqueous medium -- Activated sludge simulation test
ISO 11734:1995 Water quality -- Evaluation of the "ultimate"
anaerobic biodegradability of organic compounds in
digested sludge -- Method by measurement of the
biogas production
ISO 12890:1999 Water quality -- Determination of toxicity to
embryos and larvae of freshwater fish -- Semi-static
method
ISO 13829:2000 Water quality -- Determination of the genotoxicity of
water and waste water using the umu-test
ISO 14442:1999 Water quality -- Guidelines for algal growth
inhibition tests with poorly soluble materials, volatile
compounds, metals and waste water
ISO 14593:1999 Water quality -- Evaluation of ultimate aerobic
biodegradability of organic compounds in aqueous
medium -- Method by analysis of inorganic carbon in
sealed vessels (CO2 headspace test)
ISO 14669:1999 Water quality -- Determination of acute lethal
toxicity to marine copepods (Copepoda, Crustacea)
ISO/TR
15462:1997
Water quality -- Selection of tests for
biodegradability
ISO 15522:1999 Water quality -- Determination of the inhibitory
effect of water constituents on the growth of
activated sludge microorganisms
ISO 16221:2001 Water quality -- Guidance for determination of
biodegradability in the marine environment
Evropská unie má Společné výzkumné centrum , které se zabývá (mimo jiné) touto
problematikou v Ispře, v Itálii. V následujícím přehledu je uvedena část, která se
týká metod pro stanovení toxicity a ekotoxicity. Protože má text z tohoto sborníku
sloužit také jako studijní materiál pro studenty univerzit a vysokých škol, záměrně
nechávám vedle sebe metody pro stanovení toxicity a ekotoxicity, aby bylo možno
tyto metody srovnat a hlavně odlišit, což se při zkoušení ne vždy studentům daří.
Odborníci trivialitu prominou… a podrobnosti k níže uvedeným testům načerpají na
níže uvedené adrese.
Zdroj:
http://ecb.jrc.it/testing-methods/ANNEX5/
Annex V to Directive 67/548/EEC
Poslední změny této verze: 18 March 2002
PART B: METHODS FOR THE DETERMINATION OF TOXICITY
GENERAL INTRODUCTION
B.1bis ACUTE TOXICITY (ORAL) FIXED DOSE METHOD
B.1tris ACUTE TOXICITY (ORAL) – ACUTE TOXIC CLASS METHOD
B.2 B.2 ACUTE TOXICITY (INHALATION)
B.3 ACUTE TOXICITY (DERMAL)
B.4 ACUTE TOXICITY (SKIN IRRITATION)
B.5 ACUTE TOXICITY (EYE IRRITATION)
B.6 SKIN SENSITIZATION
B.7 REPEATED DOSE (28 DAYS) TOXICITY (ORAL)
B.8 REPEATED DOSE (28 DAYS) TOXICITY (INHALATION)
B.9 REPEATED DOSE (28 DAYS) TOXICITY (DERMAL)
B.10 MUTAGENICITY - IN VITRO MAMMALIAN CHROMOSOME ABERRATION TEST)
B.11 MUTAGENICITY - IN VIVO MAMMALIAN BONE-MARROW CHROMOSOME
ABERRATION TEST
B.12 MUTAGENICITY MAMMALIAN ERYTHROCYTE MICRONUCLEUS TEST
B.13/14 MUTAGENICITY - REVERSE MUTATION TEST USING BACTERIA
B.15 GENE MUTATION - SACCHAROMYCES CEREVISAE
B.16 MITOTIC RECOMBINATION - SACCHAROMYCES CEREVISAE
B.17 MUTAGENICITY - IN VITRO MAMMALIAN CELL GENE MUTATION TEST
B.18 DNA DAMAGE AND REPAIR - UNSCHEDULED DNA SYNTHESIS - MAMMALIAN
CELLS IN VITRO
B.19 SISTER CHROMATID EXCHANGE ASSAY IN VITRO
B.20 SEX-LINKED RECESSIVE LETHAL TEST IN DROSOPHILA MELANOGASTER
B.21 IN VITRO MAMMALIAN CELL TRANSFORMATION TEST
B.22 RODENT DOMINANT LETHAL TEST
B.23 MAMMALIAN SPERMATOGONIAL CHROMOSOME ABERRATION TEST
B.24 MOUSE SPOT TEST
B.25 MOUSE HERITABLE TRANSLOCATION
B.26 SUB-CHRONIC ORAL TOXICITY TEST. REPEATED DOSE 90 - DAY TOXICITY STUDY
IN RODENTS
B.27 SUB-CHRONIC ORAL TOXICITY TEST: REPEATED DOSE 90 - DAY TOXICITY STUDY
IN NON-RODENTS
B.28 SUB-CHRONIC DERMAL TOXICITY TEST: 90-DAY REPEATED DERMAL DOSE
STUDY USING RODENT SPECIES
B.29 SUB-CHRONIC INHALATION TOXICITY TEST: 90-DAY REPEATED INHALATION
DOSE STUDY USING RODENT SPECIES
B.30 CHRONIC TOXICITY TEST
B.31 TERATOGENICITY TEST – RODENT AND NON-RODENT
B.32 CARCINOGENICITY TEST
B.33 COMBINED CHRONIC TOXICITY/CARCINOGENICITY TEST
B.34 ONE-GENERATION REPRODUCTION TOXICITY TEST
B.35 TWO GENERATION REPRODUCTION TOXICITY TEST
B.36 TOXICOKINETICS
B.37 DELAYED NEUROTOXICITY OF ORGANOPHOSPHORUS SUBSTANCES FOLLOWING
ACUTE EXPOSURE
B.38 DELAYED NEUROTOXICITY OF ORGANOPHOSPHORUS SUBSTANCES 28 DAY
REPEATED DOSE STUDY
B.39 UNSCHEDULED DNA SYNTHESIS (UDS) TEST WITH MAMMALIAN LIVER CELLS IN
VIVO
B.40 SKIN CORROSION
B.41 PHOTOTOXICITY - IN VITRO 3T3 NRU PHOTOTOXICITY TEST
PART C: METHODS FOR THE DETERMINATION OF ECOTOXICITY
GENERAL INTRODUCTION
C.1 ACUTE TOXICITY FOR FISH
C.2 ACUTE TOXICITY FOR DAPHNIA
C.3 ALGAL INHIBITION TEST
C.4 BIODEGRADATION: DETERMINATION OF THE "READY" BIODEGRADABILITY
C.4-A DISSOLVED ORGANIC CARBON (DOC) DIE-AWAY TEST
C.4-B MODIFIED OECD SCREENING TEST
C.4-C CARBON DIOXIDE EVOLUTION TEST
C.4-D MANOMETRIC RESPIROMETRY TEST
C.4-E CLOSED BOTTLE TEST
C.4-F MITI TEST
C.5 DEGRADATION : BIOCHEMICAL OXYGEN DEMAND
C.6 DEGRADATION: CHEMICAL OXYGEN DEMAND
C.7 DEGRADATION: ABIOTIC DEGRADATION: HYDROLYSIS AS A FUNCTION OF PH
C.8 TOXICITY FOR EARTHWORMS : ARTIFICIAL SOIL TEST
C.9 BIODEGRADATION: ZAHN - WELLENS TEST
C.10 BIODEGRADATION: ACTIVATED SLUDGE SIMULATION TEST
C.11 BIODEGRADATION: ACTIVATED SLUDGE RESPIRATION INHIBITION TEST
C.12 BIODEGRADATION: MODIFIED SCAS TEST
C.13 BIOCONCENTRATION: FLOW-THROUGH FISH TEST
C.14 FISH JUVENILE GROWTH TEST
C.15 FISH, SHORT-TERM TOXICITY TEST ON EMBRYO AND SAC-FRY STAGES
C.16 HONEYBEES - ACUTE ORAL TOXICITY TEST
C.17 HONEYBEES - ACUTE CONTACT TOXICITY TEST
C.18 ADSORPTION/DESORPTION USING A BATCH EQUILIBRIUM METHOD
C.19 ESTIMATION OF THE ADSORPTION COEFFICIENT (KOC) ON SOIL AND ON SEWAGE
SLUDGE USING HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
C.20 DAPHNIA MAGNA REPRODUCTION TEST
Ekotoxikologické biotesty v normách ČR
Situace v oblasti norem a metodik pro ekotoxikologické biotesty se v současné době
v ČR intenzivně vyvíjí, takže následující přehled nelze brát jako definitivní a konečný.
Jako informační zdroje lze doporučit
Zde uvádím přehled těch základních norem:
ČSN EN 28692 Jakost vod. Zkouška inhibice růstu sladkovodních řas Scenedesmus
subspicatus a Selenastrum capricornutum (ISO 8692:1989) Vydána: září 1995
ČSN EN ISO 11348-3 Jakost vod - Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou
emisi Vibrio fischeri (Zkouška na luminiscenčních bakteriích) - Část 3: Metoda s
lyofilizovanými bakteriemi. Vydána: leden 2000. Účinnost: 2000.02.01
ČSN EN ISO 10253 : Jakost vod - Zkouška inhibice růstu mořských řas Skeletonema
costatum a Phaeodactylum tricornutum Vydána: únor 1999. Účinnost: 1999.03.01
ČSN EN ISO 5667-16: Jakost vod - Odběr vzorků - Část 16: Pokyny pro biologické zkoušení
vzorků Vydána: říjen 1999 Účinnost: 1999.11.01
ČSN EN ISO 10712 : Jakost vod - Zkouška inhibice růstu na Pseudomonas putida (zkouška
inhibice rozmnožování buněk Pseudomonas) Vydána: prosinec 1997. Účinnost: 1998.01.01
ČSN EN ISO 6341: Jakost vod - Zkouška inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus
(Cladocera, Crustacea) - Zkouška akutní toxicity Vydána: prosinec 1997.Účinnost:
1998.01.01
ČSN EN ISO 11348-1 : Jakost vod - Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou
emisi Vibrio fischeri (Zkouška na luminiscenčních bakteriích) - Část 1: Metoda s čerstvě
připravenými bakteriemi Vydána: leden 2000.Účinnost: 2000.02.01
ČSN EN ISO 11348-2 : Jakost vod - Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou
emisi Vibrio fischeri (Zkouška na luminiscenčních bakteriích) - Část 2: Metoda se sušenými
bakteriemi Vydána: leden 2000.Účinnost: 2000.02.01
ČSN EN ISO 11348-3: Jakost vod - Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou
emisi Vibrio fischeri (Zkouška na luminiscenčních bakteriích) - Část 3: Metoda s
lyofilizovanými bakteriemi Vydána: leden 2000.Účinnost: 2000.02.01
ČSN EN ISO 7346-1: Jakost vod - Stanovení akutní letální toxicity látek pro sladkovodní
ryby [Brachydanio rerio Hamilton - Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] - Část 1: Statická
metoda Vydána: únor 1999. Účinnost: 1999.03.01
ČSN EN ISO 7346-2 : Jakost vod - Stanovení akutní letální toxicity látek pro sladkovodní
ryby [Brachydanio rerio Hamilton - Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] - Část 2: Obnovovací
metoda Vydána: únor 1999.Účinnost: 1999.03.01
ČSN EN ISO 7346-3: Jakost vod - Stanovení akutní letální toxicity látek pro sladkovodní ryby
[Brachydanio rerio Hamilton - Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)] - Část 3: Průtočná metoda
Vydána: únor 1999. Účinnost: 1999.03.01
ČSN ISO 10229: Jakost vod - Stanovení subchronické toxicity látek pro sladkovodní ryby Metoda
vyhodnocení účinků látek na růstovou rychlost pstruha duhového /Oncorhynchus
mykiss Walbaum (Teleostei, Salmonidae)/ Vydána: březen 1997.Účinnost: 1997.04.01
ČSN ISO 10706: Jakost vod - Stanovení chronické toxicity látek pro Daphnia magna Straus
(Cladocera, Crustacea) Vydána: prosinec 2001.Účinnost: 2002.01.01
TNV 757741 Mikrometoda stanovení toxicity a trofického potenciálu řasovým testem.
(oborová norma pro Vodní hospodářství, platná od roku 1995)
TNV 757754 Mikrometoda stanovení toxicity na korýši Thamnocephalus platyurus. (oborová
norma pro Vodní hospodářství, platná od roku 1997).
Význam a interpretační potenciál ekotoxikologických biotestů
Ekotoxikologické biotesty by měly být zaměřeny na stanovení přítomnosti nebo
nepřítomnosti environmentálního problému. Biotesty mohou být zahrnuty buďto do
počátečního skríningu (tzv. toxicity presence/absence tests), který stanoví a
prioritizuje potenciální zdroje znečištění (bodové i nebodové, vody, sedimenty), nebo
mohou následovat za chemickými analýzami, aby determinovaly a prioritizovaly
vysoké hladiny, nebo biodostupnost kontaminant.
Informace o ekotoxicitě by měla sloužit jako signál k provedení podrobnějších
fyzikálně-chemických analýz nebo alespoň jako jejich doplněk. Indikace toxicity však
nemusí vždy korelovat s chemickými a fyzikálními rozbory sledovaného materiálu.
Biotesty mohou signalizovat nebezpečí, aniž fyzikálně-chemické analýzy detekují
zvýšené hladiny nebezpečných látek ve vzorku, a naopak i přes indikaci toxicity z
fyzikálně-chemických rozborů reagují testované organismy negativně. Organismus
totiž vypovídá o testovaném materiálu komplexně, záleží např. na biodosažitelnosti
toxických složek nebo se mohou projevit interakce mezi přítomnými polutanty, které z
chemických rozborů nevyplývají.
Laboratorní data vnášejí jisté nejistoty do interpretace měření ve spojení se
sledováním efektů kontaminant in situ. Z těchto metod je dobré zmínit například
metody sledující struktury společenstev perifytonu, zoobentosu, či ryb, biomarkry in
situ - ryby, rostliny, řasy, zooplankton, zoobentos, Avšak v případě, že je testována
nejhorší varianta možné kontaminace, fungují biotesty jako včasné varování před
potenciálními problémy, které by se mohly stát kritickými. To platí především v
případech, kdy přírodní populace díky působení mnoha dalších environmentálních
faktorů mohou detekovat negativní efekt teprve tehdy, když se již stává
nebezpečným. Specifické hypotézy, které jsou formulovány, se proto testují
doplňkovými laboratorními testy nebo studiemi v přírodním prostředí, nejlepší je však
kombinace obou.
výhody nevýhody
in situ
(terénní)
dlouhodobá expozice
integrace toxických vlivů
mnoho neznámých faktorů
problematická interpretace dat
in vitro
(laboratorní)
faktory pod kontrolou, standardizované,
srovnatelné, jsou v legislativě
některé biotesty jsou
vzdáleny přírodě - pozor při interpretaci!
Hlavní rozdíl mezi ekotoxikologickými biotesty a in situ metodami je, že biotesty
zahrnují experimentální expozice v laboratorním uspořádání, kde jsou všechny
proměnné kontrolovány nebo známy a toxický faktor je manipulován. Studie
přírodních populací jsou však ovlivněny mnoha variabilními fyzikálními, chemickými a
biologickými faktory, které se navíc ve svých účincích na populace různě kombinují,
a proto nelze jednoduše oddělit tuto variabilitu od vlivu toxických látek. Nejlepší
podmínky pro ověření skutečného nebezpečí toxického efektu nastanou, když může
být aplikace příslušného zásahu náhodně opakována, což zaručuje, že pozorovaný
negativní efekt byl s největší pravděpodobností důsledkem tohoto zásahu a ne
důsledkem velké variability prostředí. Laboratorní verze zákroku je opakovatelná,
verze z reálného prostředí však většinou není (Chapman 1995a).
Nezbytnost redukovat přírodní prostředí na o mnoho jednodušší laboratorní
situaci může vést k podhodnocení nebo nadhodnocení efektů toxické látky v přírodě.
Jak falešně pozitivní výsledky (efekt byl detekován v laboratoři, ale ne in situ), tak i
falešně negativní (efekt byl indikován v přírodních podmínkách, ale ne v
laboratorních) však neznamenají, že laboratorní výsledky jsou neplatné, protože
laboratorní testy jsou o mnoho jednodušší a neduplikují studie in situ (viz níže). Na
druhé straně in situ metody jsou příliš komplexní a nedovolují oddělení efektů
kontaminant od přírodních změn (Chapman 1995b, Parkhurst 1995).
Pokud biotest indikuje přítomnost toxického faktoru a jestliže se zároveň
testovaný druh vyskytuje v oblasti, ale ne v kontaminovaném místě, je zde silná
pravděpodobnost, že biotest předpovídá to, co se děje v reálném prostředí. Pokud je
však testovaný druh nalezen ve sledované kontaminované oblasti, znamená to, že
jeho životní stádia nejsou exponována k toxikantu nebo biotest neindikuje, co se
aktuálně děje v životním prostředí tohoto organismu. Protože však může nastat
adaptace in situ, může biotest naznačovat, že organismy jsou stresovány. Neexistuje
však způsob, jak určit rozsah a významnost takového stresu (vykazují druhy toleranci
nebo rezistenci?), aniž by byly prováděny rozsáhlé experimentální studie.
Integrativní přístup ke znečištění životního prostředí vyžaduje jak
experimentální laboratorní studie, tak pozorování přímo in situ, jelikož oba přístupy
se doplňují a myšlenka, že laboratorní studie vyžadují ověření in situ se postupně
stává již dogmatem. Stejně tak výsledek samotného biotestu nebo skupiny biotestů
nám sice může indikovat nebezpečí pro ekosystém, ale bez podrobných fyzikálněchemických
analýz většinou nelze příčinu tohoto nebezpečí identifikovat.
Složení a tvorba bateriíí ekotoxikologických biotestů
Odpověď jednotlivých organismů na přítomnost toxických látek není jednotná,
ovlivňuje ji mnoho faktorů jako biologická dosažitelnost toxikantu, způsob přijímání
toxikantu organismem, jeho bioakumulace nebo schopnost škodlivou látku
odbourávat, atd. Každý organismus reaguje na přítomnost toxického materiálu jiným
způsobem, proto je nezbytné k získání co nejkomplexnější informace o jeho toxickém
působení na živé organismy použít k testování vždy více druhů a vždy zástupce
všech trofických úrovní. Zapojením většího počtu testovacích organismů roste
informace o zkoumaném vzorku a zvyšuje se tak výpovědní hodnota celé metody.
Do baterie jsou vybírány individuální testy tak, aby byla schopna detekovat co
nejvíce skupin toxikantů s vysokou spolehlivostí.
Výběr biotestů pro ekotoxikologické testování se liší u různých autorů, firem a
laboratoří. Obecně neexistuje žádné pravidlo, podle kterého se jednotlivé biotesty do
baterií začleňují, ale vždy převládá názor, že by měly představovat různé trofické
stupně (de Zwart 1995). V některých zákonech je definováno povinné (minimální)
složení baterie testů (i v ČR – např. Zákon o odpadech, Zákon o chemických látkách
apod.). Někteří odborníci zdůrazňují ekonomičnost celé baterie a pracují jen s
akutními mikrobiotesty , další aplikují ve svých studiích společně s mikrobiotesty i
standardní testy toxicity doporučované mezinárodními organizacemi jako ISO, EPA
apod. (Costan et al. 1993), jiní upřednostňují právě tyto standardní testy (Thomas et
al. 1986) nebo biotesty kombinují podle typu testovaných vzorků (Harkey et al. 1994,
Keddy et al. 1995), atd. Do výběru biotestů pro ekotoxikologické baterie se
samozřejmě výrazně odráží i soudobý výzkum a vědecké zaměření
ekotoxikologických pracovišť (Dutka 1996). Schopnost sestavit takovou baterii
ekotoxikologických biotestů, která bude mít co nejreálnější vypovídací hodnotu a
jejíž interpretace bude přesně odpovídat na problematiku studované lokality patří
k důležitým znalostem každého ekotoxikologa. K tomu je samozřejmě důležité mít
přehled o možnostech nejen normovaných testů, ale také jejich alternativ a nových
publikací v oboru.
Příklad základní a rozšířené sady ekotoxikologických biotestů
Při hodnocení ekologických rizik (např. ve smyslu zákona o chemických látkách) je
nutné použít testy toxicity na organismech minimálně tří trofických úrovní producent,
konzument a destruent. Do sady analýz je také nutné vybírat testy, které jsou
schopny testovat jak kapalné, tak i pevné vzorky (sedimenty, půda). Testy označené
LPT (liquid phase test) jsou schopny otestovat jen kapalný - čirý a mírně zbarvený
vzorek, testy SPT (solid phase test) testují pevné vzorky, případně silně zbarvené a
zakalené kapaliny. Následující sady testů obsahují analýzy všech těchto typů:
Základní sada
A. Testy na bakteriích
1. Microtox - (LPT)
test na inhibici luminiscence mořské bakterie Photobacterium phosphoreum.
