Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Experimentální design Klára Hilscherová RECETOX, Přírodovědecká fakulta MU Brno Typy empirických studií v ekotoxikologii • pozorovací studie - pozorování objektů a měření proměnných, bez pokusného zásahu • experimentální studie (intervenční studie) – studium účinků specifických pokusných zásahů, které nás zajímají. Můžeme kontrolovat prostředí pokusného zásahu, a držet na konstantní úrovni faktory, jejichž vliv nás momentálně nezajímá, ale které by mohly ovlivnit výsledky Vysoké náklady (na čas, materiál, práci, etické aspekty) – každý experiment by měl získat co možná nejvíce informací k zodpovězení studované otázky Základní etapy v experimentální práci • Stanovení cíle (přesně definovat otázku) • Výběr vhodné metody (technické řešení) • Vypracování projektu (kdy, kde, kdo, jak...) • Technická příprava studie (prostředky, protokoly) • Pilotní studie (proveditelnost, možná úskalí, N) • Modifikace projektu • Vlastní studie (protokoly a pracovní deník) • Vyhodnocování výsledků (statistika, vedlejší výsledky, interpretace výsledků) Toxikologické studie - dva základní cíle: 1. Zjistit, zda studovaný faktor (chemická látka) způsobuje nějaký účinek ve studovaném biologickém systému 2. Zjistit, jak je tento účinek velký/ významný Objekty zkoumání = experimentální jednotky - sledován vliv různých faktorů na experimentální jednotky pokusný zásah = kombinace specifické hodnoty všech faktorů, které mohou potenciálně odpověď ovlivňovat Experimentální design = protokol zahrnující kompletní plán experimentu i hodnocení dat Nezávislá proměnná Proměnná, která charakterizuje odpověď – reakci na podnět Závislá proměnná Proměnná, která je záměrně měněna experimentátorem (stimul, podnět) Sleduji vztah mezi testovanými faktory /nezávislé proměnné – např.koncentrace/ a proměnnými, které charakterizují účinek /závislé proměnné/ - odpověď v závislosti na působení toho faktoru Typy sledovaných parametrů: spojité diskrétní /mohou nabývat jen určitých hodnot, kategorií – např. pohlaví – žena/muž Základní požadavky experimentálního designu Reprezentativnost (zobecnitelnost výsledků) Homogenita souboru (zvyšuje sílu testu) Základní otázka: Co jsou cíle a hypotézy studie, jaké otázky chceme zodpovědět? Stanovení cílů studie (Objectives, Goals) – zjistit, zda….. Stanovení hypotézy • Hypotéza = tvrzení, domněnka, jejichž pravdivost se ověřuje pomocí experimentu • Jaké nové otázky mohou vyplynout z výsledků studie? Mohla by být ta studie uspořádaná tak, aby tyto otázky rovnou zodpověděla? • Nulová hypotéza = žádný rozdíl mezi kontrolami a pokusným zásahem • Alternativní /výzkumná/ hypotéza = pokusný zásah způsobuje významný rozdíl mezi skupinami • P menší než 0,05 = pravděpodobnost pravdivosti nulové hypotézy je menší než 5% zamítáme nulovou hypotézu, platí alternativní hypotéza hypotéza Nezávislá proměnná/ Nezávislé proměnné Závislá proměnná/ Závislé proměnné Pokud nezávislá proměnná + sloveso, pak závislá proměnná + sloveso. V Graf Základní principy experimentálního designu 1. Kontrola účinků vnějších /nestudovaných/ faktorů – kontrolní skupina 2. Náhodnost alokace organismů do pokusných a kontrolních skupin 3. Opakování a opakovatelnost • Pokud chci studovat vliv jednoho faktoru /jako koncentrace, doby expozice/ = nutno kontrolovat všechny další proměnné, které by mohly odpověď ovlivnit • jeden faktor jedna úroveň = vliv jedné koncentrace po určitém čase • většinou testováno několik úrovní sledovaného faktoru • Často stanovujeme vliv více faktorů současně = vícerozměrný design = vliv koncentrace na růst řas proměřovaný v čase, další parametry = intenzita záření, teplota Pokusné a kontrolní skupiny porovnání exponované a kontrolní skupiny ze stejné výchozí populace = stejné organismy /buňky/ za stejných podmínek, liší se jen expozicí vždy je nutno do pokusu zahrnout všechny adekvátní kontroly negativní a pozitivní kontroly • Negativní kontroly = blanky bez jakéhokoli zásahu = kontroly se slepým pokusným zásahem = všechny rozpouštědlové kontroly = pokud kombinace rozpouštědel - všechny kombinace Když opakované experimenty prokáží, že používané rozpouštědlo