Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky
Testy toxicity sedimentů
K.Hilscherová
Sedimenty
- velmi různorodé složení - polotuhá matrice - pevná fáze (částice) a
pórová voda
• v podstatě akvatický ekvivalent půdy
- heterogenní prostředí - směs jílu, písku, minerálů, huminových látek,
odumřelých organismů a antropogenních polutantů
- akumulace a inaktivace polutantů
(např. AVS – kovy, Corg – PAHs)
• primární úložiště biotického i abiotického materiálu (včetně
polutantů) v akvatickém prostředí
• akumulace polutantů v sedimentech může způsobit:
1. Změny ve struktuře bentických společenstev
2. Zvýšené zatížení organismů polutanty
3. Toxicitu
Klasifikace sedimentů
1. Obsah organického uhlíku – ovlivňuje sorpci neutrálních
organických látek  zvýšené Kow = zvýšená sorpce
2. Distribuce zrnitostních frakcí – větší částice mají tendenci
sorbovat méně polutantů
3. Obsah a typ jílu
4. Kationtová výměnná kapacita (KVK)
– ovlivňuje sorpci kationtů
1. pH – ovlivňuje speciaci kovů, sorpci
Další fyzikálně chemické parametry
– DO, salinita, amoniak
Transport a resuspendace sedimentů
Proudy, povodně, vítr, vlny
- Způsobují pohyby sedimentů v závislosti na jejich velikosti
Porová voda
• Voda mezi částicemi sedimentů
• Nepolární polutanty  sedimenty  porová voda 
vodní sloupec
• Primární zdroj expozice polutantů pro organismy žijící v
sedimentu
Sedimenty mohou vázat polutanty, pak být překryty další
vrstvou sedimentů  redukce biodostupnosti
Odběry vzorků sedimentů
- tyčové vzorkovače (vertikální profil, historie sedimentace)
- pasivní vzorkovače – sedimentové pasti (plaveniny)
- drapákové vzorkovače (směsné vzorky)
- SPMDs – odběr určitých typů polutantů (zejm. pórová voda)
 Narušení fyzikálně chemických parametrů sedimentů
Manipulace se vzorky
• Uskladnění:
změny toxicity vzorků v závislosti na teplotě (chlazení (4ºC) vs. mražení
(<-20ºC)) , době uskladnění a stupni kontaminace sedimentů
• Úpravy vzorků:
1.) úpravy pH (6-9) – vliv na toxicitu a biodostupnost kovů (Zn, Ni, Pb,
Cu, Cd), amoniaku a sirovodíku
2.) lyofilizace vs. zmražení
3.) amoniak – odstranění amoniaku ze vzorku probubláváním nebo
přidáním zeolitu
4.) homogenizace
5.) kovy – odstranění kovů přidáním EDTA nebo sulfidů
6.) výluhy (vodné/organické) vs. SPTs – změny toxicity eluátů v závislosti
na volbě rozpouštědla (voda, methanol, DCM) vs. toxicita biodostupné
frakce kontaminantů
7.) pórová voda vs. SPTs
Testy se sedimenty
• Organismy v sedimentu vystaveni látkám zachyceným v pevné i
kapalné složce matrice
• Pro bentické organismy - biodostupnost chemických stresorů v
sedimentech.
• Sediment = potenciální dlouhodobý zásobník/zdroj kontaminantů
uvolněných do vody
• Může být nezbytné remediovat kontaminované lokality bagrováním
nebo odstraněním sedimentů
• odstranění sedimentu, jeho transport a uložení mohou být velmi
nákladné; studie toxicity umožní identifikovat nebezpečně
kontaminované lokality – kde je třeba odstranění, kde možno
ponechat bez významného rizika.
• Zejména EPA a ASTM metodiky
Jak hodnotit toxicitu sedimentů?
 Toxicita porové vody/výluhů (několik ISO / OECD
norem)
: 100 g d.w./L vody, 24h pomalé třepání, filtrace, test
V. fisheri (30 min), řasy, bezobratlí - D. magna (2 dny)
? Vodný výluh vs. Sediment
 Doporučeny nejméně 2 různé druhy (např. Hyalella, Chironomus, Daphnia, …) a dva různé
sledované parametry (např. růst, přežití, reprodukce...)
 Kontaktní toxicita (jen málo norem …)
: sedimenty+organismy & hodnocení účinků – červi, hmyz, šneci … dny - týdny
Skríningové testy toxicity/genotoxicity
Bakteriální modely
Testy s výluhy sedimentů:
• Vibrio fischerii (Microtox) – 0,5 h
• Escherichia coli (Toxichromotest) – 2 h
Kontaktní verze testu
• Flash test s Vibrio fischerii – kinetický test - stanovení inhibičního
účinku vzorků na světelnou emisi Vibrio fisheri
• srovnatelné se statickou zkouškou s luminiscenčními bakteriemi podle
ČSN EN ISO 11348
• Flash verze - eliminace vlivu zákalu a zbarvení vzorku, umožňuje
provedení testu se suspenzí vzorku bez přípravy vodného výluhu. Je
mezistupněm ke kontaktním zkouškám ekotoxicity
Testy genotoxicity s výluhy:
• SOS chromotest
• umuC test
• GFP test atd.
Nástroje pro hodnocení
• Základní požadavky
– Měření zakalených (barevných) materiálů
– Schopnost rozlišení TOXICKÝ - NETOXICKÝ
– Rychlost
• Bakteriální bioluminiscenční testy toxicity
– Klasické – Microtox®, BioToxTM, LUMISTox aj.
– Alternativní – modifikace klasických testů (např.
BioToxTM Flash test*)
* Lappalainen, J. et al. (1999): Chemosphere, 38(5), pp. 1069-1083.
Microtox
• Vibrio fischerii
- Mořská bakterie schopná bioluminiscenece
Design:
- Akutní
- mikrodestička
- Endpoint: inhibice bioluminiscence
- Luminometr – t = 0, 15, 30 minut
- Testování vodného výluhu
Flash test
• Vibrio fischerii
- testování zakalených a
barevných vzorků, bez potřeby
referenčního materiálu
design:
- akutní
- inhibice bioluminscence
- mikrodestička
- luminometr s dispensorem
- nutné vzorek protřepat (během měření)
- krátká doba měření – Hodnota píku
Smax (0-2s) v porovnání s píkem
S30s (po 30s měření)
Akutní testy toxicity I.
• Porová voda
• Eluát ze sedimentu
• 48-96 h expozice
• Příprava eluátu: 24h třepání, 100 g sedimentu/1L vody
• Druhy: Daphnia magna, Daphnia pulex, Ceriodaphnia
dubia, střevle potoční (Pimephales Promelas), pstruh
duhový (Oncorhynchus mykiss)
• Sledované parametry: přežívání, imobilizace
Akutní testy toxicity II.
• Kontaktní testy - Celý sediment
• 96h – 10 dní expozice
• Druhy: různonožec (Hyalella azteca), jepice
(Hexagenia limbata), pakomár
(C.tentants/riparius)
• 10-denní test s Hyalella azteca a Chironomus
tentans
• Sledované parametry: přežívání
Chronické testy toxicity I.
• Porová voda
• Eluát ze sedimentu
• 7-35 dní expozice
• Druhy: Ceriodaphnia dubia, střevle potoční (Pimephales
Promelas), pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss)
• Sledované parametry: přežívání, imobilizace, růst,
reprodukce, doba první reprodukce, doba úhynu,
přežívání mladých
Chronické testy toxicity II.
• Kontaktní testy - Celý sediment
• Zpravidla 28 dní expozice
• Druhy: různonožec (Hyalella azteca), pakomár
(C.tentants/riparius)
• Sledované parametry: přežívání, imobilizace, růst,
reprodukce, doba první reprodukce, doba úhynu,
přežívání mladých
• 28- a 42-denní testy s H. azteca
• Sub-chronické a celoživotní testy s Chironomus tentans
• 10-denní krátkodobý chronický test s larvami
obojživelníků
ASTM E 1706 (2005) Standard Test Method for Measuring the Toxicity of
Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates
• korýš Hyalella azteca ( H. azteca)
• pakomár Chironomus tentans
• 10 denní test, 300-mL kádinky, 100 mL sedimentu, 175 mL
vody, organismy krmeny
• Parametry: přežívání, růst
Další testy sedimentů:
Chironomus riparius, Daphnia magna a Ceriodaphnia dubia, Hexagenia spp.,
Chronický test s Tubifex tubifex (28 dní) – přežívání, růst, reprodukce
Chronický test s H. azteca
Chironomus dilutus - přežívání, růst, vylétávání, reprodukce
Ekotoxikologické biotesty se sedimenty – přehled EPA
s
www.epa.gov
Ekotoxikologické biotesty se sedimenty – přehled EPA
www.epa.gov
Testy toxicity sedimentů ASTM
Testy toxicity sedimentů ASTM
Tubifex tubifex - Nitěnka obecná
• Součást makrozoobentosu
• Relevantní organismus pro sediment
• Inhibice pohybu a letální koncentrace
kmen: KROUŽKOVCI
třída: opaskovci
podtřída: máloštětinatci
Spíše chroničtější expozice – viz. Chronické testy
– pakomáři, mlži, korýši, kroužkovci - Hyallela, Lumbriculus
Testy toxicity sedimentů
Akutní test
Účel: Test je určen k hodnocení akutní toxicity látek na nitěnky. Nitěnky patří mezi
nejčastěji a nejdéle používané testovací organismy.