Tento test také disponuje verzí SPT - microtox. Procedura vyžaduje navíc
chlazenou centrifugaci. (DIN 38 412 part 34 / 1991)
2. Turbidimetrický test (LPT)
Test měří růstovou rychlost bakteriálních buněk turbidometricky. Změna intenzity
zákalu oproti kontrole vypovídá o inhibičních účincích vzorku. (ISO 10712:1995
Water quality - Pseudomonas putida growth inhibition test - Pseudomonas cell
multiplication inhibition test).
3. Sediment-chromotest (Toxichromopad) (SPT)
Test inhibice de novo syntézy β-D galaktozidázy E. coli. (Kwan 1993, Kwan et
Dutka 1996, Day et al. 1995, Kwan 1995, Ramirez et al. 1996, Dutka et al. 1996).
B. Testy s producenty
4. Růstově inhibiční test na řasách (LPT)
(Scenedesmus quadricauda, Scenedesmus subspicatus nebo Raphidocelis
subcapitata).
Test založený na měření inhibice růstové rychlosti kultury testované řasy (v době
exponenciálního růstu) po 72 - 96 hodinové expozici v testovaném vzorku.
(OECD 201/1984, ISO 8692:1989 Water quality—Fresh water algal growth
inhibition test with Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum)
Místo testu SPT na řasách je vhodné použít:
5. Test klíčivosti a růstu kořenů vyšších rostlin - 72 hod (SPT)
• řeřicha setá (Lepidium sativum), hořčice setá (Sinapis alba), salát hlávkový
(Lactuca sativa). (OECD 208/1984 Terrestrial Plants, Growth Test)
C. Testy na bezobratlých
6a. Imobilizační, případně reprodukční test na perloočkách 48 h. (Daphnia magna)
(LPT) OECD 202/1984 Daphnia sp. Acute Immobilisation Test and Reproduction
Test, ISO 6341:1996 Water quality - Determination of the inhibition of the mobility of
Daphnia magna - Acute toxicity test),
6b. Thamnotoxkit (LPT)
Testovací organismus Thamnocephalus platyurus je vylíhnut z klidových stádií
(cyst, efipií) během 20-24 hod (stejné stáří).
TNV 757754 Mikrometoda stanovení toxicity na korýši Thamnocephalus
platyurus.)
7. Kontaktní test na filtračním papíře - Eisenia sp. (LPT)
Dospělé žížaly Eisenia sp. s dobře vyvinutým clitellem (opaskem) jsou 48 hodin
exponovány na filtračním papíře navlhčeném roztokem testované látky. Stanovuje
se mortalita, která je odečítána po 24 a 48 hodinách. Metoda je snadná, ale
nestanovuje hodnoty účinků či dávky chemikálií v půdě.
(OECD 207/1984 The filter paper contact test)
Rozšířená sada
A. Testy na bakteriích
8. Test na inhibici spotřeby kyslíku aktivovaným kalem (LPT)
ISO 8192:1986 Water quality - Test for inhibition of oxygen consumption by
activated sludge, OECD 209: Activated sludge respiration test.
9. ATP - test (LPT)
ATP - test využívá měření bakteriální ATP jako indikátoru růstové inhibice.
Základní test pro měření ATP je založen na měření světelné luminiscence, která
následuje po reakci luciferinu s ATP za přítomnosti luciferázy a hořečnatých iontů.
(Xu a Dutka 1987, Dutka et al. 1991a,b, 1993, 1995)
10. MetPlate (LPT)
Test enzymové inhibice β-galaktozidázy E. coli. - mutant, citlivý na přítomnost již
malého množství těžkých kovů.
Tento test má také SPT variantu pro vzorky pevných matric MetSoil (SPT). (Bitton
et al. 1996, Kong et al. 1995).
B. Testy na řasách
11. Test na řasách (LPT)
TNV 757741 Mikrometoda stanovení toxicity a trofického potenciálu řasovým
testem.
C. Testy na bezobratlých
12. Test akutni, chronické toxicity (a genotoxicity) s nematody (LPT)
Panagrellus redivivus je mnohobuněčný organismus, který ve svém vývoji
prochází pěti stádii. Na nepříznivé životní pomínky (přítomnost toxikantu) reaguje
Panagrellus smrtí nebo zástavou růstu. Během 96 hodinového růstového období
se tak dají monitorovat jak letální tak subletální efekty. Přeměna z juvenilního
stádia do dospělosti vyžaduje velmi intenzivní genovou aktivitu. Tento fakt je
využíván jako potenciální indikátor genotoxicity. (Samoiloff 1990, Dutka et al.
1994, Dutka et al. 1995).
13. Rotoxkit (LPT) Vířník Brachionus calyciflorus představuje testovací
organismus. (ASTM - E 1440 - 91, 1992, SOP 1996.
Současné trendy v ekotoxikologických biotestech
Rostoucí potřeba testovat nové chemické látky a vzorky z životního prostředí ve
velkých seriích vedla k následujícím trendům ve vývoji biotestů:
• miniaturizaci prostorového uspořádání, objemu testovacích nádob, medií
apod.
• zkrácení doby inkubace při zachování citlivosti testu
• zjednodušení a možnost alternací při vyhodnocování testu (fluorescenční
metody, molekulární sondy, průtoková cytometrie atd.)
• slevnění biotestů (viz miniaturizace a zkrácení diby inkubace)
• bezpodmínečná nutnost zapojení biotestů reprezentujících různé trofické
úrovně v ekosystému
• přehodnocování standardních testů (OECD, ISO, EPA atd.) a tvorba
nových Draftů
• využití nových vědeckých poznatků (např. řízení produkce klidových stádií,
uchovávání řasových kultur, využívání lyifilizovaných kultur pro biotesty s
bakteriemi).
• Co nejvíce se přibližovat při testování reálné situaci v terénu – zapojení
nových metod vzorkování (permeabilní membrány), využití kontaktních testů (SPT,
Ditrect testy atd.) tedy přímé testování bez nutnosti přípravy výluhu
• Stále častěji je standardní součástí baterie ekotoxikologických biotestů
(zaměřených na toxicitu, mortalitu) také sada biotestů zaměřených na mutagenitu,
genotoxicitu, teratogenitu a biochemické márkry, enzymatické aktivity, či buněčné
kultury, zaměřené na konkrétní typ látky, nebo účinku.
• Přenos dat systémy GSM – on-line systémy biotestů.
Literatura
ASTM (1992): Standard guide for acute toxicity test with the rotifer Brachionus. ASTM Designation E 1440 - 91.
In: Annual book of ASTM standards. Section 11. Water and Environmental Technology. Volume 11.01.
Pesticides, resource recovery, hazardeous substances and oil spillresponses, waste management, biological
effects, , pp.1210-1216.
G. Bitton, K. Rhodes and B. Koopman (1996): Ceriofast
TM
: An acute toxicity test based on Ceriodaphnia dubia
feeding behaviour. Environ. Toxicol. Chem. 15, 123-125.
Chapman, P. M. : Bioassay testing for Australia as part of water quality assessment programmes. Austr. J. Ecol.
20, 7-19 (1995a).
P. M. Chapman: Ecotoxicology and pollution - key issues. Mar. Poll. Bull. 31, 167-177 (1995b).
G. Costan, N. Bergmingham, C. Blaise and J.F. Ferard: Potential Ecotoxic Effects Probe (PEEP): a novel index to
assess and compare the toxic potential of industrial effluents. Envir. Toxic. Wat. Qual. 8, 115-140 (1993).
K.E. Day, B.J. Dutka, K.K. Kwan, N. Batista, T.B. Reynoldson, and J.L. Metcalfe-Smith (1995): Correlations
between solid-phase microbial screening assays, whole-sediment toxicity tests with macroinvertebrates and in
situ benthic community structure. J. Great Lakes Res. 21, 192-206.
B.J. Dutka, K.K. Kwan, S.S. Rao, A. Jurkovic and D. Liu (1991a): River evaluation using ecotoxicological and
microbiological procedures. Environmental Monitoring and Assessment 16, 287-313.
B. J. Dutka, K. K. Kwan, S. S. Rao, A. Jurkovic, R. McInnis, G. A. Palmateer and B. Hawkins (1991b): Use of
bioassays to evaluate river water and sediment quality. Environ. Toxicol. Wat. Qual. 6, 309-327.
B.J. Dutka, D. Liu, A. Jurkovic, and R. McInnis (1993): A comparison of four simple water extraction-concentration
procedures to be used with the battery of bioassay tests approach. Environ. Toxicol. Wat. Qual. 8, 397-407.
B.J Dutka, A. Jurkovic, R. McInnis, K.K. Kwan and T. Murphy (1994): Battery of tests approach applied to three
different types of sediment extracts. J. Environ. Sci. Health A29 (8),1649-1661.
B. J. Dutka, R. Bourbonniere, R. McInnis, K. K. Kwan and A. Jurkovic: Bioassay assessment of impacts of tar
sands extraction operations. Environ. Toxicol. Wat. Qual. 10, 107-117 (1995).
B. J. Dutka, R. McInnis, A. Jurkovic, D. Liu and G. Castillo (1996): Water and sediment ecotoxicity studies in
Temuco and Rapel river basin, Chile. Environ. Toxicol. Wat. Qual. 11, 237-247.
G. A. Harkey, Landrum, P. F. and S. J. Klaine: Comparison of whole-sediment, elutriate and pore-water
exposures for use in assessing sediment-associated organic contaminants in bioassays. Environ. Toxicol. Chem.
13, 1315-1329 (1994).
C. J. Keddy, J. C. Greene and M. A. Bonnell: Review of whole-sediment bioassays: soil, freshwater sediment, and
freshwater assessment in Canada. Ecotox. Environ. Saf. 30, 221-251 (1995).
I.-C. Kong, G. Bitton, B. Koopman and K.-H. Jung (1995): Heavy metal toxicity testing in environmental samples.
Rev. Environ. Contam. Toxicol. 142, 119-147.
K.K. Kwan, 1993: Direct toxicity assessment of solid phase samples using the Toxi-Chromotest Kit.
Environmental Toxicology and Water Quality Vol. 8, 223-230.
K.K. Kwan, 1995: Direct sediment toxicity testing procedure using Sediment- Chromotest Kit. Environmental
Toxicology and Water Quality Vol. 9, 193-196.
K.K. Kwan, B.J. Dutka, 1996: Development of reference sediment samples for solid phase toxicity screening
tests. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 56, 696-702.
B. R. Parkhurst: Are single species toxicity test results valid indicators of effects to aquatic communities? In: J.
Cairns, B. R. Niederlehner (Eds.) Ecotoxicological Toxicity Testing: Scale, Complexity, and Relevance, Lewis
Publ., USA (1995). pp.105-121.
G. Persoone, C. Blaise, T. Snell, C. Janssen and M. Van Steertegem (1993): Cyst-based toxicity tests: II - Report
on an international intercalibration exercise with three cost-effective Toxkits. Jour. Appl. Zool. 79, 17-36.
N.E.Ramirez, Vargas, M.C., Sanchez, F.N., (1996): Use of the „Sediment- Chromotest“ for monitoring stimulated
hydrocarbon biodegradation processes. Environmental Toxicology and Water Quality Vol. 11, 223-230.
M. Samoiloff (1990): The nematode toxicity assay using Panagrellus redivivus. Tox. Assess. 5, 309-318.
SOP (1996): Standard operational procedure: Rotoxkit F. Crustacean toxicity screening test for freshwater.
Creasel, Belgium
J.M. Thomas, J.R. Skalski, J.F. Cline, M.C. McShane, J.C. Simpson, K.E. Miller, S.A. Peterson, C.A. Callhan and
J.C. Greene: Characterization of chemical waste site contamination and determination of its extent using
bioassays. Env. Tox. Chem. 5, 487-501 (1986).
H. Xu and B. J. Dutka (1987): ATP-TOX System - a new, rapid, sensitive bacterial toxicity screening system
based on the determination of ATP. Tox. Assess. 2, 149-166.
P. T. S. Wong a D. G. Dixon: Bioassessment of water quality. Environ. Toxicol. Wat. Qual. 10, 9-17 (1995).
D. de Zwart: Monitoring water quality in the future. Vol. 3: Biomonitoring. Ministery of Housing, Zoetermeer,
Netherlands (1995).