Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Moderní přístupy studia biochemických a buněčných mechanismů toxicity v ekotoxikologických biotestech Klára Hilscherová Soustava orgánů Orgán Tkáň Buňka Organela Biomolekula Jedinec Populace Společenstvo Ekosystém Biosféra Flexibilita Schopnost určit příčinu Specifita Citlivost Ekologická relevance Trvání odpovědi Dlouhodobější následky VYSOKÁ VYSOKÁ NÍZKÁ NÍZKÁ BIOMARKERY • Časné varovné signály potenciálního poškození organismu i celé populace, časný marker toxicity (i bez morfologických změn) • Vybrané parametry, jejichž měřitelné změny jsou prvními, časnými odpověďmi na expozici cizorodými látkami („early warning of biological impact“). • Cizorodými látkami způsobené změny buněčných nebo biochemických složek, struktur, nebo funkcí, které jsou měřitelné v biologickém vzorku • Citlivé, rychlé odpovědi, mohou ukazovat mechanismus účinku, předcházejí viditelným symptomům toxicity • Nejlépe prostudovány u vyšších živočichů (savců, ryb) • Možno sledovat i u druhů ze standardních akvatických biotestů (řasy, makrofyta, bezobratlí) - screeningové metody s vysokou predikční schopností, alternativa/doplnění ke stávajícím metodám. - používány v základním toxikologickém, ekotoxikologickém a farmakologickém výzkumu, v medicínské diagnostice. - některé obecně akceptovány. - řada parametrů testována jako potenciální biochemické markery. - potenciál využití jako alternativní metody pro toxikologické hodnocení nových xenobiotik. Výhoda biologických a biochemických indikátorů kontaminace: schopnost vypovídat o vlivu znečištění v celém jeho komplexu, se všemi synergistickými a antagonistickými vlivy mezi jednotlivými znečišťujícími komponenty. Biochemické markery Biochemické markery Princip: toxické látky v subletálních koncentracích způsobují změny hodnot hematologických, biochemických ukazatelů, nespecifické imunity, vyvolávají histopatologické změny v tkáních. Po vstupu cizorodých látek do organismu či buňky dochází: • k jejich vazbě na buněčné receptory kontrolující klíčové buněčné pochody, • ke vzniku reaktivních intermediátů, • k inhibici určitých enzymových aktivit a dalším procesům, které předcházejí toxickým a dalším negativním efektům na úrovni buňky, orgánů, organismů a populací. Xenobiotika Cílové molekuly • DNA • proteiny • lipidy • environmentální polutanty • léky • agrochemikálie Poškození • adukty • oxidace Teratogenita Malformace Mortalita .... Eliminace • UDPGTs Bioaktivace • PHS • LPO • P450 Detoxifikace • GSH • GST • epoxid hydroláza Reaktivní intermediáty  elektrofily  volné radikály Reaktivní kyslíkové radikály Buněčná ochrana • GSH • GPx • GST • GR • SOD • Cat • G6PD Biochemické markery toxicity - indikují mechanismus toxicity, nikoliv určitou cizorodou látku. - některé biochemické parametry specificky odrážejí expozici některou třídou nebo skupinou kontaminantů. - biologickými modely jsou nejčastěji jaterní tkáň, i další tkáně dle typu biomarkeru a cíle studie, primární hepatocyty nebo permanentní linie odvozené od hepatocytů, případně odebraná krev či jiné tělní tekutiny • Vhodně zvolené biomarkery jsou významnými indikátory zdravotního stavu organismů v monitorovaném ekosystému. • Předností je schopnost detekovat toxické účinky látek před manifestací jejich účinku, tzn. před narušením fyziologických funkcí jako např. růstu, vývoje, reprodukce. Biomarkery = biochemické či fyziologické indikátory expozice nebo vlivů xenobiotik na suborganismální nebo organismální úrovni Výhoda: odpovídají na expozici = reagují pouze na polutanty dostupné pro organismus. Vhodné biomarkery by měly splňovat následující vlastnosti: (i) senzitivní ve srovnání s