nemá v používané koncentraci žádný vliv na sledované parametry, je možno nadále používat pouze rozpouštědlovou kontrolu. • Pozitivní kontroly, Standardy • Pokusné zásahy = různé úrovně pokusného zásahu, různých testovaných faktorů = případně spárování kontrol a případů /párové testy jsou silnější/ Náhodná alokace organismů z populace do kontrolních a pokusných skupin – před zásahem všechny skupiny stejné = abychom se vyhnuli zkreslení výsledků kvůli rozdílnosti pokusných skupin. Opakování experimentu na větším počtu objektů ke snížení náhodného rozptylu výsledků • experimentální jednotky = jednotlivá opakování experimentu – např. ryby v sinicové expozici • opakování pokusného zásahu • pokud třikrát opakuji měření mikrocystinu nebo biomarkeru v hepatopankreatu ryby – je to pouze opakování stanovení (technické opakování) pro lepší přesnost a pro stanovení opakovatelnosti měření (nejsou nezávislé hodnoty), ale není to opakování pokusného zásahu Dostatečná velikost pokusného souboru závisí na: variabilitě sledované veličiny počtu sledovaných nezávislých faktorů technických možnostech požadované míře jistoty velikosti očekávaného efektu Pozor na příliš velké soubory! Opakování pokusného zásahu na dostatečném počtu experimentálních jednotek, který umožní odhalení systematického účinku počet opakování – pokud možno stejný ve všech skupinách stejný počet pozorování pro každou úroveň znaku Pro maximalizaci síly testu je třeba maximalizovat počet nezávislých opakování – Power analysis PRE-TESTY Analýza síly studie (power analysis) • Jak velký rozdíl chceme detekovat? • Jak velký rozptyl sledovaného parametru je v populaci? • Určení vhodné velikosti vzorku • Interpretace negativního výsledku studie • Umožňuje předem zvolit nebo zpětně kvantifikovat pravděpodobnost chyby II. druhu, tj. pravděpodobnost, že neodhalíme asociaci i když ve skutečnosti existuje. • Obvykle se považuje za rozumnou hodnota 80%. Součásti experimentálního designu I. Cíle studie – co chci zjistit a jak to chci zjistit Stanovení nulové hypotézy a alternativní /výzkumné/ hypotézy Jaký pokusný zásah, jaké faktory /nezávislé proměnné/, jejichž účinky na experimentální jednotky budou sledovány Jaké sledované parametry /závislé proměnné/, jejichž odpověď na různou úroveň testovaných faktorů budeme sledovat v jakých časech Přesné podmínky expozice Naplánování počtu opakování a jejich uspořádání v experimentu Součásti experimentálního designu II. KONTROLY - zařazení všech nezbytných kontrol /pre- test/ Úroveň studovaného pokusného zásahu – všech faktorů Expozice čistou chemickou látkou : koncentrace v zásobních roztocích a pak finální koncentrace v expozici /molární konc./ nutno znát rozpustnost ve vodě, nesmí být v testu překročena Standard /pozitivní kontrola/ - zahrnutí vhodných hodnot standardu Časový design experimentu – na více časových intervalech v závislosti na charakteru odpovědi, případně optimalizovat dobu expozice Součásti experimentálního designu III. Pokud není hodnocení provedeno přímo po ukončení expozice, určit jak připravit a uchovávat vzorky před analýzou, jak jsou vzorky/standardy/reagenty při daném uchovávání stabilní Optimalizovaná metodika měření sledovaných parametrů v odpovědi na expozici /optimalizace předem/ koncentrací reagentů množství vzorku doby a teploty inkubace podmínek měření apod. Vícefaktorové uspořádání: vliv koncentrace za různých světelných či tepelných podmínek při různých dobách expozice Jak budou získaná data hodnocena Nezbytnost a výhody experimentálního designu • důkladné promyšlení a naplánování experimentu • snadná návaznost dalších experimentů – přesně popsány všechny podmínky – pro navazující experimenty netřeba přepisovat, jen překopírovat, doplnit a zvýraznit změny • přehlednost, snadné dohledání důležitých informací • výborně využitelné i po delší době pro psaní publikací a pod. • snadné doplňování, zapisování změn – k designu je nutné doplnit krátký report o průběhu experimentu, pokud něco významného oproti designu – např. velká změna pH nebo teploty apod. • odkazem možno propojit design na soubor s výsledky Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky