Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
Návody k laboratorním úlohám
Ekotoxikologické biotesty cvičení (Bi-5620c)
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí - RECETOX
Přírodovědecká fakulta, Masarykova Univerzita
Brno, Česká Republika
2013
(modifikováno v březnu 2014)
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
1. Test s chvostoskokem Folsomia candida
Zpracováno podle normy ISO 11267 (1999)
Cílem úlohy je naučit se postup půdního biotestu, který hodnotí efekty na přežívání a
reprodukci chvostoskoka Folsomia candida. Tento biotest lze použít pro hodnocení ekotoxicity
chemických látek (pesticidy, hnojiva), reálně kontaminovaných půd, vytěžených sedimentů a hlušiny,
kalů z čistíren odpadních vod, odpadů, sutí a drtí a dalších pevných matric.
1.1. Princip testu
Synchronizovaná kultura chvostoskoků F. candida je exponována po dobu 28 dnů testované
látce (kadmium) v artificiální půdě. Na konci testu se hodnotí mortalita dospělých jedinců a
reprodukce.
1.2. Přístroje a chemikálie
- synchronní kultura chvostoskoků
- artificiální půda s pH 6 ± 0.5 a ovlhčená na 50% WHC ve variantě bez kadmia - kontrola a ve
variantě s 800 mg/kg kadmia)
- skleničky na testy (cca 150 mL), folie, gumičky
- sušené kvasnice, exhaustor, štěteček, miska s mřížkou na vyhodnocování testu
- inkoust
- váhy s přesností na 0.1 g
- inkubační místnost nebo termostat
- běžné laboratorní sklo a pomůcky – kádinky, filtrační papír, papírové ubrousky, lžičky,
pasteurky, fixy, nůžky, střičky s vodou, pryžové rukavice, laboratorní pláště
1.3. Podmínky testu
1.4. Příprava experimentu
1.4.1. Založení chovu
Kultura chvostoskoků F. candida se chová v plastových krabičkách nebo na Petriho miskách
na směsi aktivního uhlí a sádry. Sádra a aktivní uhlí se smíchá v poměru cca 9 :1. Do misky se nalije
trochu vody a přidá mix aktivního uhlí a sádry tak, aby se vytvořila na dně souvislá vrstva. Připravené
misky se nechají několik hodin zaschnout. Do substrátu se vytvoří ostrým předmětem několik rýh
(pro kladení vajíček). Doprostřed misky se pak přidá špetka sušených kvasnic (droždí) a ovlhčí
destilovanou vodou. Ze starších chovů se přidá na misku pomocí exhaustoru cca 40 středně velkých
chvostoskoků. Miska se dobře uzavře a popíše. Chov se uchovává při 20 ± 2 °C. Chov je nutné kvůli
pevně uzavřeným nádobám větrat jednou týdně, kdy se také kontroluje vlhkost substrátu a přidává
špetka kvasnic. Optimální vlhkost se pozná tak, že černý substrát je lehce matný ne lesklý a po
pokapání vodou se tato pomalu vsakuje.
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
1.4.2. Synchronizace chovů
Do testů se používají 10 - 12 dní staří juvenilní chvostoskoci. Na nový substrát (sádra s
aktivním uhlím v poměru 9:1) přemístíme pomocí dechového exhaustoru větší jedince (= založení
synchronizace). Přemístění chvostoskoků na nový substrát obvykle spouští ovipozici. Po 2 dnech
dospělé jedince odstraníme a v kultivační nádobě zůstávají jen vajíčka (zkontrolujeme pod
binokulárem). Počkáme na vylíhnutí vajíček a poté, co se objeví první juvenilové, odpočítáme 10 –
12 dní.
1.4.3. Příprava artificiální půdy
Artificiální půda dle norem OECD a ISO má složení:
• 10% vysušená rašelina přesátá a homogenizovaná přes 2 mm síto
• 20% kaolinový jíl s obsahem kaolinitu minimálně 30%
• 70% křemenný písek s minimálně 50% zrn 0.05 – 0.2 mm
• CaCO3 se přidává tak, aby výsledné pH (KCl) bylo 6 ± 0.5
1.4.4. Maximální vodní kapilární kapacita půdy
Maximální vodní kapilární kapacita půdy (WHCmax dle angl. Maximum Water Holding
Capacity) je stav, kdy je půda schopna v přirozeném uložení udržet v kapilárních pórech největší
množství vody. Vyjadřuje se v jednotkách objemu vody na gram suché zeminy. Procentuální
vyjádření WHC znamená kolik procent nasycení půdy vodou - maximální WHCmax (100% WHC) - je
požadováno. Vlhkost artificiální půdy do testu s chvostoskoky je ideální cca 50% WHC.