ostatními biomarkery; (ii) specifičnost ke konkrétním druhů chemických xenobiotik; (iii) permanentní odpověď; (iv) jasnost v interpretaci a propojení na vlivy vyšší úrovně; (v) spolehlivost, reprodukovatelnost; (vi) preciznost, jednoduchost a nízké náklady; (vii) aplikovatelnost v terénních podmínkách a validace v terénu • identifikují látku v systému a interaktivní produkt mezi xenobiotikem a endogenní složkou nebo jiné skutečnosti v biologickém systému způsobené expozicí. • charakterizují množství toxikantu, které proniklo do organismu • neposkytují příliš informací o následcích expozice, různě specifické BIOMARKERY EXPOZICE BIOMARKERY ÚČINKU-VLIVU • biochemické změny, které se projevily jako výsledek negativní interakce toxikantu a biologického systému a mohou vyústit až v patologické poškození organismu Biomarkery expozice I. Stresové proteiny (proteiny teplotního šoku) – nespecifické, indukovatelné u rostlin i živočichů II. Inhibice esterázové aktivity (acetylcholinesterázy) – enzym nervového systému živočichů, specifická odpověď - po expozici organofosfátových pesticidů a karbamátů - primární toxický vliv těchto látek, stupeň inhibice enzymů je v úzkém vztahu k expozici tkání Acetylcholinesteráza (AchE): zejména v mozku, červených krvinkách a plasmě některých obratlovců, zodpovědná za hydrolýzu acetylcholinu, hlavního přenašeče nervových vzruchů mezi nervovými buňkami. Její inhibice silně ovlivňuje přenos nervových signálů. III. Metalothioneiny - cytoplasmické kovy-vážící proteiny, vyskytují se u řady eukaryot, indukce po expozici kovy, biomarkery vlivu toxických kovů. - skupina proteinů s nízkou molekulovou hmotností, vysokým obsahem aminokyselin obsahujících sulfhydrylové skupiny (zejména cystein) a schopností vázat těžké kovy. K jejich zvýšené syntéze dochází při zvýšené koncentraci iontů kovů, jak esenciálních, tak toxických IV. Indukce detoxikačních enzymů u rostlin i živočichů A. Enzymy I. fáze biotransformace – enzymy MFO (monooxygenázy smíšené funkce) – indukce enzymů cytochromu P450 (EROD, MROD, PROD) cytochrom P4501A - biomarker expozice důležitých skupin organických látek - hladina cytochromu indukována 2,3,7,8-tetrachlodibenzo-p-dioxinem a příbuznými látkami, PCB, PAH - cytochromy P450 (CYP) jsou hemoproteiny schopné vázat molekulární kyslík a vsunovat jeho jeden atom do molekuly substrátu, kterým mohou být i cizorodé látky, které jsou jedním nebo více cytochromy přeměněny tak, aby mohly být z organismu např. exkretovány. B. Enzymy II. fáze biotransformace – glutathion transferázy (GST), uridinedifosfoglukuronosyl transferázy, sulfotransferázy BIOMARKERY EXPOZICE Biomarkery účinku I. Parametry oxidativního stresu - produkce kyslíkových radikálů, aktivita antioxidačních enzymů, koncentrace neenzymatických antioxidantů, oxidativní poškození makromolekul II. Parametry energetické bilance organismu – obsah lipidů, proteinů, uhlovodíků a aktivita elektronového transportu III. Indikátory narušení metabolismu - metabolické enzymy pyruvát kináza, laktát dehydrogenáza, isocitrát dehydrogenáza IV. Biomarkery zatížení endokrinního systému - vitelogenin, hormony T3 a T4, enzymy metabolizmu steroidních hormonů. V. Genotoxické biomarkery (narušení integrity DNA – zlomy v DNA, mikrojadérka) VI. Histologicko-patologické změny některých orgánů Parametry oxidativního stresu  produkce kyslíkových radikálů – superoxid, peroxid vodíku, hydroxylový radikál  aktivita antioxidačních enzymů – glutathion peroxidáza, glutathion reduktáza, superoxidáza, kataláza  koncentrace neenzymatických antioxidantů  oxidativní poškození makromolekul – lipidní peroxidace, oxidativní adukty DNA, produkty oxidace proteinů