1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg Adobe Systems logo_mu_cerne.gif Inovace tohoto předmětu byla spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Bi6420 Ekotoxikologie mikroorganismů https://is.muni.cz/el/1431/jaro2014/Bi6420/index.qwarp Doc. RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. hofman@recetox.muni.cz jaro 2014 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg Adobe Systems logo_mu_cerne.gif Inovace tohoto předmětu byla spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Bi6420: Ekotoxikologie mikroorganismů Část 2: MO a toxické látky Biodostupnost toxických látek pro MO v prostředí Vstup toxických látek do MO a povrchové bariéry Interakce toxikantů s mikrobiálními buňkami, obrana MO proti toxikantům, toxicita, biodegradace polutantů 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg Organické kontaminanty a MO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Interakce organických polutantů s MO •organické polutanty – velice široká skupina látek různých vlastností •jaké jsou jejich zdroje? •persistentní organické polutanty (POPs): perzistence v prostředí, bioakumulace, toxicita (PBTs) – často lipofilní, hydrofóbní látky (HOCs) •znát různé zkratky a základní organické názvosloví … 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady struktur organických polutantů http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/d/d2/2%2C4-Dichlorophenoxyacetic_acid_structure .svg/200px-2%2C4-Dichlorophenoxyacetic_acid_structure.svg.png 2,4 – D (2,4 – dichlorofenoxyoctová kyselina) http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a5/Dicamba.png/150px-Dicamba.png Dicambda http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/60/Picloram.png/200px-Picloram.png Picloram http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/73/Paraquat.svg/200px-Paraquat.svg.png Paraquat http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/8/89/Glyphosate-2D-skeletal.png/200px-Glyphosat e-2D-skeletal.png Glyphosate http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/00/Carbaryl-2D-skeletal.png/100px-Carbaryl-2D -skeletal.png Carbaryl http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/d/d3/Dimethoate_Structural_Formulae_.V.1.svg/20 0px-Dimethoate_Structural_Formulae_.V.1.svg.png Dimethoate http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a7/Tetrachloroethylene.svg/100px-Tetrachloroe thylene.svg.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/d/d8/Trikloreten.svg/120px-Trikloreten.svg.png 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady struktur organických polutantů HCB p,p' DDE p,p' DDT HCH OCPs p,p' DDD http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/02/Camphor_structure.png/100px-Camphor_struct ure.png Camphor http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/2d/Toxaphen.svg/200px-Toxaphen.svg.png Toxaphene http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/b9/DieldrinSynthesis.png/480px-DieldrinSynthe sis.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/b9/DieldrinSynthesis.png/480px-DieldrinSynthe sis.png Strukturní vzorec endrinu Endrin http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/28/Chlordane.png/200px-Chlordane.png Chlordan ALdrin Dieldrin Heptachlor Endosulfan 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady struktur organických polutantů Naftalen Acenaften Acenaftylen Fluoren Antracen Fenantren Fluoranten Chrysen Benzo(a)antracen Pyren Benzo(a)pyren Benzo(ghi)perylen Dibenzo(ah)antracen Benzo(b)fluoranten Benzo(k)fluoranten Indeno(123cd)pyren 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady organických polutantů - Meier et al. (2000) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady organických polutantů - Meier et al. (2000) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady organických polutantů - pesticidy 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Interakce organických polutantů s MO •specifikum ekotoxikologie mikroorganismů: evoluční strategie MO v kontaminovaném prostředí è interakce a transformace chemikálie s „cílem“ energetického profitu, růstu či snížení toxicity resistence è celá řada kontaminantů je transformována MO 32 https://encrypted-tbn0.google.com/images?q=tbn:ANd9GcTUBLv3WG2hQkzaVcKe-IjV9rr3qxPEkW69ecLGSl_AiYSi wrtq https://encrypted-tbn0.google.com/images?q=tbn:ANd9GcTUBLv3WG2hQkzaVcKe-IjV9rr3qxPEkW69ecLGSl_AiYSi wrtq 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Interakce organických polutantů s MO •díky dlouhé evoluci mají MO vyvinuté katabolické procesy na přírodní látky často podobné POPs (např. lignin a další biopolymery) •řada POPs v prostředí odpradávna, přirozený původ: –např. PAHs, dioxiny – hoření –chlorované uhlovodíky – biologická halogenace houbami, řasami - 3000 látek • • • • • • • •Carrying capacity - i když dané