Princip: Test spočívá ve sledování chování a přežívání nitěnek v odstupňovaných
koncentracích látky ve srovnání s kontrolou
v ředící vodě. Expozice je 48 h. Možno i prolongovaný 10-14 denní test
Hodnocené parametry: přežívání, aktivita, bioakumulace
Testy s larvami pakomárů rodu Chironomus
• OECD 218 Sediment-Water Chironomid Toxicity Test Using
Spiked Sediment
• OECD 219 Sediment-Water Chironomid Toxicity Test Using
Spiked Water
• USEPA 2000 Celoživotní (Life-cycle) test pro hodnocení účinků
kontaminace sedimentů s pakomárem Chironomus tentans
Chironomus riparius Meig.
(pakomár)
Charakteristika modelového druhu
• rod Chironomus - řád dvoukřídí (Diptera) = hmyz
s proměnou dokonalou
• vajíčko-larva(4 instary)-kukla-imago
• dominantní konzumenti 1. řádu v rámci
sladkovodních akvatických
ekosystémů
• značná abundance
• kosmopolitní rozšíření
• larvy - všežravci
- živí se řasami, rozsivkami,
detritem
10-denní test s larvami pakomárů rodu Chironomus
Nasazovány larvy ve stadiu 2-3
instaru (cca 10 d staré)
10 jedinců/kádinku
100 ml sedimentu/175 ml vody
Teplota 20 ± 2°C
Pravidelné krmení, vzduchování
Fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy
Sledováno pH, kyslík, vodivost
Po 10 dnech hodnoceno přežívání a
růst
Celoživotní (Life-cycle) test pro hodnocení účinků
kontaminace sedimentů s pakomárem Chironomus tentans
Nasazovány larvy mladší jak 24 h
12 jedinců/kádinku
100 ml sedimentu/175 ml vody
Teplota 20 ± 2°C
Pravidelné krmení, vzduchování
Fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy
Sledováno pH, kyslík, vodivost
Doba expozice 50-60 d (ukončeno 7 dní po
posledním vylétnutí)
Hodnocené parametry: 20-denní přežívání a
váha (růst), vylétávání samiček a samečků
– poměr pohlaví, doba vylétávání, počet
nakladených vajíček, přežívání dospělců
Podobné
uspořádání jako
v 10-denním
testu
Celoživotní test - dle OECD #218/219
• provádí se v 600ml kádinkách
• sediment artificiální nebo přírodní
• voda - studniční, povrchová,
provozní, uměle připravená
• sediment : voda 1:4
• 20 ±2°C, 500 – 1000 lux, 16L : 8D
A. nylonová síťka
B. plastový kryt
C. kádinka bez zobáčku
D. otvory na výměnu vody
E. sediment
kontaminace: sedimentu
vody nad sedimentem
koncentrační řada: aspoň 5 koncentrací
f ≤ 2
kvalita vody - pH 6-9, rozpuštěný kyslík –
aspoň 60% ASV, změřit tvrdost a amoniak
vzdušnění – Pasteurovou pipetou (jemně)
Celoživotní test - dle OECD #218/219
• 1-4 dny staré larvy vysazujeme do sedimentu
• 20 jedinců/kádinka
• počet opakování: 3 - ECx; 4 - NOEC, LOEC
• krmení– tetrafinR, 0,25-0,5 mg/larva/den
• délka trvání – 28d (C.riparius)
Celoživotní test - dle OECD #218/219
Cílové parametry:
• procento líhnutí dospělců:
ER: procento líhnutí dospělců (emergence ratio)
na: počet jedinců vysazených do kádinky
ne: počet vylíhlých jedinců celkem (na konci pokusu)
Přijatelnost testu: ER kontroly >0,7
• střední čas vývoje: čas od vysazení do líhnutí
a
e
n
n
ER =
• střední rychlost vývoje:
x: střední rychlost vývoje v kádince
i: index intervalu mezi pozorováními
m: počet všech intervalů mezi pozorováními
fi: počet vylíhnutých jedinců během daného intervalu
ne: počet vylíhlých jedinců celkem (na konci pokusu)
xi: rychlost vývoje larev vylíhlých v intervalu i
deni: den pozorování (od začátku)
li: délka intervalu mezi pozorováními (obvykle 1 den)
e
ii
m
i n
xf
x ∑=
=
0
2/
1
ii
i
lden
x
−
=
ECx Regresní analýza
NOEC, LOEC ANOVA
Závislost citlivosti
na pohlaví
Chi-square
Procento
vylíhnutých
jedinců
Cochran-Armitage test, Fisher’s exact test, Mantel-Haentzal
test s Bonferroni-Holm úpravou p-hodnot, ANOVA (+arsin
transformace)
Projevy u bezobratlých:
Narušení reprodukce, rodivosti (fekundita)
Poruchy růstu, sexuálního dozrávání (maturace)
Narušení sexuálního dimorfismu, Intersex, Imposex
další procesy řízené hormony: pigmentace,
regenerace končetin, diapauza
Sagi et al. (2003) – Cherax quadricarinatus
Rudolphi (1999) – Samastacus spiniformis
Suzuki (1999)
– Armadillidium vulgare
?AG
Barki et al. (2003)
Jungmann et al. (2004)
- Gammarus fossarum
Endokrinní disrupce (ED) = narušení hormonální rovnováhy
organismů s potenciálními negativními následky pro celkovou
homeostázu, reprodukční, vývojové a behaviorálních funkce
SUBLETÁLNÍ TOXICITA
U VODNÍCH MĚKKÝŠŮ
- vodní měkkýši využíváni jako testovací organismy pro
vyhodnocení účinků endokrinních disruptorů ve vodním
prostředí
Test sedimentů s písečníkem novozélandským
Potamopyrgus antipodarum
- vhodný a efektivní nástroj pro testování přírodních
sedimentů a čistých látek
- finančně atraktivní varianta oproti
chemickým analýzám sedimentů
trvání 4 týdny (popř. 8 týdnů)
nádoba objem 1 l
médium 800 ml vody
expozice statická, 50 g sedimentu
odběry 20 jedinců po 4 (8) týdnech
parametry
mortalita; změny v morfologii pohl. orgánů;
počet embryí, poměr embryí bez ulity a s ulitou
+ nízké nároky na kultivace
- nedostatečná velikost pro biochemické
analýzy
Parametry
„Potamopyrgus sediment testu“
Příprava
Typy sedimentů
o přírodní
o artificiální
listová hrabanka + křemitý písek
o spajkovaný artificiální sediment
vyhodnocení efektů čistých látek
(1) spajkování artificiálního sedimentu.
(2) po odpaření solventu je přidáno medium
(3) ustavení rovnováhy mezi sedimentem a
vodou, po 4 dnech přidáni šneci .
1 2 3
2(3) dny
ve tmě
4 dny
Médium
- voda s přídavkem
NaHCO3, CaCO3
- 16°C,
700±100μS/cm
L:D 16:8
Komerční řasové
pelety
Expozice, vyhodnocení
Parametry: mortalita a počet plně vyvinutých a nezralých
embryí
(Xeno)estrogenní účinek
- ethinylestradiol, bisfenol A, octylfenol, nonylfenol
Xenoandrogenní účinek
- tributylcín, trifenylcín
Biomonitoring dnových sedimentů (Nisa, Odra)
Kontaktní Testy Toxicity – ovlivňující faktory
Faktory mimo kontaminace
• zrnitost sedimentů
• obsah a typ jílu
• obsah a charakter organického uhlíku
• struktura a vlastnosti huminových látek/organického materiálu
• pH
• obsah kyslíku
• toxicita amoniaku /sulfidů
• aktuální stav testovací populace
• výživa
Změny toxicity sedimentů díky vzorkování a experimentálnímu
postupu
– promíchání více kontaminovaných sedimentů s tenkou vrstvou na
rozhraní vody-sedimentů
– oxidace a precipitace redukovaných kovů díky provzdušňování
požadovanému v testu toxicity
Testy bioakumulace
• Kontaktní testy – celý sediment
• 28-56 dní expozice
• In-situ a/nebo Ex-situ testy pro zhodnocení příjmu
kontaminantů organismy
• Používány zejména na lokalitách kontaminovaných
bioakumulativními látkami (PAHs, PCBs, rtuť,
PCDDs/PCDFs, ...)
• Výsledky porovnávány s referenčními lokalitami a/nebo
povolenými limity
• Druhy: různonožec (Hyalella azteca), máloštětinatci
(Lumbriculus variegatus, nitěnka obecná)
In situ testy
• Klecování – měkkýši, ryby, další bezobratlí,
• Mortalita, zdravotní stav, příp. reprodukce a
specifické biomarkery v exponovaných
organismech
• Subletální biomarkery, histologie
Test subject: water
Test subject: sediment
Determination of
macrozoobenthos
saprobic index
functional feeding groups
life form index
evenness & diversity
Bioassays
toxicity, cytotoxicity
endocrine disrupting potential
genotoxicity, mutagenicity
Chemical analyses
organical analyses
limnochemical parameters
heavy metals
Ecosystem
native & concentrated surface water
whole sediment, sediment pore water, elutriate
and organic - extracts
... in vitro and in vivo
bioassays
Integrated assessment
of aquatic ecosystems
THE SEDIMENT QUALITY
“QUADRAD”
Bioaccumulation
Tests/Fish Tissue
Analysis
Sediment
Toxicity
Benthic Community
Survey
Sediment
Chemistry
Inovace tohoto předmětu je spolufinancována
Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem
České republiky