Ekotoxikologické biotesty: rozdělení, přehled, použití. Doc. Ing. Blahoslav Maršálek, CSc, Oddělení experimentální fykologie a ekotoxikologie, Botanický ústav AVČR, Květná 8, 603 65 Brno, , Tel/Fax 05 43241911 a RECETOX - Výzkumné centrum pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii, Masarykova univerzita Kamenice 3, 618 00 Brno, Definice biotestu • Biotest lze definovat jako proces, při němž je testovací systém (tkáně, organismus, populace apod.) exponován v přesně definovaných podmínkách různými koncentracemi zkoumané chemické látky nebo směsného či přírodního vzorku. Rozdělení ekotoxikologických biotestů (základní přehled těch nejčastějších) Dle doby expozice dělíme ekotoxikologické biotesty akutní semiakutní (semichronické) chronické Dle testovacího uspořádání" • Statické • Semi-statické • Průtočné Dle pokročilosti designu testovacího systému (Také 4 generace biotestů) • 1. generace -klasické (standardní) • 2. generace -mikrobiotesty • 3. generace -biosenzory, biosondy a biomárkry • 4. generace - on-line systémy s dálkovým přenosem dat Dle trofické úrovně testovacích organismů • producenti, • konzumenti, • destruenti Dle testované matrice • voda, • půda, • vzduch, • sediment, • odpad, • chemická látka Dle spektra testovacích organismů • Jednodruhové (Single Species), • Vícedruhové (Multi Species s přírodními populacemi i laboratorní směsi kultur)_ Dle typu testovaného vzorku • čisté chemické látky (hydrofilní, hydrofobní, těkavé), • směs látek (známých i neznámých), • přírodní vzorky (většinou neznámé, směsné, s neznámými interakcemi - nejsložitější interpretace Dle způsobu přípravy vzorku • definované koncentrace chemických látek, • testování výluhů přírodních vzorků (extrakce org. rozpouštědly, DMSO, vodou, různé pH, teplota atd.), • semipermeabilní membrány, • přímé testy (Direct Tests, Solid Phase Tests, Whole Effluent etc.) • TIE(C-18, AC, pH....) Dle stupně komplexnosti detekčního systému (Od nejednodušších k nejsložitějším ) • enzymy, • biosondy, • buněčné a tkáňové kultury in vitro, • intaktní živý organismus, • populace, • micro/mezo kosmos, • terénní experimenty Dle způsobu vyhodnocování • letální efekty (mortalita, imobilizace), • subletální efekty (chování organismů - např. rychlost a směr pohybu), hodnocení fyziologické aktivity (fotosyntetické asimilace, enzymatická aktivita, efekty na membránách, přírůstky - délka kořene, počet buněk v populaci, nebo hmotnost organismu, náchylnost k napadení chorobami, škůdci či parazity apod)., reprodukční aktivita, • malformace a teratogenita atd. Specielní testy pro hodnocení rizik v životním prostředí • trofie, • mutagenita/genotoxicita nejen na bakteriích, ale také na rostlinnách, volně žijících zvířatech a rybách, • teratogenita, například na obojživelnících - Xenopus laevis, • embryotoxicita a reprodukční testy na rybách, korýších, obojživelnících, ptácích, hraboších apod. • Detekce spec. mechanismů (endokrinní disruptory, TCDD apod.) Biotesty procesů • Biokoncentrace • biokumulace • testy pro hodnocení biodegradability Ekotoxikologické biotesty Stanovení ekotoxicity - souhrn 1) Standardní biotesty 2) Alternativní biotesty 3) Další biotesty (specifické mechanismy, in vitro testy) 4) Testy procesů (biodegradabilita, bioakumulace...) 5) Testy orgánové toxicity s laboratorními zvířaty - obratlovci, savci "humánní toxikologie" Laboratorní L ekotoxikologické biotesty 6) Experimentální mikro a mezokosmy 7) Polní studie In sítu hodnocení ^" efektů STANDARDNÍ (standardizované) EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY ■ Standardizace - maximální standardizace kroků experimentálního postupu s cílem omezit faktory "intra-laboratorní" variability ■ Výhody standardních biotestů - zaručení jednotnosti a opakovatelnosti výsledků - při dodržení postupu - srovnatelnost výsledků z různých laboratoří - validované výsledky (viz dále) jsou vhodné pro ROZHODOVÁNÍ (sanace, pokuty...) - malá nutnost optimalizace ... ■ Nevýhody standardních biotestů - velmi specifická a omezená vypovídací hodnota ("akutní leta lita pro korýše Daphnia"), zpravidla vhodné jen pro zařazení (klasifikace) toxicity látek (více - středně - méně toxické ...) - omezený počet standardizovaných postupů, zpravidla jednoduché (akutní) efekty EKOTOXIKOLOGICKE BIOTESTY Každý biotest liednodruhové, vícedruhové, mikrokosmv...) je pouze zjednodušením = modelem ekosystému • cílem ekotoxikologických studií je pochopení, charakterizace a ev. předpověď účinků v celých populacích, společenstvech, ekosystémech • z experimentálních výsledků je nutno provádět EXTRAPOLACE • ? jsou laboratorní druhy relevantní pro přírodní organismy • ? je laboratorní expozice (voda) relevantní pro přírodní podmínky (sediment) • ? jsou výsledky na jednom druhu relevantní pro populaci, společenstvo • ? jsou výsledky in vitro testu (stanovení dioxinové toxicity) relevantní pro efekt na celém organismu • pro vyjádření nejistot plynoucích z extrapolací jsou často používány tzv. extrapolační faktory nebo faktory nejistoty - (UF- uncertainity factors, UF = 1, 5, 10 -1000) - aplikace = násobení (dělení) získaných výsledků Interpretační potenciál ekotoxikoloqickych biotestů • Dobře definují toxicky potenciál čistých látek • Biotesty počátečního skríningu (tzv. toxicity presence/absence tests). • Propojení s chemickými analýzami, aby determinovaly a prioritizovaly vysoké hladiny, nebo biodostupnost kontaminant v přírodě. • Upozorní na interakce mezi přítomnými polutanty, které z chemických rozborů nevyplývají. • Pozor na přímé interpratace lab. testů pro přírodní podmínky!!!! EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY Experimentální design • které parametry charakterizují biotest, které je nutno evidovat 9 ■ • Zdroje variability • Komplexnost biologického systému • Doba expozice • Uspořádání expozice • Expoziční scénář • Biologický systém - organismus, druh • Další specifika biologického systému • Hodnocený parametr, endpoint • Další abiotické faktory v experimentu In situ & In vitro • in situ (terénní) + dlouhodobá expozice integrace toxických vlivů • - mnoho neznámých faktorů, problematická interpretace dat • in vitro (laboratorní) + faktory pod kontrolou, standardizované, srovnatelné, jsou v legislativě • - některé biotesty jsou vzdáleny přírodě - pozor při interpretaci! Současné trendy v ekotoxikoloqickych biotestech • Miniaturizace • zkrácení doby inkubace při zachování citlivosti testu • zjednodušení a možnost alternací při vyhodnocování testu (fluorescenční metody, molekulární sondy, průtoková cytometrie atd.) • bezpodmínečná nutnost zapojení biotestů reprezentujících různé trofické úrovně v ekosystému - kombinace- viz text! • využití nových vědeckých poznatků (nové Drafty norem) • Co nejvíce se přibližovat při testování reálné situaci v terénu • Stále častěji také sada biotestů zaměřených na mutagenitu, genotoxicitu, teratogenitu a biochemické márkry, enzymatické aktivity, či buněčné kultury, zaměřené na konkrétní typ látky, nebo účinku. • Dálkový přenos dat z on-line systémů Mikrobiotesty II. generace Mezi biotesty II generace, tzv. mikrobiotesty patří ty které: • využívají klidová, stadia testovacích organismů -nevyžadují udržování a kultivaci matečných kultur (MetPad, SOS chromotest, Chromotoxkit, Sediment Chromotest, Microtox Thamnotoxkit, Rotoxkit, Daphtoxkit, Ceriotoxkit, Protoxkit, Algatoxkit.......) • nahrazují používání zvířat pro testy toxicity (in vitro tkáně ryb, baterie Thamno-Roto-Chromo, ■ ■ ■ ■ ^ • šetří laboratorní a kultivační prostor, vyžadují jen malé objemy vzorků, lze najednou zpracovat Mikrobiotesty II. generace Možnosti využití mikrobiotestů • čistírny odpadních vod (odpadní vody, čistírenské kaly, ověření účinnosti čistírenského procesu) • testování reziduí pesticidů a kontaminace zemědělských půd • monitoring úniků cizorodých látek ze skládek různých typů odpadů • sledování dopadů a rozšíření ekologických havárií, monitoring procesu dekontaminace po havárii • monitoring kontaminace podzemních vod • sledování biodegradability látek v modelových a přírodních podmínkách • rychlé screeningové testování nových látek a chemikálií • nasazení všude tam, kde se používají standardní ekotoxikologické biotesty, ale je zapotřebí zpracovat Srovnáni citlivosti standardních organismů používaných pro EB (dvojchroman draselný - mg/l) Poecilia reticulata 180(120- 240) Lemna minor 30 (10-60) Sinapis alba 25 (10-40) Microtox 3,8(2,1-5,5) Daphnia magna 1,4 (0,8-1,8) Pseudokirchneriella subcapitata 0,5 (0,24-0,78) Thamnocephalus platyurus 0,1 (0,08-0,25) Citlivost k toxikantům je „species- dependent" DAPHNIA MAGNA STREPTOXKIT F. 24 hr <*) THÁMNQTÓXklf F 24 hr <•'•)' ROTOXKIT F : MJCROTOX 30' 24 hrV 24 hr . S042"ÍNa7S0d) 5600 5S00 3900^ 3700 17000 Í5')L 1.3 OTHER INORGANIC COMPOUNDS mg/l N8N05 4.12 6.49 Free NH^ 190 L 13 4.6 «■ 2 Í5-)L NH4CI 320 120 (pH 7.81 / 160 2. ORGANIC COMPOUNDS 2.1 HALOG2NATED A LKÁ NES ma/i Carfc/on tetrachloride 37 ».7 ti&11 Chloroform 79 L > 1000 20 L 670^ Dichloromethane 900 > 1000 2800 (5')L i 1,1 .l-Trichloroethano 1 1.2 (48hr) / 910 > 100 B.04 (15]L 2.2 ALCOHOLS mg/l Ethenol 19000 / 28000 39000 30000 / 39000 35000 Ethylene glycol 60000 39000 130000 621 isopropsriol 1 i^w ^ m \j w w Ú2QQ &±- Proto jsou nutné baterie testů DAPHNIA MAGNA '24 hr . áTREPTOXKtT P 24 hr (•) THAMN0TOXKIT ř 24 hr C •) ROTOXKIT F 24 hr MICROTOX 30' Methanol 33000 39000 36000 320000 2.3 CARBOXYUC ACIDS (mg/l) Trichloroacetic acid 1.46 20.6 Sodiu.n oxalate 410 210 64.2 i 2,4-Jicn.loro-phenoxy-acetic acid 190 150 117 Acetylsalicylic acid 180 130 140 2.4 AMINES (mg/1) : Aniline 0.9 L 3.12 0.65 432 (i5'tL 3,4-Dichloroaniline 0.2 ^ 6 L 0.11 62 L 2.5 PHENOIS (mg/l) I Phenol 7.8/21 L 10.9 33 1200 36L í 2.6 DETERGENTS img;1i Sodium Dodeeyl Sulfate (SLS) 17.4 L 29.1 10.6 1.4 L 1.1L 2.7 AROMATIC HYDROCARBONS :nS'i> Benzene 510 >100 . >50 >1000 L 100L C) = Presently replaced by the THAMNOTOXKIT F (**)«Has replaced the STREPTOXKTT P (L) = Value based on literature study / Složené z různých organism 1 DAPHNIA MAGNA-24 hr STREPTOXKIT F 24 hr !•! ' THAÍvlNOTOXKn Fi. 24 hr (' •> ROTOXKH ř 24 hf MICROTOX 30' 10 81.5 23.3 34.6 13.7 (15'1L Na+ INsCD 400/2200 2700 1800 * 1500 20000(f)1 Ni2+