polutanty umí MO degradovat (viz výše), je jich tolik, že tato degradace nestačí – http://palaeos.com/plants/glossary/images/Lignin.gif Pentachlorophenol 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Interakce organických polutantů s MO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Interakce organických polutantů s MO •Dvě základní možnosti interakce: 1.biodegradace org. polutantů: –MO transformují molekulu org. polutantu, částečně až zcela (zmineralizují) –proces umožněný enzymy –kromě kometabolismu platí, že MO má z biodegradace benefit: •růst, biosyntéza - asimilace •energie - mineralizace •živiny (N z nitrofenolů, P z insekticidů) •snížení toxicity - detoxifikace, metabolismus •polutant je TEA •atd. –využití v biotechnologiích –dominantní poznatky – Csubstrát = Casimilovaný + Cmineralizovaný růstový výtěžek 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Interakce organických polutantů s MO •Dvě základní možnosti interakce: 2.toxicita pro MO: –obecně mají organické polutanty tendenci působit na biologické membrány (interakce s membr. fosfolipidy / proteiny) - nespecifická toxicita - narkóza (porušení integrity membrány, zvýšení její permeability) –často však také více či méně specifické reakce s dalšími receptory (genotoxicita, ox. stres …) –spíše méně poznatků, zejména chybí pro „emerging“ POPs 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Interakce organických polutantů s MO •Problematika interakcí MO a organických polutantů je úzce spjata s problematikou biodegradací a tyto dva obory (ekotoxikologie MO a biodegradace) nelze často zřetelně oddělit •další možné typy interakce obou disciplín: –toxická látka snižuje biodegradační schopnosti MO è negativní dopad na čištění prostředí –degradovatelný polutant je přítomen v takové koncentraci, která je toxická –při metabolizaci vzniká bioakumulativnější či toxičtější produkt è toxicita pro ostatní MO •TCE à vinylchlorid •fenol à PCP •aldrin à dieldrin •parathion à paraoxon •sekundární aminy à nitrosaminy http://images2.tobaccodocuments.org/batco01/w750r0/YTF70A99_p22.png?url=http%3A%2F%2Fwww2.tobaccodo cuments.org%2Fcgi%2Ftif2png.pl%3Ffn%3Dn%253A%252Ffilesets%252Fbatco01%252F%252Fy%252Ftf%252Fytf70a9 9.tif%26antialias%3D1%26page%3D22 http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/b9/DieldrinSynthesis.png/480px-DieldrinSynthe sis.png http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/b/b9/DieldrinSynthesis.png/480px-DieldrinSynthe sis.png http://www.my-personaltrainer.it/tossicologia/parathion.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biotransformace organických polutantů MO + O H O H Catabolic enzyme Catabolic gene CO2 •konstitutivní enzymy •inducibilní enzymy 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biotransformace organických polutantů MO •geny či operony kódující degradační enzymy jsou často kódovány na plasmidech •to umožňuje genetické inženýrství nových degradátorů („superbiodegradátoři“) nebo snahy urychlit kinetiku (přirozené degradace jsou pomalé) nebo vývoj biosensorů •např. Pseudomonas sp. schopné degradovat více než 100 polutantů •je také možné vymizení schopnosti (udržování selekčního tlaku při řízených bioremediacích) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biotransformace organických polutantů MO •Stejný princip jako u organických látek (celulóza, lignin …) •série degradačních kroků podmíněných enzymy: •Extracelulární - pokud je potřeba rozštěpit makromolekuly na menší látky, které mohou projít do buňky •Intracelulární - další degradace •Pokud nějaký enzym chybí - konec degradace u meziproduktu • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biotransformace organických polutantů MO a)Částečná změna (metabolizace, částečná oxidace, hydroxylace, dehalogenace …) s cílem zisku energie či obrany před toxikantem = primární biodegradace; často v anaerobním prostředí; řada enzymatických kroků b) b) b) b) b)Mineralizace – na CO2 + energie = ultimativní degradace; vede k zisku energie a/nebo živin a/nebo růstu; může v mikrobiální buňce navazovat na předchozí nebo … c) c) c) c) c)… kooperace mnoha MO v konsorciu (substrátová symbióza) d)další možnosti: polymerizace, kometabolismus Pentachlorophenol + O2 2,3,5,6-tetrachloro- hydroquinone Pentachlorophenol CO2 + H2O + HCl + O2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biotransformace organických polutantů MO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif R Glutathione Pentachloro- phenol Pentachloro- anisole Alachlor HCl Alachlor-glutathione conjugate Biotransformace organických polutantů MO Příklady biotransformace - metabolizace detoxifikace 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Catechol Phenol + CH3COOH Acetic acid Succinic acid COOH CH2 CH2 COOH COOH CH C=O CH COOH CH2 CH CH2 C=O COOH CH3 C=O COOH CH3 CHO + Pyruvic