Jedná se biomarkery organochlorových pesticidů, PCB, pesticidů typu paraquat apod. Genotoxické biomarkery (narušení integrity DNA – zlomy v DNA, mikrojadérka) - využívány při hodnocení zatížení ekosystémů látkami s genotoxickým účinkem, které indukují vznik chromosomálních aberací a mutací. alternativa detekce - metody PCR, RT-PCR a DNA-fingerprintingu, test mikrojader Test mikrojader (MNT) - jednoduchá orientační metoda ke stanovení genotoxicity. Pozitivní po působení PCB, benzpyrenu, benzidinu, apod. BIOMARKERY ÚČINKU Stanovení produkce vitelogeninu • Vitelogenin je bílkovina produkovaná jaterními buňkami ryb, obojživelníků, plazů a ptáků. • Produkce je indukována vazbou estrogenů na jaderné receptory. • U samic je vitelogenin transportován do vaječníků, kde tvoří součást žloutkových proteinů. • U samců je hladina endogenních estrogenů přirozeně velmi nízká, a proto je i produkce vitelogeninu minimální • Po působení ED´s s xenoestrogenním účinkem (např. ethinylestradiol, chlordan, toxafen, dieldrin, 4-nonylfenol) dochází u obou pohlaví ke zvýšení hladin vitelogeninu – výrazné zejména u samců • Naopak působením antiestrogenních ED´s (např. metoxychloru) se produkce vitelogeninu minimalizuje pod měřitelnou úroveň. • Sledován zejména u ryb a obojživelníků Biomarkery účinku na endokrinní systém Další parametry: vitelin, cytochromy, hladiny hormonů Histochemická charakteristika a lokalizace Pesticidy PAHs PCBs Xenoestrogeny P450 Neurotoxicita Oxidativní stres Metaloproteiny G E N O T O X I C I T A Stresové proteiny Histologické markery Imulogické markery Fyziologické markery Růst, Reprodukce Enzymy II.fáze detoxikace Specifičtější parametry Nespecifické parametry BIOMARKERY Kovy Vitelogenin Doporučené metody pro biologické monitorovací programy ve vodním prostředí na národních úrovních Metoda Organismus V současnosti používán v monitorovacích programech Biomarkerlátek Biologický význam Tvorba DNA aduktů Ryby, mlži Francie, Holandsko, Švédsko, USA PAU, nitro látky, amino triazinové pesticidy Parametr genotoxických vlivů, citlivý indikátor minulé a současné expozice Inhibice acetylcholiesterázy Ryby, korýši, mlži Francie Organofosfáty a karbamáty nebo podobné molekuly, možné řasové toxiny Parametr expozice Indukce metallothioneinů Ryby Monitoring and Research Programme of the Mediterranean Action plan, Holandsko Indukce metallothioneinových proteinů vlivem určitých kovů (Zn, Cu, Cd, Hg) Parametr expozice a disturbance metabolismumědi a zinku Indukce ethoxyresorufin-Odeetylázy (EROD) nebo cytochromuP450 1A Ryby Německo, Francie, Holandsko, UK, Belgie, Monitoring and Research Programme of the Mediterranean Action plan, Norsko Indukce enzymů detoxikujících planární organické kontaminaty (PAU, planární PCB, dioxiny) Možný prediktor patologie vlivem mechanistických propojení, senzitivní indikátor současné expozice Inhibice Δ-amino levulinové kyselina (ALA-D), indukce vitellogeninu Samci a juvenilní jedinci ryb Holandsko, UK Estrogenní látky Parametr feminizace samčích ryba reprodukční poškození Aplikace biomarkerů v akvatických testech  Při přípravě testu nezbytné používat dobře charakterizovaný materiál – homogenní populaci  faktory ovlivňující biomarkery - druh organismu, pohlaví, věk, vývojové stadium a výživa, environmentální faktory (teplota etc.)  otestovat a nakalibrovat potřebné množství vzorku podle množství sledovaných parametrů, jejich limitu detekce a spotřeby biologického materiálu pro jednotlivé metodiky - u malých druhů směsné vzorky z více jedinců Biomarkery - závěry • Biomarkery = citlivé indikátory zatížení organismů environmentálními stresory a subletálních účinků • Umožňují náhled do subletálních