1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg Adobe Systems logo_mu_cerne.gif
Inovace tohoto předmětu byla spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České
republiky
Bi6420
Ekotoxikologie mikroorganismů
https://is.muni.cz/el/1431/jaro2014/Bi6420/index.qwarp
Doc. RNDr. Jakub Hofman, Ph.D.
hofman@recetox.muni.cz
jaro 2014

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg Adobe Systems logo_mu_cerne.gif
Inovace tohoto předmětu byla spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České
republiky
Bi6420: Ekotoxikologie mikroorganismů
Část 2: MO a toxické látky
Biodostupnost toxických látek pro MO v prostředí
Vstup toxických látek do MO a povrchové bariéry
Interakce toxikantů s mikrobiálními buňkami, obrana MO proti toxikantům, toxicita, biodegradace
polutantů

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Působení toxických látek na MO
•funkce koncentrace
•DOSE – RESPONSE vztah – vyšší koncentrace – vyšší efekt, ALE např. u esenciálních kovů křivka
optima a v některých případech efekt hormese
•funkce vlastností látky
•chemická struktura, Kow, Sw, Koc, pKa, MW, H, pv
•formy (specie), reaktivita, biodostupnost
•funkce vlastností MO, např.
•jaká je buňka typu (prokaryotická či eukaryotická, G+ či G-)
•jaká je morfologie, fyziologie, typ metabolismu
•vliv stavu buněk (fáze buněčného cyklu, spóra či ne)
•funkce vlastností (faktorů) prostředí
•pH, CEC, OM, redox, teplota …
•např. vliv pH na mobilitu kovů, kosubstráty, TEA …
•přítomnost surfaktantů …
vstup
Transport, přeměny, toxicita
výstup

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Působení toxických látek na MO
•funkce času - lineární, u chronického působení spíše klesá s dobou působení (důsledek adaptace),
případně opakovaná expozice
•u MO není tak jednoznačně oddělitelná akutní a chronická toxicita
106
Ireverzibilita působení toxického efektu:

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Zjednodušené schéma expozice MO v prostředí
E3

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg
Biodostupnost toxických látek pro MO v prostředí


1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Zjednodušené schéma expozice MO v prostředí
MO

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Released
contaminant
Absorbed
contaminant in
organism
Site of biological
response
Bound
contaminant
Cellular membrane
Association
Dissociation
A
B
C
D
E
Bioavailability processes (A, B, C and D)
Contaminant
interactions
between phases
Transport of
contaminants
to biota
Passage across
cellular
membrane
Circulation within organism,
accumulation in target organ,
toxicokinetics, and toxic effects
Bioaccessibility
(Processes A, B, C and D)C
Bioavailability
(Process D)
Schéma biodostupnosti a biodosažitelnosti

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Situace v pevných matricích (půda, sediment)
Písek
Prach
Jíl
OM
1 nm kontaminant
10 µm
1-2 µm
bakterie
Prach
(50 µm - 2 µm)
Písek
(2000 µm - 50 µm)
Jíl
(2 µm – 0,2 µm)
Organická hmota
(N/A)

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Organic matter
Organic matter
Mineral
fraction
Surface
sorption
Surface
sorption
Diffusion into rubbery
organic matter
Diffusion into glassy
organic matter
Diffusion in pores
Water soluble
fraction
Semple et al., 2003
Situace v pevných matricích (půda, sediment)

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Jestliže biota nemůže jít ke kontaminantu ……,
………… tak kontaminant musí jít k biotě !!!!!
Biodegradace či toxicita
BAKTERIE
Autor schématu K.T. Semple
Příklad fungování „mass transfer“
Půdní částice a pór v ní

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Princip „mass transfer“ (přesunu polutantu) ?
Reakce nachýlená ve prospěch desorpce
Rovnováha
B
Vliv mikroorganismů
A
Žádná interakce mikroorganismů
Půdní roztok
Autor schématu K.T. Semple

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Kovy v prostředí a biodostupnost pro MO
•na rozdíl od organických polutantů a dalších toxikantů, kovy nemohou nikdy být degradovány, pouze
změna jejich formy, specie è mobility, biodostupnosti
•celková koncentrace kovu v prostředí tedy není relevantní z pohledu jeho toxicity, mnohem více je
důležitá dostupná frakce: kovy ve formě tzv. volného iontu – free ion
•nedostupné jsou většinou kovy vázané na koloidy či povrchy pevné frakce -(kat)iontová výměna, kovy
vysrážené či v komplexech (např. reagují s přítomnými fosfáty a sulfáty, hydroxy- a thiolo-
skupinami na OM)
•

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Kovy v prostředí a biodostupnost pro MO
•výskyt biodostupných forem kovu závisí silně na faktorech prostředí – CEC, pH, redox a OM, jílové
minerály, rozpuštěné sulfidy, komplexační činidla (HA), aktivity MO
•
007
Faktor
Proces, který se odehrává
Vliv na mob/biodost

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Kovy v prostředí a biodostupnost pro MO
•závisí samozřejmě také na vlastnostech kovu: metaloidy (Ge, As, Sb, Se) – tvoří aniontové specie
(např. AsO43-)na rozdíl od kovů, které jsou v prostředí většinou jako kationtové specie
•
•
006

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Kovy v prostředí a biodostupnost pro MO
•Redox
•při aerobních podmínkách (0-800 mV) jsou kovy ve formě volného kationtu
•při anaerobních podmínkách (-400-0 mV) jsou vysrážené, např. v sulfidech, uhličitanech
pH
•vyšší pH – kovy jsou ve formě nerozpustných fosfátů a uhličitanů, také se snižuje kapacita
pH-dependentní CEC
•nižší pH – volné kationty nebo rozpustné organokovy, stoupá rozpustnost, naopak vyšší sorpce
aniontových specií
Převzato z ISO 17402: Soil quality - Guidance for the selection and application of methods for the
assessment of bioavailability in soil and soil materials

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Kovy v prostředí a biodostupnost pro MO
•Kationtová výměna (KVK, CEC)
•kationty kovů se váží na negativně nabité jílové částice v půdě a sedimentech
•půdy a sedimenty s vysokou CEC (organické a jílovité půdy) mají nízkou toxicitu, i když jsou
celkové koncentrace kovů v nich vysoké
•stejně tak ale jsou afinitní k negativně nabitým skupinám na povrchu MO
•síla vazby (na abio. i MO) je různá: Al3+ > Ca2+ = Mg2+ > K+ > Na+
•například Al3+ má tak vysokou afinitu k aniontům, že se většinou vyskytuje jako Al(OH)3 a je
nedostupný (při poklesu pH se pak uvolní)
•toxické kovy tvoří často veliké, dvojmocné kationty, které mají vysokou afinitu k adsorpci è
nahradí „živinové“ kovy Ca2+ Mg2+ K+ Na+ na površích a zůstanou pevně navázány
•
•
•

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Biodostupnost organických polutantů
•Většinou jsou persistentní polutanty s nižší polaritou, rozpustností ve vodě a tlakem par, s vyšší
hydrofobicitou a lipofilicitou a odolnou chemickou strukturou
Rychle degradovatelné
Pomalu degradovatelné

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Time
Degradable/removable fraction
Readily available
fraction
Recalcitrant fraction
Non-extractable fraction
Biodostupnost organických polutantů
Převzato z Semple et al. (2003), E J Soil Sci 54: 809

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Interakce organického kontaminantu a NAPL
Půdní částice
Půdní roztok
NAPL
Non-aqueous Phase Liquid
Autor schématu K.T. Semple

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Soil-associated HOC
Degradation by
direct contact
Dissolved HOC
Degradation in the
aqueous phase
Způsoby degradace
Autor schématu K.T. Semple
To stejné platí pro toxicitu, takže …

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Newsprint
Mikroorganismus
Chemická metoda
Hydrofóbní kontaminant (HOC) vázaný na půdu
Desorbovaný
HOC
Napodobení biodostupnosti HOC pro MO
?
Autor schématu K.T. Semple

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Napodobení biodostupnosti HOC pro MO
beta_cd
Hydroxypropyl-b-cyclodextrin
Komplex
Hydroxypropyl-b-cyclodextrin-kontaminant
Hydrofobní
kavita
Hydrofilní
navenek

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Napodobení biodostupnosti HOC pro MO
Teflonové centrifugační zkumavky, půda (1.5 g)
HPCD (25 mL)
Třepačka (20 h)
Centrifugace 5000 g
Supernatant odebrán
Analýza HPLC po štěpení MeOH či analýza na LSC pro 14C značené látky

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Napodobení biodostupnosti HOC pro MO


1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Klíčový
transfer
Vázaný na
půdu
Cyclodextrin
Enkapsulace
Biodegradace
Transfer do
roztoku
Rozpuštění do
rozpouštědla
Extrakce
organickým
rozpouštědlem
Napodobení biodostupnosti HOC pro MO
•Extrakce cyklodextrinem dokáže mimikovat biodostupnost pro bakterie

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg
Vstup toxických látek do MO a povrchové bariéry


1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Povrchové bariéry mikroorganismů
-důležité proto, že mikrobiální ekotoxikologie MUSÍ uvažovat přímé interakce buněk s vnějším
prostředím
-
-povrchové bariéry zabezpečují přísun živin a zároveň chrání obsah buněk
-
-buněčná stěna (ne u všech MO)
-cytoplazmatická membrána
-
-definují také antigenní vlastnosti buněk
-
-pozor: zatímco u prokaryot (není kompartmentace buňky) toxické látce stačí pouze proniknout přes
membránu / stěnu, u eukaryot jsou ještě další bariéry
-

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Cytoplazmatická membrána
-biomembrána - biofilm z fosfolipidů s vnořenými proteiny, obsahuje i membránové receptory a enzymy
- model mozaiky,
-není jen bariérou, má i své funkce, zejména u prokaryot nahrazuje celou řadu organel eukaryot:
-respirační řetězce a četné enz. systémy
-aparát fotosyntézy, ATP-áza
-transportní proteiny
-zakotven bičík
-syntéza a hydrolýza fosfolipidů
-poslední krok syntézy buněčné stěny
-
-
proteins http://www.ibercivis.net/content/images/Cell_membrane_detailed_diagram_en.jpg

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Procesy transportu přes membránu
•pasivní trasport – difúze
•i skrze buněčnou stěnu
•pohyb molekul dle koncentračního gradientu
•závisí na ploše a tloušťce membrány / buněčné stěny, lipofilicitě a ionizaci toxikantu (lipofilní
látky – dobře, kationty – zůstávají často navázány na negativně nabité fosfolipidy), na molekulové
hmotnosti (malé molekuly < 0,4 nm dobře)
•usnadněný transport
•transmembránové proteiny vyvazují extracelulární látky a usnadňují přenos přes membránu
•aktivní transport
•„pumpy“ po/proti koncentračnímu gradientu (i cíleně VEN z buňky – obrana buňky proti toxickým
látkám)
•navázání látky na receptor / přenos přes membránu za spotřeby ATP
•endocytoza
•transport větších molekul pinocytozou

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Vstup kovů do MO
•JE řada mechanismů. Jak mohou kovy vstoupit do MO
•MO mají vyvinuty speciální transportní systémy pro esenciální kovy přes membránu, těmi ale
vstupují i toxické kovy
–(např. Cd2+ vstupuje transportním systémem pro Mn2+, který je založen na membránovém potenciálu –
2-mocný kov za 2 H+)
176
From: Maier et al. (2000): Environmental Microbiology, Academic Press
(difúze, pasivní transport)
(velké molekuly)
(aktivní transport)

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Organické polutanty a membrána
•Pokud jsou lipofilní, rozpouští se v lipidické dvojvrstvě a prochází velmi dobře
•Ionizovatelné a velké molekuly hůře
•Buněčná membrána je považována za hlavní místo akumulace organických kontaminantů u mikroorganismů
•Toxicita organických kontaminantů bez náboje jako jsou ropné uhlovodíky nebo organická
rozpouštědla je z velké části způsobena nespecifickým narkotickým typem účinku
•Nespecifická toxicita narkotického typu je založena na rozdělení rozpuštěného kontaminantu
v lipofilní vrstvě buněčné membrány, což způsobí narušení integrity (celistvosti) membrány
•Jedním z následků vystavení membrány kontaminantu je zvýšení její propustnosti (a tím i usnadnění
přenosu dalších kontaminantů)

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Buněčná stěna
•není propustná pro makromolekuly
•mezi membránou a stěnou je tzv. periplazmový prostor, kde probíhají některé enzymatické aktivity
•z pohledu přestupu kontaminantů je důležitá zejména u prokaryot
•rozdělení na gram-pozitivní a gram-negativní
•G+ - barvivo setrvá v tlusté vrstvě peptidoglykanů
グラム染色-1
Gramovo barvení ...
http://old.lf3.cuni.cz/mikrobiologie/bak/uceb/obsah/gram/bi_gbarvicky.jpg
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/cd/Methyl_Violet_10B.png/244px-Methyl_Violet_
10B.png http://www.sigmaaldrich.com/large/structureimages/29/mfcd00013129.png

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Buněčná stěna
58
From: Maier et al. (2000): Environmental Microbiology, Academic Press
- G- stěna je tenčí a méně hmotná
- lipopolysacharidy určují antigenní specifitu
- síťovina polymerů je pevnější než u G-
- mnoho vrstev zesíťovaného peptidoglykanu
- teichoové kyseliny váží dvojmocné kationty
- buněčná stěna neobsahuje lipidy

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Buněčná stěna
http://www.pc.maricopa.edu/Biology/rcotter/BIO%20205/LessonBuilders/Chapter%204%20LB/cow95289_04_14
.jpg

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Peptidoglykan
06 08 08
Zesíťování G-
Zesíťování G+

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Gram negativní BCT
02 04 http://www.ppdictionary.com/bacteria/gram_negative_bacteria.jpg 02

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
 Lipopolysacharidy (LPS)
http://withfriendship.com/images/h/38218/Lipopolysaccharide-image.jpg
http://withfriendship.com/images/h/38218/lipopolysaccharide-mdo.jpg

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Teichoové kyseliny
http://micro.digitalproteus.com/pics/techoicacid.jpg
http://web.virginia.edu/Heidi/chapter9/Images/8883n09_25.jpg

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Buněčná stěna řas
•Skládá se z polysacharidů (např. celulóza) a/nebo řady glykoproteinů:
•celulóza
•manany (polymer monózy) – mořské zelené řasy
•xylany – zelené řasy, vysoce síťovaný polymer xylózy
•alginová kyselina – hnědé řasy, lineární polymer, složený
z jednotek kyseliny D-manuronové a L-guluronové,
vázaných převážně glykosidickou vazbou
•sulfonované polysacharidy – velice časté, ruduchy,
např. agaróza, carrageenan, porphyran …
•sporopollenin (složitý polymer z FA, fenolů, karotenoidů)
•ionty Ca
•Rozsivky syntéza b. stěny z H4SiO4, uvnitř buňky polymerizace a transport na povrch (menší
spotřeba E než org. polymery, vysoké růstové rychlosti rozsivek)
File:Xylan.svg File:Alginsäure.svg File:Agarose polymere.svg File:Moleculare structure of different
carrageenan types.svg File:Diatomeas w.jpg File:Diatomeas w.jpg

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Buněčná stěna hub
•Chitin + další polysacharidy (nemají celulózu)
•Nad plasmatickou membránou jsou tři vrstvy:
–Chitin – polymer N-acetyl-D-glucosaminu
–β-1,3-glucan (zymosan) – polymer D-glukózy
–glykoproteiny obsahující manózu, které jsou směrem ven z buňky spojeny s velkým množstvím
polysacharidových řetízků
File:Chitin.svg
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/bf/Zymosan.png/200px-Zymosan.png
http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/de/ch/8/bc/proteine/funktion_v_prot/konjugierte_protei
ne/bilder/glycopr1_swf_altref.jpg http://www.glogster.com/media/2/4/11/57/4115737.jpg

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg
Interakce toxikantů s mikrobiálními buňkami, obrana MO proti toxikantům, toxicita, biodegradace
polutantů

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Jsou velké rozdíly dle typu toxikantu
•Jedy nespecifické:
–nespecificky narušují struktury buňky
–např. kyseliny a zásady, soli těžkých kovů (sráží bílkoviny cytoplazmy), halogeny, alkoholy,
aldehydy
–nepolární narkotická toxicita – interakce nepolárních látek s plamatickou membránou – snížení její
fluidity (bazální toxicita)
•Jedy specifické:
–enzymové jedy – inhibice enzymů
–interakce se specifickými receptory
–interakce s DNA/RNA
–narušení redox potenciálu či gradientů na membránách
–kompetice se substráty či přirozenými ligandy
–mitotické jedy - u eukaryot blokují průběh mitózy
–cytostatika - zastavují buněčné dělení
–mutageny – u MO spíše zlepšují vývoj resistence
–kancerogeny - nemá smysl je takto brát u mikroorganismů!
–antibiotika - blokují některé syntézy
•

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Interakce polutantů s MO
1.nepolární narkóza (bazální toxicita, membránová toxicita) – projeví se až spíše ve vyšších
koncentracích a koreluje s Kow
2.polární narkóza - pokud je organický polutant polárnější (= tedy i reaktivnější) může působit na
membránové proteiny, efekty při nižších koncentracích než by odpovídalo Kow
– POZN.: u prokaryot je v membráně situována celá řada klíčových funkcí (respirační řetězce, aparát
fotosyntézy, tvorba ATP, transportní proteiny, biosyntézy …) è dopad polutantů na membránu
ovlivňuje i tyto funkce

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Interakce polutantů s MO
3.napadání makromolekul
–reaktivní toxicita: nižší koncentrace než pro narkózu
–toxicita elekrofilních skupin (org. kontaminanty po oxidaci/metabolizaci – epoxidy, chinony apod.
či heterocyklické – PANHs, nitroPAHs atd.) - útočí na e- bohatá místa makromolekul (nukleotidy,
SH-, NH2- v proteinech, fosfolipidech a NA)
–nebo začlenění hydrofóbní interakcí do biomolekuly (planární molekuly)
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/e4/DNA_chemical_structure.svg/300px-DNA_chemi
cal_structure.svg.png http://burningissues.org/images/dna.pah.jpg E3

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Interakce polutantů s MO
4.specifické typy toxicity
–inhibice konkrétních enzymů
–kompetitivní či nekompetitivní typ interakce vedoucí k narušení vazby substrátu a funkce enzymu
–např. inhibice enzymů respiračního řetězce
–reakce s membránovými či nukleárními receptory

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Základní skupiny polutantů potenciálně toxických pro MO
Pesticidy
Toxické pro nežádoucí organismy („pests“)
DDT, parathion, glyfosát (round-up), atrazin
Insekticidy
Toxické pro hmyz/členovce
DDT, parathion
Herbicidy
Toxické pro rostliny
2,4-D, glyfosát, atrazin
Fungicidy
Toxické pro houby/plísně
Pesticidy s toxickými kovy (Hg, Cu)
Lipofilní (hydrofobní)
Rozpustné v tucích / málo rozpustné ve vodě
DDT
Hydrofilní
Rozpustné ve vodě
Fenol, moderní insekticidy
Neutrální organické látky
Látky bez náboje (neionizují se)
DDT, PCB
Surfaktanty, detergenty
Látky snižující povrchové napětí na rozhraní dvou fází
Nonylfenol, alkylbenzen sulfonáty
Persistentní látky
Velmi dlouhý život v prostředí (nedegradují se)
DDT, PCB
Chlorované uhlovodíky, organochlorové látky
DDT, PCB, PCDD/Fs
Polychlorované bifenyly (PCB)
PCB153
Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU)
Benzo[a]pyren
Polychlorované dibenzo-p-dioxiny („dioxiny“) a –furany
2,3,7,8-TCDD
Těžké kovy, toxické kovy
Hg, Pb, Cd (+ další)
Organokovové látky
Alkyl-cíny
Organofosfáty
Látky (insekticidy) – např. parathion

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Jsou velké rozdíly dle typu toxikantu
•Kovy – nemohou být degradovány biologicky ani chemicky, pouze změněna jejich mobilita, forma či
mohou být odstraněny (ve smyslu přemístěny) do jiného prostředí, z toho vyplývá několik závěrů:
•Nejvíce riziková je většinou forma tzv. volného iontu
•Celková koncentrace je irelevantní z pohledu rizika
•Závislost na redox, pH, obsah dalších látek apod.
•MO dokáží sorbovat kovy a měnit jejich formu – využití při remediacích
•
•Organické kontaminanty – mikroorganismy řadu z nich dokáží transformovat, toho se využívá při
biodegradacích
•

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg
Kovy a MO


1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Interakce kovů a MO buněk
•definice: kovy vs těžké kovy vs toxické kovy vs metaloidy
•znáte hlavní zdroje kovů v prostředí?
•nejčastěji v hledáčku jsou: As, Cd, Cu, Cr, Hg, Pb a Zn
•
•Na, K, Mg, Ca, (Cr), V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Mo a W – mají v mikrobiálních buňkách nějakou roli
•ve stopových množstvích jsou nezbytné (= esenciální) pro mikrobiální růst a metabolismus, ale ve
vyšších koncentracích mohou mít na mikroorganismy inhibiční účinek a ve vysokých koncentracích se
mohou stát toxickými
•toxické kovy (≠ ne-esenciální) = nemají žádnou známou biologickou funkci - Ag, Cd, Sn, Au, Hg, Tl,
Pb, Al, Be, Li a polokovy Ge, As, Sb, Se
E3

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Esenciální kovy v MO


1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Interakce kovů a MO buněk
•toxicita kovů pro MO využívána od pradávna:
•Ag
•aplikace jako AgNO3 ve formě organických nebo anorganických solí
•1884 – prevence oftalmie u novorozenců (AgNO3)
•Ag ionty velmi reaktivní s bílkovinami a chloridy à omezení jejich použití jako povrchového
antiseptika
•koloidně rozpustné sloučeniny stříbra
•dezinfekce vodypůsobí i v případech rezistence k ATB
•Cu
•protihnilobný účinek mědi znám již starým Peršanům (uchovávání pitné vody v měděných nádobách)
•bakteriostatický, bakteriocidní a silný fungicidní účinek
•aplikace jako anorganické nebo organické sloučeniny
•konzervace textilií a celulózových vláken – měďnaté soli kyseliny stearové nebo naftenové,
bis(8-hydroxychinolinato)měďnatý komplex
•ochrana rostlin –chloridtrihydroxyd diměďnatý
•ochrana dřeva

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Interakce kovů a MO buněk
•Působí několika způsoby:
–nahrazení esenciálních kovů z jejich normálních vazebných míst v biologických molekulách (např. As
à P, Cd à Zn)
–narušení proteinů vazbou na SH skupiny
–inhibice enzymatických funkcí
–narušení nukleových kyselin vazbou na fosfátové nebo hydroxylové skupiny (např. Cd nahradí Zn �
jednořetězcové zlomy)
–narušení struktury nukleových kyselin
–důsledek předchozích je změna konformace proteinů a DNA è narušení jejich funkce
–interakce s biomolekulami Fentonovým mechanismem (ox. stres)
–interakce s oxidativní fosforylací
–propustnost membrány (vanadičnan, rtuť) ….
•Tyto reakce vedou obecně k inhibici dělení a růstu, morfologickým změnám, inhibici biochemických
procesů a metabolismu jednotlivých buněk
•Efekty na úrovni jednotlivých buněk se následně projevují na úrovni populace a společenstva

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Interakce kovů a MO buněk
54
176
From: Maier et al. (2000): Environmental Microbiology, Academic Press

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Interakce kovů a MO buněk
•interakce s biomolekulami Fentonovým mechanismem (ox. stres)
•
http://www.pnas.org/content/102/39/13855/F5.large.jpg
Me2+
Me3+

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Obrana a resistence MO proti kovům
•kovy byly v prostředí odjakživa è MO si vyvinuly způsoby, jak naložit s nechtěnými kovy è
resistance a tolerance MO vůči kovům a jejich detoxifikace
•jiné způsoby tolerance se vyvinuly zcela nedávno v člověkem kontaminovaném prostředí (díky rychlým
mutacím MO – až 1 mutace na každých 100 000 bp)
•od sekvestrace a imobilizace kovů po zvýšení rozpustnosti kovů ve etracelulárním prostoru
•některých těchto schopností se využívá při biotechnologiích (těžba rud, bioremediace …)
•někdy lze pozorovat zajímavý efekt, že se toxický efekt s narůstající koncentrací kovu přestane
zvyšovat – nastoupí agresivní mechanismy resistence

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Obrana a resistence MO proti kovům


1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Obrana a resistence MO proti kovům
•mechanismy resistence lze rozdělit:
1.obecné mechanismy resistence vůči kovům
a)nepotřebující stress z kontaminace kovy
b)vznikající ve stresu z kontaminace kovy
•fungují pro řadu kovů, původně slouží i pro jiné funkce
•např. vazby na povrchy – biosorpce, produkce hlenu, změny biodostupnosti kovu či redukce kovů mimo
buňku
2.mechanismy přímo určené pro obranu před toxickými kovy
•aktivace kovem, který se objevil ve vyšší koncentraci
•např. iontové pumpy, produkce methallothioneinů (MT), biometylace
•některé jsou kódovány na plasmidech (R plasmidy) – specifické pro konkrétní kov, aktivace
specifickým kovem

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Obrana a resistence MO proti kovům
59
175
From: Maier et al. (2000): Environmental Microbiology, Academic Press

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Obrana a resistence MO proti kovům
•Typical interactions of fungi with metals (Me)
•Metal mobilization results from the production and excretion of organic acids (for example,
citrate and oxalate), which increase metal solubility through acidification of the mycosphere and
provision of metal-complexing structures. This frequently occurs as a side effect of the
dissolution of primary minerals containing phosphate, carried out by mycorrhizal fungi.
•Siderophores are chelators excreted for the acquisition of iron, and they may cross-react with
other metals.
•Extra-hyphal immobilization occurs through the formation of secondary minerals, biosorption to
cell wall constituents such as chitin and chitosan, complexation by glomalin (that is,
metal-sorbing glycoproteins excreted by arbuscular mycorrhizal fungi) and effects of fungal mycelia
and glomalin on soil aggregate stability against wind and water erosion.
•Metal uptake occurs, for example, through specific transporters for the acquisition of essential
metals, and these transporters may cross-react with other metals.
•Intracellular metal immobilization involves storage in vacuoles
and complexation by cytoplasmic metallothioneins and
phytochelatins (that is, proteins and peptides, respectively,
that are rich in SH groups).
•Metal transformations such as reactions involving
organometals (for example, methylations) and redox reactions
frequently result in metal volatilization.
•Streams of cytoplasmic vesicles and vacuoles along fungal
hyphae may translocate metals to other parts of the mycelium
and to the plant symbionts of the fungi.
•MnP, manganese peroxidase.
nrmicro2519-f4

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Obrana a resistence MO proti kovům


1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Obrana a resistence MO proti kovům


1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Obrana a resistence MO proti kovům
•Biosorpce
•sorpce kovů zejména na vnější struktury (b. stěnu) MO è zabrání vstupu kovu do buňky a poškození
vnitřních struktur ç fyzikálně-chemický mechanismus
•většinou elektrostatické či van der Waalsovy síly:
–zejména karboxylové skupiny, dále fosforylové skupiny a fosfolipidy v LPS v b. stěně – silná
sorpce např. Cd2+, Cu2+, Pb2+, Zn2+, Al3+
–podíl mají i aminové, hydroxylové, thio- skupiny b. stěny
•dále fyzikální adsorpce, iontová výměna a komplexace:
–iontová výměna za H+, zásadité skupiny, či alkalické kovy přítomné v b. stěně
–komplexování s 2-mocnými kovy díky -COOH skupinám v b. stěně
•biosorpce je velice závislá na environmentálních faktorech:
–zejména pH (mění se způsob vazby na b. stěnu)
–speciaci kovů (komplikovaná biosorpce kovů po hydrolýze, snížení biosorpce v přítomnosti aniontů v
prostředí či komplexaci s ligandy)
•ekologický význam – distribuce kovů v prostředí – zejména v akv. ekosystému
•praktický význam - je využívána při remediacích

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Obrana a resistence MO proti kovům
•extracelulární sorpce
–do hlenu, do exopolymerů sacharidů, polysacharidů, NA či FA – extracellular polymeric substances –
EPS
–zejména Pb, Cd, U; většinou mají EPS negativní náboje – váží kationty a závisí na pH
–výsledkem je imobilizace kovu a snížený vstup do MO
•extracelulární komplexace pomocí siderophorů
–Fe-komplexující, nízkomolekulární organická sloučenina
–původní úloha – zisk Fe z prostředí
–interakce s Al, Ga, Cr, Cu
–snížení jejich dostupnosti a toxicity
•
http://www.nd.edu/~mmiller1/pic1.gif

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Obrana a resistence MO proti kovům
•extracelulární změna mobility díky biosurfaktantům
–např. rhamnolipid
–původní funkce zřejmě zvýšení mobility a biodostupnosti látek, které organismy využívají jako
substrát, např. ropných látek
–zajímavé je, že MO produkující biosurfaktanty jsou více četné na lokalitách kontaminovaných kovy
–komplexace s Cd, Pb, Zn è zvýšení jejich mobility, ale takový komplex již není toxický pro MO
•
http://www.metamicrobe.com/IMG/rhamnolipid-produced-by%20Pseudomonas-from-hydrocarbons.jpg
http://rkt.chem.ox.ac.uk/images/biosurfactants.jpg

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Obrana a resistence MO proti kovům
•nepřímá imobilizace kovů v prostředí
–sulfan produkovaný desulfurikačními bakteriemi vytváří nerozpustné sulfidy kovů (Ag, Cd, Hg, Ni,
Pb, Se, Zn, As …)
–enzymatická produkce fosfátů, které sráží např. Pb, Cu, Ni, U
http://www.freepatentsonline.com/6805797-0-large.jpg
http://resources.metapress.com/pdf-preview.axd?code=xhtvfyg50qgb5brj&size=largest

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Obrana a resistence MO proti kovům
•sekvestrace metalothioneiny a podobnými proteiny
–intra-buněčný mechanismus resistence u prvoků, řas, kvasinek a některých hub
–MT = LMW látky bohaté na Cys s vysokou afinitou k Cd, Zn, Cu, Ag, Hg
–jejich produkci spouští přítomnost kovu
–podobné proteiny izolovány i ze sinic a bakterií
cellstrat.gif smta2.jpg
http://www2.warwick.ac.uk/fac/sci/chemistry/research/blindauer/blindauergroup/bacterialmts/

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Obrana a resistence MO proti kovům
•odstranění z buňky aktivním transportem
–plasmidově kódován, energeticky náročný
–chemiosmotické pumpy výměny Mx+ / XH+
–ATPázové pumpy
–nejčastěji pro As, Cr, Cd

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Obrana a resistence MO proti kovům
•biometylace
–přesunutí metylové skupiny z metylcobalaminu (CH3CoB12) na kov jako např. Sn, Pb, Pt, As, Se;
metylace Hg zvýšení mobility a/nebo toxicity (As naopak)
–otravy metylAs z vlhkých tapet – metylace plísněmi
–Minamata: elementární rtuť vypouštěná v letech 1932-1970 do zálivu Minamata byla mikrobiální
aktivitou v sedimentu metylována na metylrtuť, která se jako rozpustná a biodostupná forma
akumulovala ve škeblích a rybách a dostala se tak do potravního řetězce – otravy lidí (46 úmrtí +
vrozené defekty)
–před metylací ještě muselo dojít působením H2S k přeměně na Hg2+
http://img.timeinc.net/time/photoessays/2010/top10_envt_disasters/minamata.jpg

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Obrana a resistence MO proti kovům
•biometylace
•

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Obrana a resistence MO proti kovům
•Zajímavé moderní otázky :
•Jak spolu interagují mikrobiální populace v přítomnosti kovu?
•Je možné, že resistentní populace „přenáší“ resitenci na celé společenstvo?
•Jsou například možné nějaké symbiotické interakce mezi resistentními a citlivými populacemi MO:
resistentní poskytují „ochranu“ citlivým, které je zásobí živinami či zdrojem uhlíku?

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Další interakce kovů s MO
•biochemické interakce vždy zahrnují specifické enzymy pro oxidaci, redukci, metylaci, dealkylaci a
precipitaci
•svými aktivitami MO způsobují srážení, volatilizaci, sorpci a rozpouštění kovů v prostředí
•přímá interakce – oxidace / redukce kovů (zisk energie, TEA, změna mobility kovů …)
•nepřímá interakce – MO produkuje enzymaticky sulfidy či fosfáty, které interagují s kovy – ox/red,
srážení
•kombinace – např. redukce As5+ na  As3+ v anaerobním sedimentu spojená se srážením do As2S3 díky
SRB (sulfát redukující bakterie)
•kromě negativních důsledků se toho cíleně dá využít při remediacích è přednáška na konci semestru
o biodegradaci a bioremediaci

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Další interakce kovů s MO
•redukce kovů
–Fe3+, Mn4+, Cr6+, Hg2+, As5+, Co3+, Se6+, U6+, Ag+, Mo6+, V5+ jsou
redukovány na nižší valence; může vést ke snížení toxicity:
(např. Cr6+ à Cr3+)
•oxidace kovů
–např.: Fe2+ à Fe3+; zisk energie, nebo změna mobility (As3+, Cr3+)
–ne vždy pozitivní důsledky:
•kyselé důlní vody – redukované formy kovů v rudách (např. Fe2S) jsou
MO oxidovány včetně aniotu (např. S à SO42-),
vyluhují kovy – toxicita, reaktivita
•mikrobiální koroze
•– produkce kyselin bct. či houbami nebo desulfurikační bct.
http://cool.conservation-us.org/jaic/img/jaic31-03-007-fig006.jpg

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Další interakce kovů s MO
•ne vždy pozitivní důsledky – oxidace a redukce As – mobilizace, zvýšení toxicity
•hromadné otravy milionů lidí
- Bangladéš a Bengálsko
dissimilatory arsenate reducing prokaryotes
chemolithoautotrophic arsenite-oxidizing microorganisms

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Další interakce kovů s MO


1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Další interakce kovů s MO


1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Další interakce kovů s MO
V interakce s OM – electron shuttles

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Další interakce kovů s MO


1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Další interakce kovů s MO


1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Závěrečný přehled kovů a jejich interakcí s MO


1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Použitá literatura – MO a kovy
•Maier R. M., Pepper I. L., Gerba C. P. (2000): Environmental microbiology. Chapter 17:
Microorganisms and metal pollutants (Roane T. M. and Pepper, I. L.). Academic Press. ISBN
0124975704. p. 403-423.
•Maier R. M., Pepper I. L., Gerba C. P. (2000): Environmental microbiology. Chapter 15:
Consequences of biogeochemical cycles gone wild (Herman D. C. and Maier R. M.). Academic Press.
ISBN 0124975704. p. 347-354.
•Madsen E. L. (2008): Environmental microbiology: from genomes to biogeochemistry. Chapter 7:
Microbial Biogeochemistry: a Grand Synthesis. John Wiley & Sons. ISBN 1405136472. p. 281-345.
•Madsen E. L. (2008): Environmental microbiology: from genomes to biogeochemistry. Chapter 8.3:
Biodegradation and bioremediation. John Wiley & Sons. ISBN 1405136472. p. 373-399.
•Horáková D. (2007): Bioremediace. Masarykova univerzita. ISSN 1802-128X.
http://is.muni.cz/elportal/?id=710435
•Mitchell R. (2010): Environmental microbiology. Chapter 7: Sorption and Transformation of Toxic
Metals by Microorganisms (Han X. and Gu J. D.). John Wiley and Sons. ISBN 047017790X. p. 153-176.
•Atlas R. M., Bartha R. (2009): Microbial ecology: fundamentals and applications. Chapter 13:
Microbial interactions with xenobiotic and inorganic pollutants. Benjamin/Cummings. ISBN
0805306552. p. 511-555.
•Bitton G. (2002): Encyclopedia of Environmental Microbiology – 6 volumes. John Wiley & Sons Ltd.
•
•
•
•

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Nepřeberné množství článků z problematiky


1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg
Organické kontaminanty a MO


1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg
Další polutanty a MO