acid Acetaldehyde TCA cycle CO2 + H2O cis,cis-muconic acid 2-Hydroxy- muconic semialdehyde Biotransformace organických polutantů MO Příklad mineralizace 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biotransformace organických polutantů MO Příklad práce MO v konsorciu A chlorinated aliphatic acid 4-Chloro- benzoic acid + PCB cometabolisers Aerobic: Chlorobenzoate degraders CO2 + H2O + Cl- Chloroaliphatic degraders 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biotransformace organických polutantů MO Příklad práce MO v konsorciu Cl- Desulfomonile tiedjei DCB-1 H2 + CO2 CH3COOH Strain BZ-2 CH4 Methanospirillum sp Anaerobic: 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Příklad práce MO v konsorciu • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biotransformace organických polutantů MO •Nastává často tam, kde extracelulární enzymy vytvoří reaktivní intermediáty, které následně zpolymerizují •Důsledkem jsou nedegradovatelné látky (nerozpustné, sorbované, nejsou enzymy) Příklad polymerizace 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biotransformace organických polutantů MO •Velice často se vyskytuje tzv. kometabolismus –přestože daný polutant je pro MO nevyužitelný jako zdroj energie nebo živin (ani C), probíhá ko-oxidace jeho molekuly 1.paralelně s jiným metabolickým dějem, nebo 2.v MO je enzym, který reakci „nechtěně“ provede, nebo 3.daná molekula je potřeba pro spřažení s další reakcí např. jako TEA (potřeba další substrát – např. e- donor) –enzymy s nízkou substrátovou specifitou: oxygenázy, dehalogenázy … –často končí dead-end produktem, nebo produktem bez dalšího využití - kumulace, nebo dokonce produktem, který je toxický a inhibuje růst a aktivitu daného MO či okolních MO –příklady: cyklohexan à cyklohexanol, PCBs, chlorfenoly, 1,3,5-trinitrobenzen, alachlor, chlorbenzen à 3-chlorkatechol, parathion à 4-nitrofenol, DDT à DDE (DDD), propan à propionát (aceton), metylflorid à formaldehyd –využití při bioremediacích: přídavek bifenylu spouští degradaci PCBs 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biotransformace organických polutantů MO Kometabolismus > 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Kometabolismus - příklad – Biotransformace organických polutantů MO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Kometabolismus - příklad – Biotransformace organických polutantů MO Full-size image Comparison of reductive dechlorination with cometabolic and metabolic oxidation in terms of need for auxiliary substrates as electron donors and competing reactions (PCE: perchloroethene; TCE: trichloroethene; cDCE: cis-1,2-dichloroethene; VC: vinyl chloride; and TEA: terminal electron acceptor). The numbers indicate the order of the different respiration processes 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biphenyl dioxygenase O2 + Biotransformace organických polutantů MO •Kometabolismus - příklad – Biphenyl dioxygenase + O2 TCA cycle An aliphatic acid Benzoic acid A chlorinated aliphatic acid 4-Chloro- benzoic acid TCA cycle 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Faktory biotransformace organických polutantů MO •vlastnosti polutantu, zejména: –biodostupnost (ovlivněna též následujícími faktory + vlastnostmi prostředí) –molekulová hmotnost –struktura - stérické efekty, elektronové efekty –hydrofobicita, polarita –reaktivita –toxicita polutantu pro MO –tenze par, Henryho konstanta –rozpustnost ve vodě, rozpustnost v tucích –adsorptivita –KOW, KOC, KA –koncentraci polutantů - nízká i vysoká je špatně ovlivňují např. energetickou náročnost prvního ataku molekuly (E se spotřebovává) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Faktory biotransformace organických polutantů MO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Faktory biotransformace organických polutantů MO •biodostupnost - příklad •ve vodním prostředí hraje roli také hustota polutantu: –lehčí než voda - klesne ke dnu (nádrž, jezero, moře, ale i zvodeň) - PCBs, TCE –težší než voda - na povrchu - ropné látky, benzen •organické látky ve vodě - několik možností příjmu MO: A.příjem rozpuštěné frakce B.přímý kontakt buněk ( hydrofobní povrch buněk) C.dispergované kapičky polutantu < µm (voceán vlny, vítr x půda) D.MO produkují surfaktanty a ty zvýší rozpustnost, ale i hydrofobicitu buněk 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Faktory biotransformace organických polutantů MO •vlastnosti polutantu - příklady: vliv struktury - sterické efekty •větvení, funkční skupiny - čím více a větší tím pomalejší degradace - vliv na vstup do reakčního místa či přestup přes membránu • Fig. 2. Left: tetrameric structure of halohydrin dehalogenase. The yellow regions are the places where substrate enters the active sites. Right: close up of the halide-binding region. In this picture it is occupied by the azido-group (blue) of 1-p-nitrophenyl-2-azido-ethanol (green), which is bound in the active site. The catalytic triad residues are shown on top (pink). Bottom: the halide-binding loop (grey and marine) and a water molecule. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Faktory biotransformace organických polutantů MO •vlastnosti polutantu - příklady: vliv struktury - elektronové efekty •substituenty mohou být e- donory (CH3) či akceptory (Cl) •změní elektronové hustoty v reakčním místě: zvyšující e- hustotu zvýší degradaci, snižující e- hustotu sníží degradaci • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Faktory biotransformace organických polutantů MO •vlastnosti polutantu - příklady: vliv struktury Rapidly degraded Slowly degraded CH3CH2 Propham Propachlor 4-phenylbutyric acid 2-phenylbutyric acid http://0.tqn.com/d/chemistry/1/0/P/T/1/octane.png http://www.carexcanada.ca/img/benzene.png http://www.precisioncleaning.com/images/trichloroethylene_molecule.jpg http://www.foxriverwatch.com/pcb_molecule_1sm.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Faktory biotransformace organických polutantů MO •vlastnosti polutantu - příklady: vliv pozice substituentů – – – – – – – – – – –Biodegradabilita chlorovaných fenolů: 2,4 > 4 > 3,5 > 2,6 > 3 nebo 5 nebo 2 –trichlorfenoly 2,3,6-, 2,4,5-, 3,4,5- biodegradabilní pouze za aerobních podmínek Rapidly degraded Slowly degraded Methoxychlor DDT 2,4,5-trichloroacetic acid (2,4,5-T) 2,4-dichloroacetic acid (2,4-D) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Faktory biotransformace organických polutantů MO •vlastnosti polutantu - příklady: vliv MW • • • • • • • • • • • • • •Pozn.: Ačkoliv rychlost degradace v sedimentech klesá s rostoucí molekulovou hmotností, rostoucí tendence vysokomolekulárních PAHs k adsorpci vyrovnává tento děj • Rapidly degraded Slowly degraded Time Degradation of PAHs in a soil Bakterie jsou schopny za přítomnosti jiného, využitelného zdroje uhlíku biokonverze výšekondenzovaných PAHs Ve směsné mikrobiální populaci byla pozorována značná degradace multijaderných PAHs 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Faktory biotransformace organických polutantů MO •schopnosti a stav MO, společenstva •enzymatická výbava, genetická výbava •typ metabolismu •schopnosti přijmout polutant do buňky •stavu buňky •„aklimatizace“ (lag fáze) –dřívější „zkušenost“ s danou látkou či jejím přírodním analogem –schopnost adaptace, mutace, genový transfer –čas nutný k indukci biosyntézi enzymů •vlastnostech celého konsorcia – návaznost metabolických drah - komenzalismus, synergismus Bacterial degradation Fungal degradation Time Degradation of phenanthrene in a soil by bacteria and fungi Evolution of pyrene catabolism for 50 mg pyrene kg-1 (A), 2 x 50 mg pyrene kg-1 (B) and 4 x 50 mg pyrene kg-1 (C) amendments, over 0 (s), 4 (�), 8(™) and 12(q) weeks soil-pyrene contact time. Error bars are the SEM of n=3. A B C lag 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://scielo.isciii.es/img/revistas/im/v7n3/03-Diaz-Fig2.gif Faktory biotransformace organických polutantů MO •faktory prostředí •vše, co ovlivní biodostupnost/osud látky •pH, T, kyslík, substrát (např. dostupný zdroj C), živiny (C/N/P - 100/10/1) •přítomnost dalších látek – kosubstráty, TEA apod. •potřeby MO - zejména dostatek vody (aw > 0,96 pro bct a > 0,7 pro houby) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Faktory biotransformace organických polutantů MO •zásadní rozdíl mezi •anaerobní –podmínky bez kyslíku (např. sedimenty) –pomalá, delší aklimatizace –menší spektrum metabolických cest –v ideálním případě produkce CH4 a CO2 (jako v ČOV) –často ve spojitosti s redukčními pochody - reduktivní dehalogenace; např. propojení s denitrifikací, redukcí železa, desulfurikací • •aerobní –prostředí s kyslíkem –rychlejší, nutný např. pro vysoce redukované polutanty (alkany > C16) –vznik kyslíkatých meziproduktů –nutná určitá struktura POPs - např. halogenace brání v přístupu enzymů štěpících aromatický kruh - kombinace aero- a anaero- v bioremediaci http://www.tut.ac.jp/english/newsletter/archive/no2/research_highlights/img/research01_img_00L.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Faktory biotransformace organických polutantů MO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Faktory biotransformace organických polutantů MO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Faktory biotransformace organických polutantů MO •často zapojeno více kroků •kombinace aero-/anaero-bních podmínek (i záměrně) 178 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Základní mechanismy biotransformace org. polutantů MO •dealkylace: odštěpení alkylu •dealkoxylace: odštěpení alkoxy skupiny •dekarboxylace: -COOH à -COH nebo -COOH à -CH •štěpení etherů •hydrolýza: adice vody à -OH či -COOH •oxidace: -OH à -COH či -COOH nebo epoxid •hydroxylace: připojení -OH •epoxidace •methylace: vznik methyletherů •vznik nebo štěpení aromatického kruhu (např. aromatická oxidace) •redukce: např. -NO2 à -NH2 •dehalogenace: -X à -H (hydrolitická, reduktivní, dehydrodehalogenace) • http://www.annualreviews.org/na101/home/literatum/publisher/ar/journals/content/micro/1996/micro.19 96.50.issue-1/annurev.micro.50.1.553/production/images/medium/mi50_0553_1.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Základní mechanismy biotransformace org. polutantů MO Hydrolýza 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Štěpení benzenového jádra Základní mechanismy biotransformace org. polutantů MO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace alkanů •podoba s metabolismem mastných kyselin – β-oxidace •optimální degradace je u n-alkanů C10-C18 (vyšší malá rozpustnost ve vodě, nižší možná toxicita – butan) •proces vysoké BOD •větvené – horší degradace •metylace obecně snižuje degradabilitu • •v anaerobních podmínkách velice těžko odbouratelné (ropa před vytěžením nedegraduje i když v ní žijí MO …) • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace alkenů •podobná degradovatelnost jako alkanů •atak koncové nebo n-1 metylové skupiny, nebo atak dvojné vazby vedoucí k alkoholu či epoxidu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace alifátů v anaer. podmínkách • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace cykloalkanů •není korelace mezi biodegradací n-alkanů a n-cykloalkanů •dosti často kometabolická degradace a komenzalismus •OH, C=O, COOH substituce zvyšují rychlost, alkyl- skupiny snižují 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace BTEX 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace PAHs •bakterie •dioxygenázy è cis-dihydrodioly è katechol a protokatechová kyselina (3,4-dihydroxybenzoová kyselina) nebo kyselina gentisová (2,5-dihydroxybenzoová kyselina) •dále rozštěpení benzenového jádra (orto- nebo meta-) za vzniku kyseliny octové, jantarové nebo fumarové a pyrohroznové, které vstupují do Krebsova cyklu •mikrobiální degradace dobře známa u naftalenu, antracenu, BaP a fenantrenu, degradační mechanismy ostatních PAHs jsou většinou neznámy •při detoxifikaci konjugace s GSH 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace PAHs •bakterie •příklady látek identifikovaných po metabolizaci pyrenu Mycobacterium sp. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace PAHs •houby •enzymatický systém cytochromu P-450 monooxygenázy è trans-dihydrodiol cestou arenoxidových meziproduktů •případně vzniká fenol, který je konjugován (s sulfáty, glukuronovou kyselinou, GSH) a vyloučen či podléhá za účasti enzymatického systému cytochromu P450 epoxidaci •white-rot fungi - kompletní mineralizace na CO2 a vodu •Epoxid - elektrofilní molekula schopná vazby na nukleofilní DNA a RNA à genotoxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace PAHs •houby nrmicro2519-f4 An example of fungal polycyclic aromatic hydrocarbon biodegradation: the biochemical pathway and products reported for the co-metabolic fungal degradation of benzo[a]pyrene. Note that the epoxide intermediates that arise from initial intracellular attack by cytochrome P450s and precede the formation of hydroxylated products are not shown dead-end produkt 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace PAHs 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace PAHs •Faktory ovlivňující mikrobiální degradaci PAHs: •Předcházející expozice - delší expozice MO PAHs à adaptace; větší míra degradace v kontaminovaných prostředích •Chemická struktura - PAHs s nižší Mr degradovány rychleji ; alkylace PAHs inhibuje degradaci •Dostupný kyslík - molekulární kyslík nezbytný pro degradaci PAHs; za anaerobních podmínek probíhá degradace velmi pomalu, pokud vůbec •Dostupné živiny - limitující v prostředí, kde je hodně organického odpadu (N,P); jiné zdroje C degradace PAHs až po spotřebování C •Teplota, pH, salinita - slabě probíhá degradace v zimě; rychleji při pH = 8 než pro pH = 5 • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace ropných látek •surová ropa - komplexní směs uhlovodíků (alifatické, aromatické, asfalt) •n-alkany, rozvětvené alkany, cykloalkany, aromáty - degradovatelnost viz výše •asfalt, kerogen - sloučeniny nedegradovatelné nebo velmi pomalu •ropné pryskyřice - omezená mikrobiální degradace •lehká ropa –10-40% degradovatelných alkanů –2-20% lehkých aromatických uhlovodíků –2-10% vysokomolekulárních těžce degradovatelných polyaromátů –1-5% asfaltických látek a ropných pryskyřic •těžká ropa –< 1% odbouratelných alifátů –< 2% lehkých aromatických uhlovodíků –až 35% vysokomolekulárních těžce degradovatelných polyaromátů –až 25% asfaltických látek a 20% ropných pryskyřic http://www.theblogismine.com/wp-content/uploads/2010/06/Scientists-find-bacteria-that-can-clean-oil -spill-4-570x334.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace ropných látek •žádná surová ropa není zcela degradována •na procesech biologické degradace ropných látek se podílí více než 70 rodů MO •většina těchto rodů je všeobecně rozšířena, ale platí: ekosystémy nekontaminované ropnými uhlovodíky - málo degradátorů ropných uhlovodíků x prostředí ropnými uhlovodíky kontaminované - vysoké počty •nejvýznamnější degradátoři ropy: rody Pseudomonas, Achromobacter , Arthrobacter, Acinetobacter, Flavobacterium, Brevibacterium, Corynebacterium, Flavobacterium, Nocardia, Candida, Rhodotorula a Sporobolomyces •ve vodě bakterie a kvasinky, v půdách rovněž houby (např. Penicillium) •MO degradující ropné uhlovodíky produkují často emulzifikační látky http://www.nature.com/nrmicro/journal/v4/n3/images/nrmicro1348-f4.jpg http://www.open.edu/openlearn/files/ole/ole_images/graphs-and-diagrams/labelled-diagrams/the-marine -bacterium-alcanivorax-feeds-on-oil/the%20marine%20bacterium%20alcanivorax%20feeds%20on%20oil_0.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace ropných látek 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace nitrolátek 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •přítomnost 2, 3 a více Cl zpomaluje aerobní degradaci •problém nastává např. při degradaci aromatických látek, kdy adice hydroxylu na katechol či dihydroxybenzen vyžaduje nesubstituované uhlíky na štěpené vazbě (halohen je ale blokuje) •méně-chlorované jsou lépe degradovány v aerobních podmínkách a více-chlorované v anaerobních Příklad - mikrobiální degradace halogenovaných OPs 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1.dehalogenace substitucí –hydrolytická – 2.dehalogenace oxidací – monooxygenázy či dioxygenázy oxidují vysocechlorované látky typu TCE – kometabolismus (enzymy mají širokou substrátovou specifitu, typicky oxidují metan, amoniak, toluen, propan) • Příklad - mikrobiální degradace halogenovaných OPs 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif –3. Reduktivní dehalogenace –v anaerobnim prostředí, ale také v aerobním, pokud má chlorovaná látky větší redukční potenciál než O2 (hexachloretan, dibromoetan) –první krok: e- z redukovaného kovu se přesune na alifát è alkyl-radikál a odštěpí se volný halogen; alkyl-radikál buď naváže vodík, nebo ztrácí další chlor a vzniká dvojná vazba – – • Příklad - mikrobiální degradace halogenovaných OPs http://ars.sciencedirect.com/content/image/1-s2.0-S0958166911000309-gr1.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace halogenovaných OPs •Reduktivní dehalogenace - 2 základní varianty 1.Eliminace dvou halogenů za vzniku = vazby (dihaloeliminace) 2. 2. 2. 2. 2.Hydrogenolysis - alkylová, arylová 3. 1,2-Dichloroethane 2e- 2Cl- Ethylene Tetra(per)chloroethylene 2H+ HCl Trichloroethylene 2,3,5,6-tetrachloro- hydroquinone 2H+ HCl 2,3,5-trichlorohydro- quinone 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace halogenovaných OPs 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace halogenovaných OPs 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace chlorfenolů •dominují aerobní a anaerobní biodegradační procesy: oxidační procesy působením monooxygenáz a hydroxyláz; redukční dehalogenace působením dehalogenáz • •biodegradabilita klesá v tomto pořadí: •2,4 > 4 > 3,5 > 2,6 > 3 nebo 5 nebo 2 •trichlorfenoly 2,3,6-, 2,4,5-, 3,4,5- jsou biodegradabilní pouze za aerobních podmínek •méně chlorované fenoly, včetně monochlorovaných jsou více rezistentní než pentachlorfenol (PeCP) vůči biodegradačnímu potenciálu aklimatizované PeCP degradující bakteriální kultury •v tomto případě zvýšení stupně chlorace nevede ke zvýšení perzistence •obecně ale lze potvrdit, že chlorace v pozicích 3 a 5 zvyšuje perzistenci • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace PCBs 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace DDT p, p´-DDT (4,4’-DDT) = 1,1,1-trichlor-2,2-bis(4-chlorfenyl)ethan p,p´-DDE = 1,1-dichlor-2,2-bis(4-chlorofenyl)ethylen p,p´-DDD = 1,1-dichloro-2,2-bis(4-chlorophe-nyl)ethane 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace HCHs •Izomery HCH jsou relativně chemicky stálé látky lipofilní povahy. •Postupnou mikrobiální dechlorací jsou převáděny na trichlorbenzeny a tetrachlorbenzeny • http://accessscience.com/loadBinary.aspx?aID=7020&filename=YB040960FG0020.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace CBs http://umbbd.msi.umn.edu/cb/cb_map.gif http://riodb.ibase.aist.go.jp/dbefc/nirefate/bio/CBZs.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace dioxinů 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace 2,4-D a 2,4,5-T 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace atrazinu •heterocykly obecně: •hůře degradovatelné než analogické látky pouze s C •degradovatelnost klesá s počtem heteroatomů • http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/1/1e/Cyanuric_acid.png/250px-Cyanuric_acid.png 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad - mikrobiální degradace carbarylu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Degradace organických polutantů houbami nrmicro2519-f2 The classification of Fungi, the major organic chemicals that are degraded by various fungal phyla and subphyla, and the important ecological characteristics of these fungi. Taxa that are relevant for the bioremediation of organic chemicals are bold. The less relevant ascomycete and basidiomycete subphyla Taphrinomycotina and Ustilaginomycotina, respectively, are omitted. The number of genera in each taxonomic group with alkane, biphenyl, coal tar, coal tar oil, crude oil, dibenzothiophene, diesel, polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) and toluene degraders are given in parentheses. BTEX, benzene, toluene, ethylbenzene and xylenes; EDCs, endocrine disrupting chemicals; MTBE, methyl-tert-butylether; PCBs, polychlorinated biphenyls; PCDDs, polychlorinated dibenzo-p-dioxins; PCDFs, polychlorinated dibenzofurans; RDX, Royal Demolition Explosive; TNT, 2,4,6-trinitrotoluene. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Degradace organických polutantů houbami nrmicro2519-f3 Although fungi primarily co-metabolize organic pollutants, they do grow on some aliphatic or aromatic compounds, including volatile organics. Initial pollutant attack may occur extracellularly or intracellularly. Metabolites generated during extracellular pollutant oxidation may be subject to intracellular catabolism or may form bound residues of soil constituents. Metabolites arising from intracellular initial attack may be excreted and can then either undergo further extracellular enzymatic reactions or form bound residues through abiotic oxidative coupling. They may also be secreted in the form of conjugates (which usually persist) or may undergo further intracellular catabolism. This may result in mineralization or, again, in metabolite excretion at various oxidation stages if subsequent oxidation is impeded. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Degradace organických polutantů houbami •pomáhají extracelulární nespecifické enzymy z řady peroxidáz a laccáz, které houby produkují při rozkladu ligninu •biodegradace vzrůstá při nedostatku N •white rot fungi (např. Phanerochaete chrysosporium) •= degradace řady polutantů: BTEX, DDT, PCBs, CPs, dioxinů, PAHs, nitroPAHs, 2,4-D, 2,4,5-T, TNT, RDX, pesticidy, • http://database.portal.modwest.com/show_file.php?&table=organism&datafield=organism_image_1&id=1108 &sig=2239eb4e713ff00da267acf9c71df7062702e93d 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Degradace organických polutantů houbami 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Degradace organických polutantů houbami vs. bct 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Závěrečný přehled látek a jejich biodegradovatelnosti MO 180 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Závěrečný přehled látek a jejich biodegradovatelnosti MO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Závěrečný přehled látek a jejich biodegradovatelnosti MO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Závěrečný přehled látek a jejich biodegradovatelnosti MO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biodegrace org. polutantů – neustálý rozvoj poznatků 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Efekty organických polutantů na buňky MO •narušení integrity a fluidity membrány (důsledky: ztráta důležitých látek z buňky, vstup dalších polutantů …) •interakce s procesy a gradienty na membráně (např. chinony – přenos e- při respiraci) •interakce s biologickými molekulami (většinou po aktivaci ) – DNA, proteiny •interakce s receptory (membránovými či jadernými) •oxidativní stres (např. chinony) – oxidace makromolekul (NA, proteiny), peroxidace membránových lipidů • E3 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Efekty organických polutantů na buňky MO - příklad •Aromatické látky toxické pro MO –ve vodě rozpustná frakce rafinovaných ropných produktů (více toxické než tato frakce ze surové ropy - méně NAP a alkyl-NAP) - toxicita pro heterotrofické i autotrofické MO •Zejména po metabolizaci (aktivaci) jsou vysoce reaktivní: –mohou se vázat a vytvářet kovalentní adukty s životně důležitými makromolekulami, jako jsou celulární proteiny, DNA apod. –interkalace v DNA –podobně působí chinony, aza-PAHs, nitro-PAHs E3 E3 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Použitá literatura – MO a organické polutanty •Maier R. M., Pepper I. L., Gerba C. P. (2000): Environmental microbiology. Chapter 16: Microorganisms and organic pollutants (Maier R. M.). Academic Press. ISBN 0124975704. p. 363-402. •Madsen E. L. (2008): Environmental microbiology: from genomes to biogeochemistry. Chapter 7: Microbial Biogeochemistry: a Grand Synthesis. John Wiley & Sons. ISBN 1405136472. p. 281-345. •Madsen E. L. (2008): Environmental microbiology: from genomes to biogeochemistry. Chapter 8.3: Biodegradation and bioremediation. John Wiley & Sons. ISBN 1405136472. p. 373-399. •Madsen E. L. (2008): Environmental microbiology: from genomes to biogeochemistry. Chapter 8.5: Evolution of catabolic pathways for organic contaminants. John Wiley & Sons. ISBN 1405136472. p. 403-409. •Mitchell R. (2010): Environmental microbiology. Chapter 8: Bioremediation of Hazardous Organics (Becker J. G. and Seagren E. A.). John Wiley and Sons. ISBN 047017790X. p. 177-212. •Atlas R. M., Bartha R. (2009): Microbial ecology: fundamentals and applications. Chapter 14: Biodegradability testing and monitoring the bioremediation of xenobiotic pollutants. Benjamin/Cummings. ISBN 0805306552. p. 556-598. •Horáková D. (2007): Bioremediace. Masarykova univerzita. ISSN 1802-128X. http://is.muni.cz/elportal/?id=710435 •Harms, H., D. Schlosser, and L. Y. Wick. 2011. Untapped potential: exploiting fungi in bioremediation of hazardous chemicals. Nature Reviews Microbiology 9, 177-192. •Colwell R. R. (1978): Toxic effects of pollutants on microorganisms. In Principles of Ecotoxicology (ed. G. C. Butler). John Wiley & Sons. http://dge.stanford.edu/SCOPE/SCOPE_12/SCOPE_12_3.7_chapter13_275-294.pdf •Bitton G. (2002): Encyclopedia of Environmental Microbiology – 6 volumes. John Wiley & Sons Ltd. • • • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://umbbd.msi.umn.edu/ http://umbbd.msi.umn.edu/chx/chx_map.gif Gao J, Ellis LBM, Wackett LP (2010) "The University of Minnesota Biocatalysis/Biodegradation Database: improving public access" Nucleic Acids Research 38: D488-D491 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg Další toxikanty a MO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Další toxikanty a MO •halogeny •silná oxidovadla (H2O2,KMnO4) •barviva •syntetické tenzidy •některé plyny • •využívání pro desinfekci, ale úniky do prostředí poškozují přírodní populace MO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Povrchově aktivní látky •hydrofilní a hydrofobní část molekuly – snižují povrchové napětí – tenzidy –anionaktivní (mýdla) –kationaktivní –neionogenní •Anionaktivní •ve vyšších koncentrací poškozují cytoplazmatickou membránu, způsobují denaturaci bílkovin •při nižších koncentracích pronikají do buňky a ovlivňují metabolizmus •Kvarterní amoniové soli •působí baktericidně (především na G+, méně na G-), fungicidně, amoebicidně, virucidně • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Halogeny •zejména chlór - chlornany (-OCl) a chloraminy (Cl-NH2) •nejpoužívanější technologie čištění pitné a odpadní vody •silné oxidační činidlo •Cl2 tvoří ve vodě: – Cl2 + H2O à HOCl + HCl – HOCl à -OCl- + H+ = volně dostupný chlór •v prostředí se váže na amoniak či organické látky = vázaný chlór •chloraminy jsou méně efektivní než volně dostupný chlór •působí na vegetativní i klidová stadia bakterií, virů i prvoků –mění permeabilitu membrány – únik důležitých látek v buněk –interferuje s ději na membráně – fosforylace –nevratné vazby na SH skupiny enzymů a proteinů –denaturace NA •Br, I – substituce tyrosylu a histidylu, oxidace SH http://www.mpipks-dresden.mpg.de/mpi-doc/quantumchemistry/ChemieAlltag/Histidin/histidin-formel.jpe g http://psychotropicon.info/wp-content/uploads/2011/02/L-Tyrosin.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Halogeny 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Chemoterapeutika •selektivní účinek •inhibice procesů biosyntézy koenzymů, bílkovin a NA •strukturálními analogy esenciálních látek s větší afinitou k daným enzymům •isonikotinylhydrazid à pyridoxin •kyselina p-aminosalycilová à kyselina salycilová •sulfonamidy à kyselina p-aminobenzoová (PABA) • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Antibiotika •neřízené používání v živočišné výrobě + vstupy z komunálních odpadních vod a jejich kalů (spolu s dalšími farmaceutiky) •negativní efekty na přirozené populace MO • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Antibiotika 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Použitá literatura – MO a další toxikanty •Maier R. M., Pepper I. L., Gerba C. P. (2000): Environmental microbiology. Chapter 23: Disinfection (Gerba C. P.). Academic Press. ISBN 0124975704. p. 547-552. •Madsen E. L. (2008): Environmental microbiology: from genomes to biogeochemistry. Chapter 8.7: Antibiotics resistance. John Wiley & Sons. ISBN 1405136472. p. 423-434. •Bitton G. (2002): Encyclopedia of Environmental Microbiology – 6 volumes. John Wiley & Sons Ltd. • • • •