1.5. Postup testu
1.5.1. Založení testu:
• Do skleněných nádobek na test navažte po 30 g půdy (2 opakování od každé koncentrace i
kontroly).
• Na povrch půdy dejte špetku kvasnic.
• Ze synchronizovaného chovu pomocí exhaustoru odeberte 10 juvenilů (dávejte pozor na
správný počet!) a vyklepte je do testovací nádobky s půdou.
• Nádoby uzavřete víčky a poté zvažte.
• Nádoby umístěte do inkubační místnosti (teplota 20 ± 2 °C).
• Každý týden nádoby zvažte a porovnejte váhu s původní. V případě úbytku váhy doplňte
vodu.
• Každý týden dosypte špetku kvasic.
1.5.2. Vyhodnocení testu:
• Po 28 dnech vyhodnoťte mortalitu a reprodukci pomocí flotační metody.
• Do testovací nádobky nalijte vodu z kohoutku a opatrně promíchejte do rovnoměrné suspenze
pomocí štětečku.
• Poté beze zbytku přelijte suspensi do počítací nádoby (zbytky půdy můžete vypláchnout
několikerým vymytím vodou).
• K suspenzi kápněte pár kapek inkoustu a opět opatrně zamíchejte štětečkem.
• Počítací misku vložte do fotografické komory a vyfoťte vodní hladinu digitálním
fotoaparátem.
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
• Natavení foťáku: po zapnutí nastavte focení na auto, v přední části foťáku zmáčkněte tlačítko
pro makro (symbol kytičky) a fotografování bez blesku (symbol přeškrtnutého blesku).
• Na fotkách spočítejte počet dospělců a juvenilů.
1.6. Protokol
1.7. Ověření testu, platnost
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
2. Test inhibice růstu zelené řasy Raphidocelis
subcapitata
Zpracováno podle normy OECD 201 (ISO 8692) a české technické normy TNV 757741.
2.1. Princip
Odpověď organismu (inhibice/stimulace růstu) po expozici dané koncentraci látky je
porovnávána s průměrným růstem kontroly.
Test byl optimalizován pro provedení v 96-ti jamkových mikrotitračních destičkách.
Exponovaným organismem je zelená řasa Raphidocelis subcapitata (Syn. Selenastrum subcapitata,
Pseudokirchneriella subcapitata). Vybrané koncentrace sledované látky jsou testovány vždy v 5
opakováních. V experimentu stanovujeme růst řas jako změnu optické density řasové suspenze na
konci a začátku experimentu. Optická densita (absorbance 680nm) koreluje s počtem buněk na mL a
měříme ji pomocí spektrofotometru, je tedy dobrým a jednoduchým zástupným parametrem
k rychlému stanovení růstu řas v testovém systému.
2.2. Přístroje a chemikálie
- řasová kultura o dostatečné hustotě buněk na mL - kultivovaná ve standardním médiu (50%
ZBB médium)
- 96-jamkové mikrotitrační desky, automatické pipety, špičky k pipetám, nádoby pro vyředění
odpovídajících koncentrací testované látky
- destilovaná voda, nesterilní 200% ZBB médium
- dichroman draselný – pozitivní kontrola
2.3. Podmínky testu
- doba expozice: 3 dny (72h)
- interval měření: založení testu 0h, po 24, 48, 72 hodinách expozice
- teplota 23˚C
- osvětlení 2080 lux (použití klasické halogenové zářivky a zářivky Aqua Glo fialová, 40W)
2.4. Příprava experimentu a pracovní postup:
2.4.1. Příprava média
Řasy se kultivují v 50% ZBB médiu, jde o optimalizovanou směs živin a minerálů vhodnou
pro kultivaci řas a sinic (přesné složení bude diskutováno na cvičení). Stejné médium se užívá i pro
expozice řas v testu toxicity. K dispozici budete mít koncentrát – 200% ZBB médium, z tohoto
koncentrátu je potřeba naředit dostatečné množství 50% ZBB média pro experiment.
2.4.2. Příprava inokula řas – řasové suspenze
Řasové inokulum (=koncentrovaná řasová suspenze odebraná z laboratorní kultury)
odebereme sterilně ze zásobní kultury v kultivační laboratoři. Potom řasové inokulum vyředíme
kultivačním médiem (50% ZBB) na požadovanou hodnotu buněk na mL a odpovídající objem.
Výchozí množství buněk/mL na začátku experimentu by mělo být cca 400 000 (přibližně odpovídá
optická hustota v rozmezí 0,03-0,04 při 680 nm). Počty buněk na mL zjistíme pomocí měření na
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
spektrofotometru a výpočtu s užitím rovnice kalibrační křivky (viz níže). Obvykle řasy do testu ředíme
faktorem 4 (tedy 1:3).
Určení počtu buněk/mL v zakoncentrované řasové suspenzi – řasovém inokulu:
Měření optické density provedeme na čisté mikrodesce. Do 3 sousedících jamek napipetujeme
250 uL 50% ZBB média (blank) a do dalších 3 sousedících jamek napipetujeme 250uL koncentrované
řasové suspenze. Proměříme absorbanci (680nm) a naměřené údaje použijeme pro výpočet ředicího
faktoru. Ředicí faktor vypočteme pomocí jednoduché lineární kalibrační rovnice (závislost optické
density na počtu buněk na mL). Při měření na spektrofotometru postupujte dle instrukcí cvičícího.
Obr.1: Kalibrační křivka pro závislost absorbance na počtu buněk v řasové suspenzi
2.4.3. Příprava koncentrační řady testované látky a pozitivní kontroly
Pro přípravu koncentrační řady testované látky je důležité si nejprve uvědomit:
1. Jaký objem směsi řas+média+testované látky budu potřebovat pro 5 opakování, jaký objem
pro negativní kontrolu/ pozitivní kontrolu? Vždy je dobré uvažovat i nějakou rezervu!
2. Jaký ředicí faktor (DF – dilution factor) je mezi jednotlivými koncentracemi?
3. Jaké negativní kontroly je třeba zahrnout do experimentu (je látka rozpuštěna ve vodě nebo
v organ. rozpouštědle)?
Objem vzorku přidávaný do nejvyšší koncentrace C1 (max) závisí na koncentraci zásobního
roztoku a cílové koncentraci v testu. Objem přidávaného vzorku by však neměl přesáhnout 1%
cílového objemu ve vialce C1, aby nedošlo k naředění řas a média. V případě přidávání vzorku
v organickém rozpouštědle je nejvyšší přípustný objem přidávaného vzorku 0.5% cílového objemu ve
vialce C1 (v/v). V některých případech je tedy nutné koncentraci zásobního roztoku adekvátně upravit.
Testovanou látku přidáváme ke správně vyředěné řasové suspenzi (viz 2.4.2.), tak abychom
získali potřebnou nejvyšší testovanou koncentraci látky. Dále pak pokračujeme postupným ředěním
k nejnižší koncentraci. V každém kroku je nutné směs řas a testované látky důkladně promíchat –
krouživým pohybem i pipetou. Pozor – řasy mají tendenci sesedat, míchání je opravdu důležité!
y = 7E-08x - 0.0188
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 5000000 10000000 15000000 20000000
absorbance
Počty buněk/mL
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
Jednotlivé koncentrační varianty si připravíme ve skleněných vialkách, z těch budeme pipetovat na
desku do jamek dle schématu.
- Do jedné jamky na desce se pipetuje 250 uL.
- Pro 5 jamek + rezerva 1400 uL.
Schéma postupného ředění vzorku:
Doporučené uspořádání koncentračních variant testované látky a kontrol na 96-jamkové desce:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A blank = dH2O
B C min C max NC PC min PC PC PC max
C C min C max NC
D C min C max NC
E NC/SC NC/SC NC/SC NC/SC NC/SC NC NC/SC NC/SC NC/SC NC/SC
F C min C max NC
G C min C max NC
H
NC = negativní kontrola
SC = rozpouštědlová kontrola (solvent control)
PC = pozitivní kontrola (dichroman draselný 1.25-2.5-5-10 mg/L)
C min = nejnižší koncentrace testované látky
C max = nejvyšší koncentrace testované látky
Obdobně jako u testované látky postupujeme při přípravě 4-bodové koncentrační řady
pozitivní kontroly – dichromanu draselného. Cílové koncentrace jsou 1.25-2.5-5-10 mg/L (DF 2) a
koncentrace zásobního roztoku je 2 g/L. Dichroman draselný je rozpuštěný ve vodě.
C1(max) C2 C3 C4 C5(min)
Zásobní roztok
vzorku ve vodě
(nebo solventu) Řasová
suspenze cca
4.105
buněk/mL
Řasová
suspenze cca
4.105
buněk/mL
(+solvent)
Řasová
suspenze cca
4.105
buněk/mL
(+solvent)
Řasová
suspenze cca
4.105
buněk/mL
(+solvent)
Řasová
suspenze cca
4.105
buněk/mL
(+solvent)
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
2.4.4. Měření absorbance
Absorbanci měříme při vlnové délce 680 nm. Před každým měřením je nutné jednotlivé
jamky promíchat multikanálovou pipetou !!!!
Získaný soubor (ve formátu MS-Excel) uložte na pevný disk počítače do adresáře
"C:/biotesty_cviceni_2014 ve formátu datum_latka_casovy interval (např: 140310_carbofuran_0h;
140311_carbofuran_24h; atd.)
2.4.5. Expozice
Mikrodestičku přikryjeme víčkem a exponujeme v inkubační místnosti s řízeným světelným
režimem.
• Doba expozice: 3 dny
• Interval měření: 0h, 24h, 48h, 72h
• Podmínky expozice: teplota 23°C, osvětlení 2080 lx (použití klasické halogenové zářivky a
zářivky Aqua Glo fialová, 40W)
2.5. Vyhodnocení
Výsledkem testu toxicity na řasách jsou dva endpointy – inhibice růstové rychlosti a inhibice
výtěžku. Vyhodnocení výsledků experimentu provádíme v programech MS Excel a GraphPad Prism.
V MS Excel provedeme první výpočty.
1. Od každé naměřené hodnoty vzorku/kontroly odečteme průměrnou absorbanci blanku (destil.
voda v okrajových jamkách).
2. Pro každou koncentrační variantu/kontrolu vypočteme průměr, směrodatnou odchylku a
koeficient variance
3. Vyloučíme případné odlehlé hodnoty (CV>10%)
4. Endpoint – INHIBICE RŮSTOVÉ RYCHLOSTI (Growth rate inhibition):
Z upravených hodnot vypočítáme růstovou rychlost dle vzorce:
ln ODkonec – ln ODstart
µ = ------------------------------
tkonec – tstart
kde:
µ průměrná specifická růstová rychlost v čase 0-x (dny);
tstart časový začátek expozice (0 den);
tkonec časový interval měření (x-tý den);
ODstart absorbance (po odečtení blanku) v čase 0 (dny);
ODkonec absorbance (po odečtení blanku) v čase x (dny);
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
Hodnoty růstové rychlosti použijeme pro výpočet inhibice růstu dle vzorce:
µ K - µ v
%I = ----------- * 100
µ K
kde:
µ K - průměr specifické růstové rychlosti kontroly
µ v - průměr specifické růstové rychlosti jednotlivých
variant koncentrací toxikantu
%I - procento inhibice způsobené v dané koncentrační
variantě
Pro kontrolu validity testu je třeba spočítat růstovou rychlost v každém časovém intervalu (0-
24; 24-48;48-72) – růstová rychlost kontroly by se měla pohybovat v intervalu 0.4-1.
5. Endpoint – INHIBICE VÝTĚZKU (Yield inhibition):
Z upravených hodnot vypočítáme výtěžek biomasy dle vzorce:
Y = ODkonec-ODstart
kde:
ODstart - absorbance (po odečtení blanku) v čase 0 (dny);
ODkonec - absorbance (po odečtení blanku) v čase x (dny);
Dále vypočítáme inhibici výtěžku biomasy dle vzorce:
Y K - Y v
%I = ------------- * 100
YK
kde:
Yk - výtěžek kontroly
Yv - výtěžek jednotlivých variant koncentrací toxikantu
6. Výpočet účinných koncentrací:
Výsledné hodnoty inhibice růstové rychlosti a výtěžku biomasy vložte vždy k odpovídajícímu
logaritmu koncentrace do softwaru GraphPad PRISM, a vypočtěte hodnoty IC50, IC20,
NOEC a LOEC pro oba endpointy. Stejný výpočet proveďte pro pozitivní kontrolu –
dichroman draselný. Při výpočtu postupujte dle instrukcí získaných na úvodní hodině – Dr.
Jiří Novák.
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
7. V MS Excel sestrojte graf závislosti inhibice růstové rychlosti a výtěžku biomasy na
koncentraci toxikantu a obdobný graf s pozitivní kontrolou – dichromanem draselným.
V grafu zobrazte variabilitu vašich výsledků vyznačením směrodatné odchylky.
2.6. Ověření citlivosti
Zkouška se považuje za platnou, pokud se EC50 způsobena referenčním roztokem (dichroman
draselný- pozitivní kontrola) pohybuje v rozmezí 0.8-1.2 mg/L.
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
3. Zkouška inhibice luminiscence emitované
mořskými bakteriemi Vibrio fischeri
Zpracováno podle ISO 14735 (2005)
Jedná se o rychlý, jednoduchý a levný test akutní toxicity na prokaryotickém organismu, který
slouží ke sledování toxických účinků nejen čistých chemických látek či jejich roztoků, ale i
environmentálních směsí extrahovaných z různých vzorků. Tato metoda je méně vhodná pro silně
zabarvené vzorky nebo vzorky obsahující nerozpuštěné látky nebo látky, které reagují s živným
roztokem nebo podléhají změnám během zkoušky (například vysrážení, biochemickému nebo
fotochemickému rozkladu), a tím mohou poskytovat nesprávné výsledky, popřípadě zhoršit
reprodukovatelnost.
3.1. Princip
Testovacím organismem v testu je mořská bakterie Vibrio fischeri, která za optimálních
podmínek intenzivně luminuje (světélkuje). Test je založen na zhášení bioluminiscence této bakterie,
je-li ve vzorku přítomna biodostupná toxická látka, která může metabolickou aktivitu bakterií
významně snížit, případně zastavit. To se ihned projeví poklesem intenzity luminiscence
(bioluminiscence). Množství emitovaného světla se měří luminometrem před a po přidání testované
látky (po 15 a 30 minutách expozice). Teplota v průběhu testu musí být konstantní (t = 15°C).
3.2. Přístroje a chemikálie
- Cirkulační termostat s možností temperace na 15°C
- Chlazený luminometr,
- Automatické pipety 5 – 50 μl, 50 – 200 μl, 200 – 1000 μl, 1000 – 5000 μl, špičky,
- NaCl
- Modelový toxikant - dichroman draselný (K2Cr2O7) – pozitivní kontrola
3.3. Podmínky testu
- teplota: 15o
C
- délka expozice 15 a 30 min.
3.4. Příprava experimentu a pracovní postup
3.4.1. Příprava bakteriální suspenze Vibrio fischeri pro test:
Bakterie je nutné připravit ve dvou, na sebe navazujících krocích:
1. Ampulku s lyofilizovanou kulturou vyjmeme z mrazícího boxu a do ampulky napipetujeme
0.5 mL rekonstitučního roztoku dodávaného společně s bakteriemi. Třepáním rozpustíme
lyofilizované bakterie v roztoku a po rozpuštění bakterií je pomocí pipety provzdušníme.
Takto připravenou ampulku necháme inkubovat na ledu v lednici min 30 minut.
2. Po uplynutí 30 minut je možné rehydratované bakterie rozředit pro test. 100 µL
rehydratované suspenze napipetujeme do 4 mL roztoku 2% NaCl ve zkumavce (je také
možné použít výrobcem dodávaný rekonstituční roztok z plastové nádobky). Použití
výrobcem dodávaného roztoku je žádoucí, je li k dispozici, jelikož dosažené luminiscence jsou
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
vyšší. Takto naředěné bakterie pak ponecháme inkubovat v suché lázni při teplotě 15°C po
dobu minimálně 15, ale spíše 30 minut.
3.4.2. Příprava koncentrační řady testované látky a pozitivní kontroly
Připravíme si dvě 96-jamkové desky. Jednu průhlednou - v ní se bude připravovat ředící řada a
jednu bílou - ta bude nakonec měřena.
Předem je nutné si rozmyslet rozložení vzorků na desce a podle toho začít s její přípravou.
Níže popsaný postup je platný pro ředění vzorků pomocí dvojkové ředící řady. V případě potřeby
jiného stupně ředění je třeba příslušně upravit pipetované objemy do jednotlivých jamek. V tomto
případě pamatujeme na výsledný objem vzorku v jamce. Ředění probíhá přímo v desce postupným
přepipetováváním určitého objemu z jedné jamky do druhé.
Test se provádí v duplikátu (je samozřejmě možné použít i jiný počet replikátů) – ve cvičeních
budeme každou koncentraci testovat v 5 opakováních (využijeme pouze polovinu desky).
Tab. 1: Možná podoba napipetované desky se vzorky:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
a neg c neg c pos. C pos.c neg c neg c neg c neg c neg c neg c neg c neg c
b C0 C0 C1 C1 C2 C2 C3 C3 C4 C4 neg c neg c
c C0 C0 C1 C1 C2 C2 C3 C3 C4 C4 neg c neg c
d C0 C0 C1 C1 C2 C2 C3 C3 C4 C4 neg c neg c
e C0 C0 C1 C1 C2 C2 C3 C3 C4 C4 neg c neg c
f C0 C0 C1 C1 C2 C2 C3 C3 C4 C4 neg c neg c
g C0 C0 C1 C1 C2 C2 C3 C3 C4 C4 neg c neg c
h neg c neg c pos.c pos.c neg c neg c neg c neg c neg c neg c neg c neg c
Neg c- negativní kontrola (2% roztok NaCl)
Pos c- pozitivní kontrola (standardně se používá roztok dichromanu draselného v koncentraci EC 50-
53 mg/l - 18,7 mg/l CrVI+
)
C 0- C4- koncentrace vzorků
Pozn. Je nutné mít na desce alespoň 2 duplikáty negativní kontroly. Lepší však je mít dvě jamky na
každém řádku a pro každý řádek s nimi počítat pro výpočet korekčního faktoru pro daný řádek.
Na každém řádku může být koncentrační řada jednoho vzorku nebo může být vzorek naředěn do více
řádků, je-li to potřeba (hodně toxický vzorek).
Do jamek 1 a 2 napipetujeme výchozí koncentraci testovaného vzorku. Následující krok je poté
závislý na charakteru vzorku:
1. Roztok vzorku neobsahuje sůl (NaCl)- v tomto případě je nutné do vzorku přidat slaný roztok,
aby výsledná koncentrace NaCl byla přibližně 2% (kvůli osmotické rovnováze-). K tomuto
účelu se používá prakticky nasycený roztok soli (32 %) - aby se vzorek co nejméně naředil. V
tomto případě se do jamky napipetuje 280 µL vzorku a přidá se 20µL koncentrovaného
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
slaného roztoku. Výsledný objem v jamce je tedy 300 µL. Pamatujte, že tímto se vzorky
naředí- nutno zohlednit ve výpočtech!
2. Testovaný vzorek byl přímo připraven za pomoci 2 % roztoku NaCl (týká se látek, které jsou
k dispozici v sypkém nebo suchém stavu a před měřením se připravuje roztok). V tomto
případě se do prvních jamek napipetuje přímo 300µLvzorku.
Do ostatních jamek na desce se napipetuje 150 µL 2% roztoku NaCl. Tento roztok se
použije i jako negativní kontrola.
Stejně jako u vzorku postupujeme u pozitivní kontroly (K2Cr2O7, c= 53 mg/l)
Po tomto kroku máme v prvních dvou sloupečcích napipetovány vzorky a ve všech ostatních
jamkách máme 150 µL ředícího roztoku (2 % NaCl).
Následně pomocí pipety přímo na mikrodesce připravíme koncentrační řadu testovaného
vzorku tak, že z prvních dvou jamek pipetujeme vždy 150 µL do následujících jamek. K tomuto kroku
je možné použít miltikanálovou pipetu, pomocí které je možné napipetovat všechny duplikáty
(multiplikáty) najednou.
Důležité: Nezapomeňte, že na desce musí zůstat jamky s negativní kontrolou, bez vzorku. A
také na to, že je nutné při posledním ředění vzorku nevracet kapalinu z pipety zpět do jamek, ale
vypustit ji jinam. Pokud by se napipetovaný objem v pipetě vrátil zpět do jamek, tak by v těchto
jamkách byl dvojnásobný objem roztoku.
(Environmentální vzorky se zkoušejí co nejdříve po odběru či přípravě. Vzorek se důkladně
protřepe a je-li to nutné, homogenizuje. Vzorek by měl být upraven na pH 7,4 ± 0,3)
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
Obr. 1: Schéma přípravy dvojkové koncentrační řady pipetováním (2 opakování paralelně).
Takto připravenou desku dáme temperovat na 15°C po dobu 30 minut.
Před uplynutím této doby si připravíme druhou (bílou) desku a do ní napipetujeme 30 µL suspenze
bakterií (byla připravena a naředěna dříve – viz bod 2.4.1).
Nyní máme připraveny všechno potřebné a můžeme začít s měřením desky.
3.4.3. Expozice a měření luminiscence
Použijeme destičkový luminometr Biotech synergy TM umístěný v chladící skříni
v přístrojové laboratoři.
Přístroj se ovládá pomocí počítačového programu Gen 5
Otevřeme testový protokol mikrotox.prt (ve složce experiment) a umístíme desku na rámeček
luminometru. Program spustíme klikem na tlačítko READ. Software nás vyzve k uložení měření. Po
uložení a odsouhlasení kontrolních oken deska zajede do přístroje a změří se počáteční luminiscence
bakterií. Až je změřena každá jamka, deska znovu vyjede z přístroje a na obrazovce se objeví okno
„napipetujte vzorek“ (Obr. 2). Pomocí multikanálové pipety napipetujeme 120 µL vzorků
z průhledné desky do bílé desky k bakteriím. Dáváme přitom pozor, abychom vzorky nějak na desce
neposunuli a tím jsme nezměnili výsledky. Pokud budeme při přepipetovávání vzorků postupovat od
negativních kontrol a nejzředěnějších roztoků k nejvyšším koncentracím, není potřeba měnit špičky.
Po napipetování vzorků umístíme bílou desku zpět na Carrar přístroje a odklikneme tabulku.
Měření automaticky pokračuje po dobu 30- ti minut.
Po třiceti minutách deska vyjede z přístroje a pomocí nástoje Power export (obr. 2) si necháme
výsledné luminiscence vyexportovat do Excelu.
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
Získaná data poté vyhodnotíme, spočítáme výsledné inhibice a EC 50. Je vhodné z korekčních faktorů
negativních kontrol udělat průměr a ten dosazovat do vzorce inhibice luminiscence (viz 3.5).
Pozn: Nezapomeňte, že se vzorky v průběhu přípravy desky naředily. První ředění nastalo, pokud byl
ke vzorkům přidán koncentrovaný solný roztok na ustanovení správné slanosti, a podruhé tím, že byly
všechny jamky rozředěny bakteriemi. Je proto nutné, přesně spočítat koncentrace v jednotlivých
jamkách, které byly testovány - nikoli pouze napipetované koncentrace, jelikož ty se změnily a
ovlivnily by výslednou hodnotu EC.
Obr. 2: Výřez obrazovky při měření přístroje. Můžete vidět výše popsané ikony a okno vyzývající
k napipetování vzorků z jedné desky do druhé.
3.5. Výpočty
Nejdříve vypočítáme koeficienty přirozeného vyhasínání bioluminiscence pro jednotlivé časy:
Rt = IKt / IK0
Kde:
Rt je koeficient přirozeného vyhasínání v čase t
IKt je intenzita bioluminiscence u kontroly v čase t
IK0 je intenzita bioluminiscence u kontroly v čase 0
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
Ke kvantitativnímu vyhodnocení se vypočte procentuální úbytek světla (inhibici luminiscence):
Inh% = (Rt . I0- It) / (Rt. I0) . 100
Kde:
Rt je koeficient přirozeného vyhasínání v čase t
I0 je bioluminiscence v čase 0
It je naměřená bioluminiscence v čase t
Výpočet EC50 se provádí z křivky dávka-odpověď. K výpočtu doporučujeme použít program
GraphPad Prism, s jehož obsluhou jste byli seznámeni v předchozích hodinách.
3.6. Ověření citlivosti
Zkouška se považuje za platnou, pokud jsou splněny následující podmínky:
• Koeficient přirozeného vyhasínání Rt se pohybuje v rozmezí 0,6-1,8
• Referenční roztoky (všechny tři pro zásobní kulturu nebo pouze dichroman draselný pro každý
test) způsobují 20-80% inhibici po 30 minutách pro následující koncentrace standardních
látek:
3,4mg/L 3,5-Dichlorphenol
2,2 mg/L Zn (II)9,67 mg/L ZnSO4.7H2O
18,7 mg/L Cr (VI) = 52,9 mg/L K2Cr2O7
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
4. Zkouška inhibice pohyblivosti Daphnia magna
Straus (Cladocera, Crustacea) – Zkouška akutní
toxicity
Zpracováno podle ČSN ISO 6341
Metoda stanovení akutní toxicity chemických látek, průmyslových odpadních vod a
povrchových nebo podzemních vod pro Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea).
4.1. Princip
Zkouška je založena na určení koncentrace látky, která za 24 (48) hodin imobilizuje 50%
jedinců Daphnia magna vystavených podmínkám testu.
4.2. Přístroje a chemikálie
- automatická pipeta + špičky
- plastová kapátka
- testovací destička (30 jamek, objem jamky 10 mL)
- kádinky
- odměrný válec
- chemikálie na přípravu média - chlorid draselný KCl, hydrogenuhličitan sodný NaHCO3,
chlorid vápenatý CaCl2, síran hořečnatý MgSO4
- pozitivní kontrola - dichroman draselný K2Cr2O7
4.3. Podmínky testu
- teplota: 20 ± 2 ºC
- délka expozice 24hod (48 hod.)
- fotoperioda 16h světla/8 h tmy
4.4. Příprava experimentu a pracovní postup
4.4.1. Příprava média
Nejprve je třeba připravit dostatečné množství média pro všechny kroky postupu experimentu.
Zásobní roztoky:
8,88g CaCl2 se rozpustí v 1L destilované vody
4,93g MgSO4 se rozpustí v 1L destilované vody
2,59g NaHCO3 se rozpustí v 1L destilované vody
0,23g KCl se rozpustí v 1L destilované vody
- na 1L média se dávkuje 25 mL z každého zásobního roztoku, do odměrné baňky 1L se nalije
část destilované vody, přidají se zásobní roztoky a doplní se destilovaná voda
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
- aerací se roztok nasytí kyslíkem (koncentrace kyslíku by neměla klesnout pod 7 mg/L) a
zkontroluje se pH (7,8±0,2)
(... zásobní roztoky budete mít k dispozici)
4.4.2. Příprava organismů na test
Do experimentu se nasazují jednodenní juvenilové, proto je potřeba 1 den před založením
experimentu vyčlenit do speciální nádoby – kádinky (0.5L) s médiem několik gravidních samic. Toto
přenesení samic do oddělené nádoby je impulsem k rození mláďat.
4.4.3. Příprava koncentrační řady testované látky
Ředicí řadu testované látky (5 konc. bodů) připravíme v dostatečném objemu ve skleněných
kádinkách. Látku postupně ředíme v médiu a přidáváme-li látku (vzorek) v jiném rozpouštědle než ve
vodě, tak je nutné dbát na to, aby ve všech testových variantách byla stejná koncentrace rozpouštědla,
maximálně však 0.5% v/v. Z kádinek potom napipetujeme po 10mL do každé testové jamky na
plastové testové desce dle doporučeného schématu. Na každou koncentraci připadá 5 opakování,
přičemž první jamka v řadě slouží jako jamka na oplach.
Jako pozitivní kontrola se používá standardní toxikant dichroman draselný (3,2 – 1,6 – 0,8 –
0,4 – 0,2 mg/L).
(... desku s pozitivní kontrolou založí cvičící)
4.4.4. Nasazení organismů do testu
Do jamky na oplach přeneseme kapátkem 20 jedinců z nádoby s juvenily a poté přenášíme po
5 jedincích do jednotlivých testových jamek. Tímto zabráníme nežádoucímu naředění testované látky
při manipulaci s kapátkem.
Schéma desky:
A B C D
NC NC/SC NC/SC NC/SC NC/SC NC/SC
1 C min C min C min C min C min
2
3
4
5 C max C max C max C max C max
jamky na
oplach
testové
jamky
4.4.5. Expozice a vyhodnocení imobilizace
Desku s dafniemi necháme exponovat v kultivační laboratoři při teplotě 20 ± 2 ºC a
světelném režimu 16h světlo/8h tma.
Na konci zkušební doby 24h (48h) se spočítají mobilní jedinci v každé nádobě. Jedinci, kteří
nebudou schopni se rozplavat za 15 s po mírném zamíchání roztoku, se považují za imobilizované, i
kdyby dosud pohybovali tykadly.
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, Kamenice 753/5, Pavilon A29, 625 00 Brno
Výsledky včetně jakýchkoli anomálií v chování dafnií si zaznamenáme.
4.5. Vyhodnocení výsledků a výpočty
Výsledky zaznamenáme do Excelu a jednoduchým výpočtem určíme % imobilizace
v jednotlivých opakování. Pomocí softwaru Graphpad Prism stanovíme účinné koncentrace
EC20, EC50, NOEC a LOEC.
x
%I = ------- *100
5
Kde:
x je počet imobilizovaných jedinců
4.6. Platnost zkoušky
Zkouška se považuje za platnou, pokud jsou splněny následující podmínky:
- mortalita v kontrole na konci zkoušky je ≤ 10%
- 24h- EC50 pro dichroman draselný je v rozsahu 0,6-1,7 mg/L