1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg Adobe Systems logo_mu_cerne.gif Inovace tohoto předmětu byla spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Bi6420 Ekotoxikologie mikroorganismů https://is.muni.cz/el/1431/jaro2014/Bi6420/index.qwarp Doc. RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. hofman@recetox.muni.cz jaro 2014 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg Adobe Systems logo_mu_cerne.gif Inovace tohoto předmětu byla spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Bi6420: Ekotoxikologie mikroorganismů Část 1: Úvod O čem je ekotoxikologie Mikroorganismy (připomenutí) Mikroorganismy v ŽP Ekotoxikologie MO jako obor 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg O čem je ekotoxikologie 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif O čem je ekotoxikologie? •Věda studující toxické efekty a efekty chemického (i ostatního stresu) v přírodě, u přírodních organismů (EKO…), zejména efekty v populacích a společenstvech (EKO…), někdy zahrnuje i efekty na člověka (!) •Interdisciplinární vědní obor kombinující poznatky věd studujících ekosystémy (EKOlogie) a vědy studující interakce chemických látek s organismy (toxikologie) •Hlavní cíle ekotoxikologie •poznání interakcí mezi živými organismy a chemickými/toxickými látkami v prostředí na všech úrovních •využití poznatků pro racionální ochranu živých organismů, jejich populací, společenstev a ekosystémů před chemickým znečištěním •prakticky: odpovídat na otázky, jaká expozice vyvolá jaký efekt ? è hodnocení ekologických rizik (PEC/PNEC) •vědecky: proč takový efekt, jaké jsou okolnosti, důsledky … 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Ekotoxikologie vs Ekologie ? Ekologie Ekotoxikologie Velmi široký záběr (vztahy mezi organismy navzájem a organismy a prostředím) Zúžený zájem – organismy vs. prostředí, resp. negativní vlivy změn prostředí (vyvolané člověkem) Studuje spíše "fyziologické" (přirozené) stavy - vlivy běžných faktorů prostředí – teplota, vlhkost, světlo Studuje nefyziologické stavy – nepřirozené látky v prostředí, nadměrné působení fyzikálních stresorů (hluk, záření, stavby ...) Ekologie vychází z polních (ekologických) studií Více informací o jednotlivých druzích, polní studie jen v omezeném množství, často nejednoznačné výsledky 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Co jsou to toxikanty? •látky které jsou toxické v relativně nízkých koncentracích a nejsou přírodního původu (většinou…, viz např. cyanotoxiny) •z chemického pohledu látky z širokého spektra chemických látek (ropné produkty, organické látky, těžké kovy, farmaceutika, pesticidy, detergenty …), které mohou být uvolňovány do prostředí a mohou mít v ekosystémech specifické efekty/interakce •Každá lidská činnost vnáší do prostředí (toxické) látky –produkty a vedlejší produkty průmyslu –domácí odpad (detergenty, plasty ....) –produkty užívané v zemědělství –odpady z dopravy –veterinární a humánní farmaceutika –… • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Jaké biologické systémy ekotoxikologie zkoumá? E3 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Koncepce ekotoxikologie – „ekotoxikologický děj“ Chemická látka Vstup do prostředí Časová a prostorová distribuce v prostředí Fyzikální – Chemické – Biologické Procesy Analýza účinků Toxické a ekotoxické účinky Geny – Buňky – Organismy – Populace … Analýza expozice Prostředí Organismus 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Interakce toxické látky a živého organismu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Interakce toxické látky a živého organismu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Přístupy ekotoxikologie •Prospektivní přístup: laboratorní studie efektů „nových“ chemikálií a směsí, studie v simulovaných mikro/mezo ekosystémech, předpovědi efektů v ekosystémech … •Klasické zjištění koncentrace, která vyvolává efekt – testy toxicity •výsledek NOEC, LOEC, EC10, EC50, LC50 …. è PNEC • AcuteToxScheme_RM 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Přístupy ekotoxikologie •Retrospektivní přístup: studie reálných ekosystémů, studie poškození v minulosti, odhady pro budoucnost, srovnání poškozený/zdravý … • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg Mikroorganismy (připomenutí) http://www.geek.com/wp-content/uploads/2013/10/6.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kolik je v prostředí mikroorganismů? •Biodiverzita mikroorganismů je mnohem větší než jsme se původně domnívali •Venter et al. 2004, Science: –DNA z Sargasového moře – 1,2 mil nových genů a evidence 148 nových druhů •Tyto objevy pokračují smělými plány na genetickou „inventuru“ celé planety •GENOMICS: měří úplný genetický kód organismu pomocí vysokoúčinného sekvenování párů bazí jeho DNA (např. člověk 3 x 109 bp) •METAGENOMICS: měří kód pro celé společenstvo určitého prostředí (např. u půdy se v 1 g odhaduje 1012 bp!! x moře cca 6 x 109 bp) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Kolik je v prostředí mikroorganismů? •http://www.terragenome.org Front cover of Nature Reviews Microbiology 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 16 Kolik je v prostředí mikroorganismů? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Metagenom půdy •Leonardo da Vinci: „O nebesích víme více než o půdě pod našima nohama“ •Do nedávna byli vědci odkázáni pouze na izolační a kultivační techniky a o mikrobiálním světě vody, půdy a sedimentů se dovídali jen cca 0,1 - 1 % informace •S rozvojem molekulární biologie lze tento „skrytý vesmír“ poznat celý – nicméně ne jako „druhy“ ale jako celek – genom, metagenom •obrovský potenciál např. objevy nových léčiv, degradátorů polutantů, biotechnologie … Kolik je v prostředí mikroorganismů? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 18 Kolik je v prostředí mikroorganismů? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Co jsou mikroorganismy? •nejstarší obyvatelé planety •podstatně měnili globální charakter planety • • Evolution-diagram_op_800x467 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Mikroorganismům patří naše historie [USEMAP] Soubor:Paramecium.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Evoluce mikroorganismů •existují už 3,5 miliard let (pro srovnání: vícebuněčné organismy „jen“ 0,6 mld let) •evoluce všech základních biochemických mechanismů byla „složitější“ (tím pádem i delší) než evoluce všech forem života, jak je známe dnes •ještě před rozštěpením na další větve již muselo existovat: •DNA - nese dědičnou informaci (je stabilnější) •RNA – přenos informace z DNA do bílkoviny •ATP - nosič energie •H+ transportní systémy – z potenciálu H+ chemická energie •glykolýza – „neefektivní“ zisk energie z chemických látek •cyklus trikarboxylové kyseliny – dokonalé využití energie org. látek •fotosyntéza - fotoautotrofie •Calvinův cyklus - fixace CO2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Fyziologická evoluce - metanogenní archaebakterie - glykolýza, kvašení - anaerobní respirace využívající S a produkující H2S - fotosyntéza - fotosystém II - sinice - fotosyntéza - fotosystém I - fotosyntéza s vodou jako donorem elektronů (cca 2 - 2,5 mld let) - O2 je stále toxický pro většinu bakterií - vznik kyslíkové atmosféry => snížení UV 200 nm => snížení abiotické syntézy organických látek => vznik potravních sítí - vznik fixace N2 (nutná ochrana enzymu nitrogenázy před O2) - procesy oxidace - chemoautotrofie - oxidace anorganických látek - procesy oxidace - heterotrofie - oxidace organických látek H2S je donor elektronů 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Výhody mikroorganismů v evoluci •M.W. Beijerinck: "Everything is everywhere, the environment selects" • •mnohem kratší generační doba (30 min) než u vyšších organismů è změny v genetické informaci se mohou velmi rychle uchytit a rozšířit (příklad - mikrobiální resistance vůči antibiotikům) è obrovská přizpůsobivost • •genetická variabilita je základ evoluce - u prokaryot jsou zodpovědné zejména mutace (hlavně vliv prostředí - tzv. periodická selekce), kdežto u eukaryot jsou to rekombinace (menší vliv prostředí) • •víceméně všude nějaká forma sexuálního procesu: konjugace, spájení apod. è výměna DNA • •tyto vlastnosti se mimo jiné také silně projevují v jejich ekotoxikologii è specifika ekotoxikologie MO 23 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Evoluce Eukaryot •cca před 2 mld let •spojovací článek byly Archea - některé znaky bct (chybí mitochondrie, mají 70S ribozómy, nemají Golgiho aparát) •prvoci se objevují jako první eukaryota (bičík 9+2, fagocytóza atd. atd. ...) a „nejmladší“ jsou bičíkovci •následují chromista (rozsivky a ruduchy) a zelené řasy •houby, živočichové a rostliny •houby před 400 mil let z prvoků (chitin v buň. stěně) - „nejmodernější“ mikroorganismy •kvasinky jako jednobuněčné organismy až druhotně Soubor:Collapsed tree labels simplified cs.png 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Endosymbiotická teorie 25 From: Atlas and Bartha (1997): Microbial Ecology: Fundamentals and Applications From: http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/lecturesf04am/lect06.htm endo 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Co jsou mikroorganismy? •Polyfyletická skupina = nemá taxonomický význam – velmi různorodá skupina organismů •Mikro–organismy = jednotlivé organismy nejsou viditelné pouhým okem •primárně jednobuněčné organismy •Sekundárně (pseudo)vícebuněčné – vlákna sinic, hyfy hub … •Nemusí ale nutně mít nejjednodušší typ buňky! (např. nálevník) • – http://www.geek.com/science/10-incredible-microscopic-gifs-1573620/ http://www.taringa.net/posts/ciencia-educacion/15465902/La-vida-oculta-en-una-gota-de-agua.html http://www.geek.com/wp-content/uploads/2013/10/7.gif http://picload.org/image/dglwcwd/amazingmicroscop.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Co jsou mikroorganismy? •Zahrnují organismy ze skupiny prokaryota (doména Bacteria a Archaea) i eukaryota (doména Eucarya) •V prostředí zejména tyto skupiny: –Bakterie (doména Bacteria) –Aktinomycety (řád G+ bakterií Actinomycetales) –Sinice (kmen G- bakterií – Cyanobacteria) –Prvoci (říše Protozoa) –Řasy (říše Protozoa, říše Chromista, říše Plantae) –Houby (říše Fungi), kvasinky •Taxonomicky nejednoznačné zařazení •mění se na základě aktuálního poznání … •definice taxa u bakterií je jiná než známe z klasické taxonomie: druh bakterií – seskupení sdílející vysokou úroveň fenotypové podobnosti a současně se lišící od zbývajících seskupení v tom samém rodu (Sedláček, 2007) •dnes často vychází z fylogeneze a analýzy DNA (16S rDNA u bakterií …) – 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Moderní rozdělení – 3 skupiny (domény) 24 From: Atlas and Bartha (1997): Microbial Ecology: Fundamentals and Applications 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Bakterie bcereus Bacilus cereus Escherichia coli ｸﾞﾗﾑ陰性菌-1 [USEMAP] 発光細菌-1 Vibrio fisheri http://t1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQmOanAi3CU74sJcbP7Ao4xuRoAE1a0CJFBmpUOcN1JreJ7IqZFdg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Aktinomycety 放線菌-5 放線菌-6 Soubor:Actinomyces israelii.jpg 240px-Corynebacterium_ulcerans_01 figure2-2-500x210 SSSA14 LR 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Bakterie 0005 07 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Sinice ｼｱﾉﾊﾞｸﾃﾘｱ-1 Cyanobacteria2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Prvoci Soubor:Paramecium.jpg trepka Paramecium Amoeba proteus Amoeba q442779_356962_protozoan3 Amoeba 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Řasy [USEMAP] rozsivka http://t1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcTKBP_RsMTlwLCetjOBKlpz1L8h6O16l8s1qzCvu5Hr02C5viS9 euglena http://t0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcR6Q9C_645BznQGPYm-QJTS9i-3MULi_iZSA4arZjmrIryOnumDwA dinophyta http://geologie.vsb.cz/paleontologie/paleontologie/Fytopaleontologie/Odd%C4%9Blen%C3%AD%20Dinophyta _soubory/image010.jpg Dělící se buňky Chlorelly 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 60 From: Maier et al. (2000): Environmental Microbiology, Academic Press Prvoci, řasy Paramecium 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Houby vam mykorrhyza (houba a jetel) http://www.sci.muni.cz/mikrob/Miniatlas/images/kvasinky/mikro/cand-glob.jpg Candida globosa http://www.sci.muni.cz/mikrob/Miniatlas/images/kvasinky/kolonie/sacchk.jpg Saccharomyces cerevisae http://www.sci.muni.cz/mikrob/Miniatlas/images/kvasinky/mikro/sacch.jpg http://www.sci.muni.cz/mikrob/Miniatlas/images/plisne/kolonie/Aspergillus%20niger%20CCF%201610%20CY A%205-25.jpg Aspergillus niger 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 59 59 From: Maier et al. (2000): Environmental Microbiology, Academic Press Houby 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Stručné přestavení půdních mikroorganismů •Aktinomycety –http://www.agron.iastate.edu/~loynachan/mov/flash/actinomycetes.html •Řasy a sinice –http://www.agron.iastate.edu/~loynachan/mov/flash/cyano-algae.html •Bakterie –http://www.agron.iastate.edu/~loynachan/mov/flash/bacteria.html •Houby –http://www.agron.iastate.edu/~loynachan/mov/flash/fungi.html •Prvoci –http://www.agron.iastate.edu/~loynachan/mov/flash/protozoa.html 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Prokaryota (a) vs Eukaryota (b) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Srovnání prokaryota vs. eukaryota - velikost cca 1 μm - cytoplazmatická membrána - základní cytoplazma - buněčná stěna (peptidoglykan - murein, G+ a G-) - vakuoly - bičíky (jednoduchý) - ribosomy (volné, sedimentační koeficient 70S: 5, 16 a 23S) - jádro (velmi dlouhá kruhová DNA - nukleoid, haploidní ...) + mají plasmidy - buněčné inkluze - velikost cca desítky µm - cytoplazmatická membrána - základní cytoplazma - buněčná stěna (nemá peptidoglykan, houby mají chitin) - vakuoly - bičíky (9+2 uspořádání) - ribosomy (vázané na ER, 80S) - jádro (2 membrány, póry, chromozómy, histony ...) - buněčné inkluze - mitochondrie - ER - jaderná membrána - Golgiho aparát - plastidy - dělící vřeténko 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Srovnání prokaryota vs. eukaryota Sedláček I., 2007, Taxonomie prokaryot 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Metabolismus mikrobiálních buněk obecně NUTRIENTS for biosynthesis (C, N, P ...) ENERGY Chemicals, light Catabolism Anabolism Energy Motility, transport of nutrient, etc Waste products Energy for biosynthesis Cellular components Precursors for biosynthesis Electron acceptors 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Autotrofie Všechny buněčné složky syntetizují z anorganických látek (H2O, CO2, NH3 a H2S). Podle zdroje energie: 1) Fotoautotrofie (fotolitotrofie) - zdroj E je světlo, fotosyntéza, Calvinův cyklus fixace CO2 - bct. mají bakteriochlorofyl a zdroj H a e- je H2S či H2 - sinice + rostliny mají chlorofyl a zdrojem H a e- je H2O 2) Chemoautotrofie (chemolithotrofie) - pouze u některých bakterií - energie z oxidace anorganických látek (H2, S, FeII, MnII, NO2-, NH4+, H2S, CH4, CS2, CHOH atd.) molekulovým kyslíkem - striktně aerobní - velmi malá energetická účinnost (jen 8% celkové energie) - evolučně nevýhodné, citlivé vůči stresu - CO2 je zdroj uhlíku 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Heterotrofie Potřebují organické látky, které nejsou schopni syntetizovat Podle zdroje energie 1) Fotoorganotrofie -zdroj energie je světlo, ale zdroj uhlíku není CO2 ale acetát, pyruvát, fumarát apod., které slouží také jako donor vodíku - 2) Chemoorganotrofie -většina bakterií a všechny houby a živočichové -zdrojem E je oxidace redukované organické látky, která je zároveň zdrojem uhlíku -aerobní respirace (oxidace) - kyslík molekulový jako akceptor elektronů - kvašení – akceptor elektronů je organická látka, není elektronový transportní řetězec - anaerobní respirace (oxidace) - kyslík z anorganických látek jako akceptor elektronů (denitrifikace, desulfurikace apod.) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Souhrn variant metabolismu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif catabolismsummary Souhrn metabolismu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 23 column3 47 From: Atlas and Bartha (1997): Microbial Ecology: Fundamentals and Applications Faktor prostředí pro metabolismus MO The Winogradsky Column 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Připomenutí základní biochemie – ZOPAKOVAT! •ATP, ADP, AMP •glykolýza (1 glukóza = 2 ATP) •Krebsův cyklus (1 glukóza = 38 ATP) •Fotosyntéza •Calvinův cyklus •syntéza bílkovin (transkripce, translace) •enzymová kinetika • • 26 34 Michaelis_Menten Lineweaver_Burk 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg Mikroorganismy v ŽP 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Mikroorganismy jsou součást prostředí Mají - li být reakce mikroorganismů studovány v reálném prostředí, NELZE je chápat odděleně od vlastností a změn prostředí samotného Naopak: variabilita vlivem faktorů prostředí často zastíní efekt chemických látek v prostředí … Mikroorganismy jsou součástí prostředí a podílejí se na jeho vývoji. Proto je nutná znalost okolních faktorů prostředí. = Environmentální mikrobiologie 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Vývoj mikrobiologie vs environmentální mikrobiologie •mikrobiologie existuje už 300 let, mikrobiální ekologie ale až ve 20. století •dlouho opomíjeny mikroorganismy jako složka ekosystému i přes jejich významné funkce •důvod = "mikro" - nedostatek metod studia, nepostačující klasická ekologie; R. Koch založil techniky izolace a kultivace čistých kultur - dodnes se užívají; moderní techniky až v posledních 30 letech (např. PCR 1985) •zlom na přelomu 20. století, uvědomění obrovského rozsahu aktivit mikroorganismů •S. Winogradskij - sloupce víceméně uzavřený systém •mikrobiální ekologie, na rozdíl od makroekologie, se odehrává až na odběr vzorků v laboratoři, postupy jsou složitější … • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Význam bakterií •cykly prvků a látek •fixace dusíku •Dekompozice •Symbiózy •patogenní Význam hub •dekompozice (nabourání komplexů ligninu a humusových látek •Symbiotické •Patogenní •vyšší tolerance k pH než bakterie (v nižších pH dominují houby) Význam prvoků •potravní řetězce (predátoři + konzumenti + destruenti + producenti) •konzumují bakterie – podporují jejich růst •dekompozice OM •fagotrofie a heterotrofie – cykly látek, uvolnění látek z bakteriální biomasy •autotrofie – řasy - producenti • • Ekologie MO a environmentální mikrobiologie 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Ekologie MO a environmentální mikrobiologie •obory související s ekotoxikologií MO •„větší“ obory – vztah MO v prostředí v celé šíři (ekotoxikologie MO se soustředí spíše na toxické látky) •existuje bohatá základna literatury (viz doporučená literatura předmětu) • •přednášky na PřF: –Bi8420 Ekologie mikroorganizmů –Bi6361 Mikrobiální ekologie vody – • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Ekologická klasifikace mikroorganismů •Autochthonní •přirozeně se vyskytující –přežívají, rostou a jsou aktivní •obsazují ekologické niky –podle fyz-chem vlastností jsou obsazeny kompatibilní fyziologií –Kompetice •nízké ale konstantní aktivity Zymogenní –přirozeně se vyskytující –periodická aktivita Allochthonní –cizí –přechodné, nestálé –žádná funkční nika –do ekosystému vnesené (např. E. coli) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Environmentální mikrobiologie a její aplikace Environmental Microbiology Industrial microbiology Hazardous waste – bioremediation Soil microbiology Aero- microbiology Aquatic microbiology Water quality Biotechnology Diagnostic microbiology Occupational health/infection control Food safety 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg Ekotoxikologie MO jako obor 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Ekotoxikologie MO jako obor •Ekotoxikologie mikroorganismů není o působení mikroorganismů na jiné organismy, ani o toxinech mikroorganismů •Zabývá se interakcemi mezi kontaminanty životního prostředí a mikroorganismy v prostředí •PROČ? •Mikroorganismy jsou velmi významnou složkou všech ekosystémů •Zastávají klíčové role ve fungování ekosystémů •Narušením těchto dějů se narušuje stabilita celého ekosystému •Mikroorganismy jsou schopny některé typy kontaminace snižovat, čehož lze využít při remediacích •při narušení jejich základních funkcí: snížená metabolická aktivita, snížení recyklace materiálu v ekosystémech, neschopnost samočištění a biodegradací toxických látek 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Úvod •Ekotoxikologie MO je průnik několika uznávaných oborů •Jejich znalost je podkladem pro chápání ekotoxikologie MO a to: –pro chápání sledovaných parametrů, jejich významu a dopadu efektů –pro chápání vztahů MO k prostředí a k chemickým látkám –principu testů a interpretace výsledků • Mikrobiologie (MO a vše kolem nich, fyziologie ...) Mikrobiální ekologie (vztah MO a prostředí) Ekotoxikologie (účinky faktorů na organismy) Env. chemie (osud chem. látek v prostředí) Vědy o prostředí (půda, voda ..) Logickou syntézou vzniká nová kvalita Environmentální mikrobiologie 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Současná mikrobiální ekotoxikologie a ekologie představuje rozvíjející se vědní obor s uceleným systémem verifikovaných základních metod. Při určitém zjednodušení lze v současném stavu oboru vymezit základní myšlenkové i metodické linie: (1) výzkum zaměřený na mikrobiální procesy v reálných ekosystémech nebo v celistvých vzorcích prostředí (2) studie pracující s mikroorganismy izolovanými z prostředí, a následně zkoumanými z hlediska genetické, taxonomické nebo fyziologické diverzity (3) Testy toxicity s mikroorganismy – využití v praxi (4) Interakce mikroorganismů a kontaminantů v biodegradacích a bioremediacích Ekotoxikologie MO - současný stav a koncepční otázky 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Proč mikroorganismy v ekotoxikologii ? •většinou jednobuněčné è relativně jednoduché interpretace výsledků • •často haploidní genom è fenotyp = genotyp • •rychlý růst a možnost studovat několik generací v krátké době • •možnost studovat celá společenstva a populace v malém objemu, navážce • •možnost pracovat s vysokou diverzitou a variabilitou (vysoká funkční variabilita = široké spektrum energetických strategií, metabolických typů - autotrofie i heterotrofie - výhoda pro vývoj nových testů; vysoká ekologická diverzita - rozmanité a proměnlivé růstové/životní strategie) • •možnost studovat jak specifické, tak obecné funkce • •možnost studovat stejnou populaci v reálném ekosystému i v laboratoři • •mohou přežívat v těžce znečištěném prostředí – vědecky a biotechnologicky důležité 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Výhodou mikroorganismů je, že umožňují najednou hodnotit velké množství parametrů i například současné hodnocení biodegradace organické látky a vlivu na mikrobiální procesy. 0003 Proč mikroorganismy v ekotoxikologii 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Bakteriální buňka je relativně malá, má však velký specifický povrch: Příklad: Chlamydia: 0,3 × 0,3 µm; E. coli: 2-3 µm × 0,4-0,6 µm; Chromatium: 25 × 10 µm Vzhledem k tomu jsou minimalizovány časy potřebné na proniknutí látky do buněk a roste pravděpodobnost rychlé kolize s vnitrobuněčnými receptory Vysoká pravděpodobnost reakce povrchu buňky s aktivními látkami Proč mikroorganismy v ekotoxikologii? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Je velmi vysoká rychlost metabolismu (anabolismu i katabolismu) Rychlost metabolismu prokaryot navozuje energetické aspekty vlivu stresových faktorů (jsou citlivější) Proč mikroorganismy v ekotoxikologii? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Environmentální znečištění u mikroorganismů působí jako stresový faktor vyvolávající selekci resistantních kmenů a druhů: - resistentní druhy mohou rychle využít mrtvé buňky citlivějších druhů jako substrát, což může fungovat jako stimulace - z toho také vyplývá, že účinek znečištění závisí na historii společenstva -relativně rychlá selekce může ovlivňovat výsledky toxikologických testů Příklad: Abundance bakterií v různých sedimentech 1 měsíc po olejové havárii Amoco Cadiz Specifika ekotoxikologie mikroorganismů 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Koncepční přístupy – škála úrovní biologické integrace 30 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Přístupy mikrobiální ekotoxikologie Každý metodický přístup má svá omezení a může být interpretován pouze s ohledem na svůj informační obsah a zaměření Testy toxicity Bioindikace Parametry typu LCx, ECx, IDx Standardizované organismy Standardizované podmínky Retrospektivní údaj o kontaminaci a poškození vybraných druhů (populací) Neznáme historii Nekontrolované faktory Reálná společenstva mikroorganismů Environmentální směsi stresorů × ? interpretace účelnost 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Přístup k hodnocení ekologických účinků: “Klasika”: • vím co je stresor (komplex stresorů) • od jedoduchého ke složitému dle: • hledáme kauzalitu • propojení mezi účinky a stresory • může dojít k prohození fází EcoRA • Klesá možnost exaktních testů Narůstá nutnost expertních posudků Přístupy ekotoxikologie MO • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Terénní studie - mikroorganismy jako bioindikátory •jsou velmi smysluplné vzhledem k zapojení v cyklech živin a v biotransformacích a biodegradacích • •jsou velmi pragmatické díky existenci rychlých a jednoduchých testů • •umožňují dobré modelování a extrapolace na vyšší organismy a jiné chemické látky • •jsou podstatné z hlediska celého ekosystému - stojí na nižších trofických úrovních a fungují jako „early warning“ • •jsou moderní, neboť využívají nejnovější metody (molekulární techniky apod.) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Testy (eko)toxicity s MO BIOTA mikroorganismus(y) + KONTAMINANT čistá látka(y) vzorek z ŽP (40 %) - testy jsou prováděny v adekvátní ředící řadě - biologický materiál jen ve stejné kvalitě - standardní podmínky testu - výstupy NOEC, LOEC, LC50, EC50, IC50 ... 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Přístupy k ME výzkumu vs hodnocení ER Laboratorní testy (eko)toxicity Analýzy mikrobiálních společenstev v reálném prostředí Prospektivní hodnocení ekologických rizik Ekotoxicita Toxicita Retrospektivní hodnocení ekologických rizik variabilita neznámé faktory realita umělý systém ALE 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Terénní studie vs. laboratorní testy ZÁVĚR nutnost optimálního kompromisu mezi laboratorními testy a terénními studiemi NAVÍC: možnost oba přístupy kombinovat! 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Ekotox. MO umožňuje kombinace přístupů 31 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif OECD •http://www.oecd.org/document/40/0,3746,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html • 73 Organisation for Economic Co-operation and Development Test No. 201: Alga, Growth Inhibition Test 11 July 2006 Test No. 209: Activated Sludge, Respiration Inhibition Test (Carbon and Ammonium Oxidation) 23 July 2010 Test No. 224: Determination of the Inhibition of the Activity of Anaerobic Bacteria 25 Jan 2007 Test No. 216: Soil Microorganisms: Nitrogen Transformation Test 21 Jan 2000 Test No. 217: Soil Microorganisms: Carbon Transformation Test 21 Jan 2000 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 74 Standardy biotestů - ISO ISO Logo Vodní mikroorganismy ISO 10712:1995 Water quality -- Pseudomonas putida growth inhibition test (Pseudomonas cell multiplication inhibition test) ISO 11348-1:2007 Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) -- Part 1: Method using freshly prepared bacteria ISO 11348-2:2007 Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) -- Part 2: Method using liquid-dried bacteria ISO 11348-3:2007 Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water samples on the light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) -- Part 3: Method using freeze-dried bacteria ISO 13641-1:2003 Water quality -- Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria -- Part 1: General test ISO 13641-2:2003 Water quality -- Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria -- Part 2: Test for low biomass concentrations ISO 13829:2000 Water quality -- Determination of the genotoxicity of water and waste water using the umu-test ISO 16240:2005 Water quality -- Determination of the genotoxicity of water and waste water -- Salmonella/microsome test (Ames test) ISO/DIS 11350 Water quality -- Determination of the genotoxicity of water and waste water -- Salmonella/microsome fluctuation test (Ames fluctuation test) ISO 15522:1999 Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water constituents on the growth of activated sludge microorganisms ISO 21338:2010 Water quality -- Kinetic determination of the inhibitory effects of sediment, other solids and coloured samples on the light emission of Vibrio fischeri (kinetic luminescent bacteria test) ISO 8192:2007 Water quality -- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation ISO 9509:2006 Water quality -- Toxicity test for assessing the inhibition of nitrification of activated sludge microorganisms 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 75 Standardy biotestů - ISO ISO Logo Biodegradabilita ve vodě ISO 10634:1995 Water quality -- Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium ISO 10707:1994 Water quality -- Evaluation in an aqueous medium of the "ultimate" aerobic biodegradability of organic compounds -- Method by analysis of biochemical oxygen demand (closed bottle test) ISO 10708:1997 Water quality -- Evaluation in an aqueous medium of the ultimate aerobic biodegradability of organic compounds -- Determination of biochemical oxygen demand in a two-phase closed bottle test ISO 11733:2004 Water quality -- Determination of the elimination and biodegradability of organic compounds in an aqueous medium -- Activated sludge simulation test ISO 11734:1995 Water quality -- Evaluation of the "ultimate" anaerobic biodegradability of organic compounds in digested sludge -- Method by measurement of the biogas production ISO 14592-1:2002 Water quality -- Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations -- Part 1: Shake-flask batch test with surface water or surface water/sediment suspensions ISO 14592-2:2002 Water quality -- Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations -- Part 2: Continuous flow river model with attached biomass ISO 14593:1999 Water quality -- Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium -- Method by analysis of inorganic carbon in sealed vessels (CO2 headspace test) ISO 16221:2001 Water quality -- Guidance for determination of biodegradability in the marine environment ISO 18749:2004 Water quality -- Adsorption of substances on activated sludge -- Batch test using specific analytical methods ISO 7827:2010 Water quality -- Evaluation of the "ready", "ultimate" aerobic biodegradability of organic compounds in an aqueous medium -- Method by analysis of dissolved organic carbon (DOC) ISO 9408:1999 Water quality -- Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium by determination of oxygen demand in a closed respirometer ISO 9439:1999 Water quality -- Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium -- Carbon dioxide evolution test ISO 9887:1992 Water quality -- Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds in an aqueous medium -- Semi-continuous activated sludge method (SCAS) ISO 9888:1999 Water quality -- Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium -- Static test (Zahn-Wellens method) ISO/TR 15462:2006 Water quality -- Selection of tests for biodegradability 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 76 Standardy biotestů - ISO ISO Logo Půdní mikroorganismy ISO 10381-6:2009 Soil quality -- Sampling -- Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil under aerobic conditions for the assessment of microbiological processes, biomass and diversity in the laboratory ISO 14240-1:1997 Soil quality -- Determination of soil microbial biomass -- Part 1: Substrate-induced respiration method ISO 14240-2:1997 Soil quality -- Determination of soil microbial biomass -- Part 2: Fumigation-extraction method ISO 16072:2002 Soil quality -- Laboratory methods for determination of microbial soil respiration ISO 17155:2002 Soil quality -- Determination of abundance and activity of soil microflora using respiration curves ISO 15685:2004 Soil quality -- Determination of potential nitrification and inhibition of nitrification -- Rapid test by ammonium oxidation ISO 14238:1997 Soil quality -- Biological methods -- Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence of chemicals on these processes ISO 23753-1:2005 Soil quality -- Determination of dehydrogenase activity in soils -- Part 1: Method using triphenyltetrazolium chloride (TTC) ISO 23753-2:2005 Soil quality -- Determination of dehydrogenase activity in soils -- Part 2: Method using iodotetrazolium chloride (INT) ISO/DIS 11063 Soil quality -- Method to directly extract DNA from soil samples ISO/TS 29843-1:2010 Soil quality -- Determination of soil microbial diversity -- Part 1: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) and phospholipid ether lipids (PLEL) analysis ISO/PRF TS 29843-2 Soil quality -- Determination of soil microbial diversity -- Part 2: Method by phospholipid fatty acid analysis (PLFA) using the simple PLFA extraction method ISO/TS 10832:2009 Soil quality -- Effects of pollutants on mycorrhizal fungi -- Spore germination test ISO/TS 22939:2010 Soil quality -- Measurement of enzyme activity patterns in soil samples using fluorogenic substrates in micro-well plates ISO 11266:1994 Soil quality -- Guidance on laboratory testing for biodegradation of organic chemicals in soil under aerobic conditions ISO 15473:2002 Soil quality -- Guidance on laboratory testing for biodegradation of organic chemicals in soil under anaerobic conditions ISO 14239:1997 Soil quality -- Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 77 Standardy biotestů - ČSN UNMZ ČSN EN ISO 10253 Jakost vod - Zkouška inhibice růstu mořských řas Skeletonema costatum a Phaeodactylum tricornutum ČSN EN ISO 11348-2 Jakost vod - Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou emisi Vibrio fischeri (Zkouška na luminiscenčních bakteriích) - Část 2: Metoda se sušenými bakteriemi ČSN EN ISO 11348-3 Jakost vod - Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou emisi Vibrio fischeri (Zkouška na luminiscenčních bakteriích) - Část 3: Metoda s lyofilizovanými bakteriemi ČSN EN ISO 11348-3 Jakost vod - Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou emisi Vibrio fischeri (Zkouška na luminiscenčních bakteriích) - Část 3: Metoda s lyofilizovanými bakteriemi ČSN EN ISO 8692 Jakost vod - Zkouška inhibice růstu sladkovodních zelených řas ČSN EN ISO 9509 Jakost vod - Zkouška toxicity pro hodnocení inhibice nitrifikace mikroorganismy aktivovaného kalu ČSN EN ISO 8192 Jakost vod - Zkouška inhibice spotřeby kyslíku aktivovaným kalem při oxidaci uhlíkatých látek a amoniakálního dusíku ČSN 75 7717 Jakost vod - Stanovení planktonních sinic ČSN EN 13946 Jakost vod - Návod pro rutinní odběr a úpravu vzorků bentických rozsivek z řek ČSN EN 14407 Jakost vod - Návod pro identifikaci a kvantifikaci bentických rozsivek z vodních toků a pro interpretaci dat ČSN EN 15204 Jakost vod - Návod pro počítání fytoplanktonu za použití inverzní mikroskopie (metoda podle Utermöhla) ČSN EN ISO 11733 Jakost vod - Stanovení odstranitelnosti a biologické rozložitelnosti organických látek ve vodním prostředí - Simulační zkouška s aktivovaným kalem ČSN EN ISO 16266 Jakost vod - Stanovení Pseudomonas aeruginosa - Metoda membránových filtrů ČSN EN ISO 9408 Jakost vod - Hodnocení úplné aerobní biologické rozložitelnosti organických látek ve vodním prostředí stanovením spotřeby kyslíku v uzavřeném respirometru ČSN EN ISO 9439 Jakost vod - Hodnocení úplné aerobní biologické rozložitelnosti organických látek ve vodním prostředí - Metoda stanovení uvolněného oxidu uhličitého ČSN ISO 14593 Jakost vod - Hodnocení úplné aerobní biologické rozložitelnosti organických látek ve vodním prostředí - Metoda stanovení anorganického uhlíku v těsně uzavřených lahvičkách (CO2 headspace metoda) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Standardy US EPA 78 http://www.epa.gov/ocspp/pubs/frs/home/draftguidelines.htm Voda 850.5400 - Algal Toxicity, Tiers I and II (PDF) (11 pp, 42K) 850.6800 - Modified Activated Sludge, Respiration Inhibition Test for Sparingly Soluble Chemicals (PDF) (9 pp, 37K) Půda 850.4600 - Rhizobium-Legume Toxicity (PDF) (14 pp, 73K) 850.4800 - Plant Uptake and Translocation Test (PDF) (13 pp, 35K) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Effects of Road Deicing Salts on Soil Microorganisms •3 místa v KRNAP intenzivní solení •Sledován efekt na mikroorganismy [USEMAP] 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Effects of Road Deicing Salts on Soil Microorganisms Reálné společenstvo mikroorganismů Testy toxicity s bakteriemi versus [USEMAP] 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Proč ME v hodnocení ekologických rizik ? Ekologicky významná informace Aplikace různých přístupů Trofická úroveň dekompozitorů Koloběh živin a energie Úroveň společenstev Citlivé populace nebo fyziologické skupiny Fertilita Biologický potenciál (kvalita) Stabilita ekosystému Polní a terénní studie Modelové laboratorní studie × 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Interakce se stresovými faktory Vhodný model pro praktické studie Mobilita Biodostupnost Akutní toxicita Kontaminace potravních řetězců Relativně velká společenstva Možné studie pouze malých ploch (lokální kontaminace) Transformace Biotransformace Biodegradace Vztahy k rostlinám a půdním bezobratlým Proč ME v hodnocení ekologických rizik ?