fyziologických procesů – charakterizují mechanismus účinku • Specifické markery – informují o přítomnosti specifického stresoru • Použitelnost určitého biomarkeru pro každý nový druh musí být validována a optimalizována, musí být posouzena jeho relevance a míra odpovědi pro nový druh • Nezbytný multiparametrický přístup • Studium spojení časných subletálních biochemických a buněčných změn s dlouhodobějšími negativními účinky na úrovni populace a společenstva Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Alternativy klasických in vivo testů in – vitro in – silico Speciální ekotoxikologické biotesty – in vitro • standardní testy (normy ISO, ČSN, USEPA) • optimalizace/vývoj nových testů • Toxicita • Specifické mechanismy neletálních účinků  Genotoxicita  Dioxinová aktivita  Mechanismy endokrinní disrupce – estrogenita, androgenita  Imunotoxicita  Biochemická ekotoxicita • Testování čistých látek (environmentální polutanty) modelových směsí komplexních environmentálních extraktů In vitro toxikologie Testy na původních či geneticky modifikovaných prokaryotických či eukaryotických buňkách - využívány zejména pro teoretické objasnění účinku toxického agens - v poslední době i pro rutinní provádění testů toxicity BAKTERIÁLNÍ TESTY, KVASINKOVÉ TESTY TESTY NA TKÁŇOVÝCH KULTURÁCH Testy na buněčných kulturách • Primární buněčné kultury – z tkání organismů, jsou nestandardní, což může významnou měrou ovlivnit výsledek testu toxicity (= nízká reprodukovatelnost). • Permanentní linie - například stabilizované linie kožních buněk, nervových buněk, buněk srdečního svalu, buněk odvozených od tkání ledvin a pod., většinou nádorového původu • buněčný substrát pro založení kultury pochází z modelových druhů nebo se kdysi získal od lidského dárce (jako vedlejší materiál např. při operaci), pak byl stabilizován a uzpůsoben k neomezenému dělení a následné kultivaci. • dnes se kupuje v buněčné bance, respektive Sbírce buněčných kultur. • možno získat stabilní buněčné linie z různých orgánů a z různých druhů organismů; tyto linie se velmi dobře přechovávají v hybernovaném stavu. • Kmenové buňky a z nich diferencované buňky – nově vyvíjené modely – Vývoj 3D kultivačních technik • podle předepsaných podmínek (výživa, teplota, vlhkost apod.) lze danou buněčnou kulturu rozpěstovat a použít v toxikologickém testu. • buňky se nasazují do speciálních nádob pro pěstování buněčných kultur, přidává se živné medium obohacené o antibiotika, případně antimykotika Využití tkáňových kultur (TK) = Alternativní metoda k pokusům na živých organismech Řada testů optimalizována na provedení v mikrodestičkách (high throughput testing) • stabilizované linie se dobře pěstují, rychle rostou a lze vytvořit mnoho vzorků menších kultur, ke kterým se přidávají do kultivačního prostředí chemické látky a zkoumá se charakter toxických účinků Výhody TK: výrazné snížení množství zvířat použitých v experimentu • zajištění vysokého počtu vzorků; původ kontrolních i experimentálních vzorků ze stejné tkáně, což minimalizuje variabilitu získaných výsledků. Nevýhoda TK: možnost sledovat účinky testované látky pouze na konkrétním druhu tkáně, ze kterého byla TK připravena, tedy chybějící možnost posouzení zdravotního stavu a chování celého živočicha. IN VITRO TOXIKOLOGIE & KMENOVÉ BUŇKY self-renewal self-renewal self-renewal Terminálně diferencované buňky Proliferačnípotenciál Potence Diferenciace Izolace & Reprogramování (2007 - člověk) Izolace (1998 - člověk) Indukované pluripotentní buňky (iPSC) Izolace (1997 - člověk) Embryonální kmenové buňky (ESC) Dospělé kmenové a progenitorové buňkyDospělé (tkáňově-specifické) kmenové buňky – Normální nenádorové buňky organismu – Symetrické (self-renewal) a asymetrické dělení (diferenciace) – Proliferační potenciál a potence – Vývoj protokolů pro jejich in vitro diferenciaci do požadovaných typů buněk IN VITRO TOXIKOLOGIE & KMENOVÉ BUŇKY Příklad: Hepatotoxicita – Játra – hlavní detoxikační orgán – Biotransformace / bioaktivace toxických látek – Permanentní jaterní linie (např. HepG2) – nízká aktivita detoxikačních enzymů – malá relevance Gen Genová exprese Izol.hepa- tocyty HepG2 CYP2B6 100 0.5 CYP2C9 100 0 CYP3A4 100 0 UTG1A1 100 5.2 AldB 100 0 Albumin 100 12.3 In vitro diferenciace hESC do „hepatocyte-like cells“ (Greenhough 2010, Toxicology 278) (Guillouzo 2010, Toxicology 270) MECHANISMY chronické toxicity polutantů • Princip: různé chronické účinky chemické látky vycházejí ze společného biochemického mechanismu působení – Základní výsledky z mechanisticky založených in vitro testů – zhodnocení in vitro účinků jednotlivých látek • Poznání zásadního mechanismu, predikce rizika – využití pro hodnocení rizik a/nebo monitoring • Určení relativních potencí ("toxických ekvivalentů") -> RA • Biomarkery in vitro – přímá charakterizace komplexních vzorků HORMON Biochemické účinky TOXIN In vivo účinkyRECEPTOR Receptorově-mediované mechanismy toxicity ESTROGENNÍ RECEPTOR - ER Testy receptorově-mediovaných mechanismů • Jaderné receptory zahrnují několik rodin receptorů: Androgenní receptor (AR), estrogenní receptor (ER), progesteronový receptor (PR), glukokortikoidní receptor (GR) a mineralokortikoidní receptor (MR) jsou hlavními představiteli rodiny steroidních receptorů • Aryl hydrokarbon receptor (AhR) – umístěný v cytosolu • Receptory slouží jako poslové mezi genomem a extracelulárními signály, na které musí buňka reagovat, aby přežila. • Např. AhR regulují na základě interakce s xenobiotiky expresi enzymů I. a II. fáze biotransformace a některých detoxifikačních transportérů, které se přímo podílejí na biotransformaci nebo exkreci xenobiotik. Princip testu: sledovaná aktivita reportérového enzymu odpovídá potenci látky či směsi pro interakci s receptorem aktivita reporterového genu, např. luminometrie - indukce nebo inhibice reporterové luciferázy, nebo spektrofotometrie – indukce nebo inhibice reporterové β-galaktosidázy Toxicita dioxinového typu • Aryl hydrokarbonový receptor (AhR) • indukce detoxikačních systémů • narušení funkce jater, imunity a reprodukce, endokrinního a nervového systému, karcinogenita, embryotoxicita • „cross-talk“ s jinými hormonálními signálními drahami Anti/estrogenita • Estrogenní receptor (ER) • vývoj pohlaví, řízení reprodukce, karcinogeneze, ovlivňuje buněčnou proliferaci a diferenciaci, vývoj a homeostázu Studované mechanizmy účinku Interakce s jadernými receptory – důležité mechanismy chronické toxicity Anti/androgenita • Androgenní receptor (AR) • vývoj pohlaví, zejména samčích pohlavních charakteristik, řízení reprodukce, karcinogeneze, ovlivňuje růst, spermatogenezi Glukokortikoidní aktivita • Glukokortikoidní receptor (GR) • ovlivňuje vývoj, metabolismus, immunitní odpověď, reakci na stres Anti/retinoidní aktivita • Receptor kyseliny retinové (RAR) • reguluje růst, morfogenezi, apoptozu a diferenciaci, ovlivňuje nervový a imunitní systém, vidění a embryonální vývoj Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky - Pod kontrolu AhR- responsivního elementu vložen gen pro luciferázu HSP90 HSP90 HSP90 HSP90 AhR Diox. aktivní látky DRE-Luc syntéza luciferázyluminometr ATP+ lucigenin - Stanovení na buněčné linii krysího hepatomu H4IIE.luc In vitro stanovení dioxinové toxicity In vitro stanovení estrogenní aktivity In vitro biotesty k detekci dioxinové a estrogenní aktivity Buňky H4IIE-Luc Buňky MVLNBuňky trypsinovány a dávkovány 15,000 buněk/jamku Po 24 hodinách vyměněno medium, dávkovány testované látky Expoziční doba : 3-72 hod Po expozici odstraněno medium, buňky vymyty pufrem a přidán Luclite reagent. Po 20 minutách měřena aktivita luciferázy v destičkovém luminometru. y = 1,1217x - 36,261 R 2 = 0,9422 0 400 800 1200 1600 0 500 1000 1500 TCDD-EQ (pg/g) TEQ(pg/g) y = 1,0764x + 723,67 R 2 = 0,8345 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 0 5000 10000 15000 20000 25000 TCDD-EQ [pg/g] TEQ[pg/g] In vitro testy na buněčných liniích - hodnocení expozice látkami se specifickým mechanismem účinku (látky s dioxinovou, estrogenní aktivitou) - reportérové buněčné linie transfekované genem luciferázy, který je indukován po navázání ligandu na receptor - kalibrace odpovědi standardním ligandem (2,3,7,8-TCDD pro dioxinovou aktivitu, 17β-estradiol pro estrogenní aktivitu) Vztah mezi dioxinovými toxickými ekvivalenty stanovenými v biotestu na buněčné linii (TCDD-EQ) a spočítanými z výsledků chemických analýz Srovnání různých látek -> Použití v hodnocení rizik • Kvantifikace účinků (EC50) - relativní potence • Srovnání s účinkem referenčního toxikantu (2,3,7,8-TCDD) • Vyjádření jako relativní potence/ Ekvivalenční Faktor (~ REP/TEF) 0 20 40 60 80 100 120 1.E-07 1.E-04 1.E-01 1.E+02 TCDD 4´-OH-PCB 79 4´-OH-PCB 3 AhR-mediatedactivity(%TCDD-max) concentration (µM) EC50 = 10 pM EC50 = 2 µM B[a]P B[e]P TCDD: EC50 TCDD PAH: EC50 PAH Relativní potence REP = EC50 TCDD / EC50 PAH Kolikrát je ta látka slabší ligand než TCDD ? Toxické equivalenční faktory pro PCDDs, PCDFs a PCBs: Eljarrat & Barceló, Trends Anal. Chem.22: 655 Testování komplexních vzorků ze životního prostředí • vzorky vzduchu, sedimentů, půd • rychlý screening znečištění • hodnocena toxicita, genotoxicita, dioxinová a estrogenní aktivita • výběr vzorků pro podrobnější studium/analýzu • spojení s analytickou chemií, frakcionace Problém reprezentativního vzorkování, uchovávání vzorku „pseudopersistentní látky“ – kontinuální expozice nízkým dávkám Výhody toxikologických in vitro testů • rychlost, citlivost, reprodukovatelnost, snadnost provedení, menší náklady • ukazují celkovou biologickou aktivitu látek, které působí specifickým mechanismem • možnost provést screening velkého množství vzorků • mohou poukázat na přítomnost toxikologicky významných látek, které nejsou běžně analyticky stanovovány • sledují i možné interakce (jako synergismus či antagonismus) působení látek v komplexních směsích Nevýhody toxikologických in vitro testů • nezohledňují biotransformaci látek v organismu • nemohou plně nahradit enzymaticko-imunitní reakci živého organizmu • neposkytují informaci o tom, které jednotlivé látky ze směsí vyvolaly odpověď • poskytují informaci jen o celkové aktivitě látek působících určitým specifickým mechanismem Závěr: Testy toxicity na buněčných kulturách jsou vhodný screening před provedením baterie testů na živých organismech. Toxikogenomika • identifikace, kvantifikace potenciálních genetických rizik • identifikace konkrétních genů, jejich produktů a procesů, kterými buňky reagují na environmentální toxikanty a stresory • sledovat vedlejší účinky chemických látek na biologické systémy • vytváření databází toxikologických, genetických a genomických informací Nová vědecká disciplína – objasňuje, jak je celý genom zapojen v biologických odpovědích organismů na stresory - studuje odpovědi/reakce genomu na stresory a toxické látky (Waters et al. 2003) - kombinuje genomiku - transkriptomiku, proteomiku, metabolomiku a bioinformatiku s klasickou toxikologií Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky