Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Předúprava vzorků – koncepční úvaha B. Maršálek Proč předúprava jako téma EB? • V současné době existuje nepřeberné množství možností jak předupravit vzorek pro ekotoxikologické biotesty. • Vždy jde o koncepční úvahu, kterou musíme náležitě zdůvodnit a zdokumentovat v protokolu testu, protože jde o významný zásah, který zásadním způsobem ovlivní výsledek a interpretovatelnost ekotoxikologických biotestů. Důvod předúpravy vzorků • Odlišení typů toxikantů, které mohou koakčně působit na testovací organismus Separaci rušivých vlivů • (trofie v případě producentů, , • vysoké „tvrdosti“ vody v případě dafnií, • separaci biomasy cyanobakterií v surovém extraktu (pigmenty, soli a biokumulované kovy a jiné polutanty), • čímž zvyšujeme korelaci mezi sledovaným toxikantem a toxickým efektem na testovací organismus …alespoň deset příkladů: •  Tepelná úprava: zahřátí, autoklávování, či převaření je významný zásah, který odstraní termolabilní toxikanty a nechá vyniknout termostabilní. Typický příklad použití je denaturace některých pesticidů, nebo odlišení hepatotoxinů od neurotoxinů při testování ekotoxicity extraktů biomasy cyanobakterií. Termolabilní neurotoxické alkaloidy jsou denaturovány při 70°C a hepatotoxické microcystiny zůstanou aktivní. Tento zásah nelze doporučit obecně, v některých vzorcích se toxicita na korýše zvýší (viz graf. Č. 1). V přírodních vzorcích například vod a sedimentů se tepelnou úpravou změní biodostupnost živin i toxikantů! 2. •  Změny hodnoty pH: TIE, TRE doporučuje vyluhovat vzorky půd, sedimentů a odpadních vod jednak při pH 3, 11 a při přirozeném pH z lokality. Dále jsou doporučeny systémy extrakčních pufrů, které stejný vzorek extrahují při plynule se měnícím pH gradientu od 2 do 12. Tento postup je doporučen především při podezření z toxicity kovů a amoniaku. Pozor, extrémní hodnoty pH mohou změnit toxikologický profil mnoha pesticidů! Tato metodika je často používána v kombinaci s se stripováním, zeolity a filtrací. 3. •  Stripování, probublávání: • Probublávání (většinou intenzivní 1h ) • je použitelné pro okysličení podzemních vod (kde může docházet k úhynu konzumentů při nedostatku kyslíku), je běžně používáno při • odstranění amoniaku a volatilních látek. podezření na přítomnost tenzidů, které v průběhu stripování vytváří pěnu. 4. •  Thiosíran sodný: intenzivní stripování může zoxidovat toxické látky, které pak mají odlišné toxikologické profily a proto je doporučeno přidávat 3- 5% Na2S2O3.5H2O. • Vzorek je ale nutno před biotestem kontinuálně aerovat tak, aby byla dosažena hodnota validace testů (většinou 60% nasycení kyslíkem). 5. •  EDTA - ( kys. ethylendiamintetraoctová) je používána jako dvojsodná sůl v koncentracích 200- 5000mg/l. Efekt je především na chelataci kovů, v nejvyšší uvedené koncentraci však také odstraní mikroprvky z media pro řasové testy 6. •  Filtrace: může zásadním způsobem změnit toxicitu. Skleněné filtry mají tu výhodu, že snesou použití organických rozpouštědel, což nejde např. u nitrocelulozových. Např. koloidní frakce, která zůstane zachycena na filtračním papíře může představuje často 60-75% toxicity celého vzorku. Takto si lze velmi zkreslit výsledky testů v neprospěch detekce toxicity. Často se také zapomíná, že jednoduchým ekvivalentem oddělení pevné a kapalné fáze (což je cílem filtrace) je centrifugace, která zanáší do procesu přípravy vzorků méně vlivů než filtrace. 7. • Sorbenty na principu zeolitů a jílových minerálů jsou používány v metodice TRE/TIE pro odlišení a odstínění vlivů 8. • SPE – extrakce pevnou fází: nejčastěji používanou náplní kolon je C-18 silikagel (pro separaci organických molekul ), ale použít lze kolony dle typu separovaných látek od sloučenin hliníku, až po XAD-7 a jim podobné náplně. Zde jsou důležité procesy prekondiciace kolony tak, aby chytala ty látky, které koncentrovat má a propouštěla takové látky, které potřebujeme odseparovat. Jde o využití technik analytické chemie a jejich účinnost a vhodnost pro stanovení např. toxicity biomasy cyanobakterií a odstínění rušivých vlivů v testech toxicity 9. • Extrakce organickými rozpouštědly: je běžné a výhodné využívat zvyklostí a postupů používaných v přípravě vzorků pro analytickou environmentální chemii, je však nutno být si vědom vlivu organického rozpouštědla na testovací organismy. Z organických rozpouštědel (metanol, etanol, aceton, oktanol, heaxanol a dalších běžných v analytické chemii) je pro ekotoxikologické biotesty nejčastěji používán dimethylsulfoxid (DMSO). Řasové testy toxicity snášejí dle našich zkušeností do 3% DMSO, korýši 5-7%, ryby 5-10% bakterie až 20% DMSO. Blíže viz přednáška Doc. Mičiety. 10 •  Kombinace metod: nejčastěji používaným systémem předúpravy vzorku pro ekotoxikologické biotesty je kombinace výše uvedených a dalších metod. • pH úprava s aerací (volatilní látky, tenzidy) • EDTA a aerace (kovy a amoniak) • Filtrace a C-18 kolony (organické látky, biomasa sinic) • Filtrace /centrifugace ve spojení s molekulárními síty pro předem definované velikosti molekul • Lyofilizace předem homogenizované biomasy sinic poskytne jiné výsledky testů toxicity, než testování zamražených vzorků biomasy • Různé způsoby homogenizace vzorků (ultrazvuk, třepání, mletí a drcení, suchých a zmrazených vzorků atd). Způsob přípravy vzorků z přírody: • standardní výluh dle ISO, OECD, ČSN... 100g + 1000 ml destil. Vody • 20_+3°C 24 h rotační třepačka • separace 5μm filtrace nebo centrifugace • direct testy • známá koncentrace látky - s úpravou pH/bez úpravy • frakcionace SPE C-18 • EDTA, • Aktivní uhlí • Extrakce do DMSO • Extrakce do org. Rozpouštědel – koncentrace + purifikace Zdroje variability v testech toxicity • Způsob, doba a místo odběru, reprezentativnost odběrového místa, přeprava (teplota, vzdálenost, fixace, míchání • Způsob a doba uchovávání (teplota, světlo, těkavost, biotické a chemické interakce s matrici) • Příprava vzorků (extrakce, doba a způsob skladování extraktů, způsob oddělení matrice, extrakční činidlo) • Příprava ředící řady, (použitá media zvolený rozsah koncentrací) • Použitý testovací organismus a jeho metabolická aktivita, stáří, zdrav. stav. • Experimentální design - množství opakování, objem vzorku, pH, 02, způsob osvětlení, krmení, těkavost, stabilita zkoumané látky v podmínkách testu světlo+ lab. Teplota - statické/průtočné • SOP/ GLP/ akreditace • Způsob vyhodnocení - zvolená expozice, endpoints, • Interpretace dat - zvolená kriteria ECx TU, třídy čistoty a vyluhovatelnosti, indexy kumulace atd. Závěr • Vždy jde o koncepční úvahu, kterou musíme náležitě zdůvodnit a zdokumentovat v protokolu testu, protože jde o významný zásah, který zásadním způsobem ovlivní výsledek a interpretovatelnost ekotoxikologických biotestů. • Vše uvést do testovacího protokolu!!!(interpretace variability!!!) Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky