Laboratorní praktikum
z ekotoxikologie mikroorganismů
doc. RNDr. Jakub Hofman, Ph.D.
Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí
Masarykova Univerzita, Přírodovědecká fakulta
Brno, Česká Republika
2014
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
2
Obsah
1 CÍLE PRAKTIKA ............................................................................................................................ 3
2 BEZPEČNOST PRÁCE V LABORATOŘI ..................................................................................... 4
3 MATERIÁL A POMŮCKY .............................................................................................................. 6
4 ORGANIZACE CVIČENÍ ................................................................................................................ 7
5 POUŽITÁ PŮDA............................................................................................................................. 8
6 STANOVENÍ MIKROBIÁLNÍ BIOMASY - CBIO .............................................................................. 9
7 STANOVENÍ BAZÁLNÍ RESPIRACE - BR.................................................................................. 11
8 SUBSTRÁTEM INDUKOVANÁ RESPIRACE – SIR ................................................................... 12
9 POTENCIÁLNÍ OXIDACE AMONIAKU – PAO ........................................................................... 13
10 AMONIFIKACE ARGININU – PAMO........................................................................................... 15
11 NÁVOD NA PRÁCI S SW CLARITY............................................................................................ 17
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
3
1 Cíle praktika
Cílem tohoto praktika je naučit se postupy pěti metod, které se hojně používají
v mikrobiální ekotoxikologii půdy a to jak v biomonitoringu při bioindikaci půdní
kvality, tak při testech toxicity, které jsou nenahraditelné při hodnocení rizik
chemických látek, pesticidů, hnojiv, odpadů, kalů, kontaminovaných půd a
sedimentů. Postupy, s nimiž se seznámíte, vychází z následujících standardů a
reflektují dosavadní zkušenosti výzkumníků centra RECETOX s nimi.
 ISO 14240-1 (1997): Soil quality – Determination of soil microbial biomass.
Part 1: Subtrate-induced respiration method. International Organization for
Standardization, Geneve, Switzerland.
 ISO 14240-2 (1997): Soil quality - Determination of soil microbial biomass Part
2: Fumigation-extraction method. International Organization for
Standardization, Geneve, Switzerland.
 ISO 16072 (2002): Soil quality - Laboratory methods for determination of
microbial soil respiration. International Organization for Standardization,
Geneve, Switzerland.
 ISO 15685 (2004): Soil quality - Determination of potential nitrification - Rapid
test by ammonium oxidation. International Organization for Standardization,
Geneve, Switzerland.
 ISO/TS 14256-1 (2003): Soil quality. Determination of nitrate, nitrite and
ammonium in field-moist soils by extraction with potassium chloride solution Part
1: Manual method. International Organization for Standardization.
 Amonifikace argininu nemá ISO standard, ale vychází z postupu uvedeného
v kompendiu standardních metod půdní mikrobiologie a biochemie Alef, K.
and Nannipieri P. (1995): Metods in Applied Soil Microbiology and
Biochemistry, Academic Press London, pp. 238-240.
Na začátku praktika budete podepisovat, že jste byli pro účely cvičení proškoleni o
bezpečnosti práce v laboratoři a pro práci s chemickými látkami. Před zahájením
praktika si tedy důkladně prostudujte kapitolu 2. Bez tohoto podpisu nemůžete
praktikum absolvovat.
Prostudujte si, prosím, pečlivě všechny návody k úlohám. Materiál a metody si
projděte, ale nemusíte jim věnovat příliš pozornost, vše pro vás bude v laboratořích
nachystáno.
Během praktika si dělejte poznámky a zapisujte zejména všechny detaily
k prováděným postupům a výsledkům. Kdykoliv něco nevíte, zeptejte se vyučujících
a pamatujte na úsloví „dvakrát měř a jednou řež“. Některé části se provádí společně,
ale většinu jednotlivých metod budete provádět samostatně.
Na konci cvičení odevzdáte protokoly z celého cvičení, na základě nichž a na
základě vaší docházky do praktik dostanete zápočet.
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
4
2 Bezpečnost práce v laboratoři
 Následující pokyny nenahrazují pokyny závazné v rámci PřF MU
(http://www.rect.muni.cz/nso/ sekce chemické látky + učivo předmětu C7777), jste
povinni si je prostudovat, znát je a dodržovat je.
 Hlavní zásadou při práci se škodlivými látkami a přípravky je preventivně se
vyvarovat všech možností vzniku otrav (vyloučit přímý kontakt s těmito látkami),
použít všech nezbytných ochranných prostředků (plášť a rukavice, případně
ochranné brýle, obličejový štít, maska atd.) a dodržovat všechny další bezpečnostní
předpisy.
 Před vlastní manipulací s chemickými látkami a kontaminovanou půdou budete
upozorněni vyučujícím na případná rizika, způsob manipulace a osobní ochrany
zdraví. I přesto si můžete prostudovat bezpečnostní pokyny k těmto látkám v některé
z internetových databází (např. www.atsdr.cdc.gov; www.inchem.org;
www.tera.org/iter; www.piskac.cz/ETD; extoxnet.orst.edu; toxnet.nlm.nih.gov)
 Jste povinni pracovat v plášti a rukavicích se všemi chemikáliemi a roztoky v praktiku
a s kontaminovanou půdou, protože obsahuje kadmium.
 Chemické látky a roztoky, na které je třeba dbát zvýšenou opatrnost jsou vyznačeny
v přehledu chemikálií u každé metody.
 Do laboratoře si nenoste oblečení ani zavazadla, nechte je ve skříňkách na chodbě.
V laboratoři nesmíte konzumovat jídlo, pít nápoje a kouřit.
 S rukavicemi na rukou se nesmí opustit laboratoř. V laboratorním oděvu se nesmí
konzumovat jídlo a pití ani mimo laboratoř.
 Před započetím prací v laboratořích budete seznámeni, kde jsou prostředky první
pomoci a hasicí přístroje. Tato místa si zapamatujte.
 Studentky v jiném stavu nesmí navštěvovat praktika.
 Při pipetování využívejte mikropipet či skleněných pipet s násadci a nikdy nepipetuje
ústy.
 Při rozsypání nebo rozlití škodlivé látky je nutno okamžitě zajistit její zneškodnění a
informovat vyučujícího.
 Kyseliny nedávejte výše, než máte ramena (max. 165 cm).
 Při zřeďování se vždy lije kyselina do vody a nikdy naopak. Kyselina se nalévá
pomalu a opatrně, zvláště kyselina sírová.
 Při rozpouštění tuhého hydroxidu se musí sypat hydroxid po malých částech do vody
za stálého míchání. Nikdy se nenalévá voda na hydroxid.
 Rozlité kyseliny, zejména koncentrované, je třeba nejprve opatrně zředit vodou,
mírně zneutralizovat posypáním uhličitanem (např. soda, křída apod.) nebo politím
zředěnými roztoky alkálií, následuje opatrné spláchnutí vodou nebo tekutinu necháme
vsáknout do pilin, hadrů, apod. Při asanaci je nutno dbát na to, aby se nezamořila
příliš velká plocha.
 Jakékoliv manipulace s látkami dýmavými, dráždivými, zapáchajícími a toxickými
plyny se smějí provádět jedině v digestoři.
 Při všech manipulacích s látkami ve zkumavkách a otevřených nádobách musí být
ústí nádob odvrácené od pracovníků do volného prostoru.
 Zátky lahví se nesmějí pokládat potřísněnou plochou na desku stolu (snížení
možnosti poleptání, otravy a kontaminace).
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
5
 Odpady ze cvičení obsahující chemické látky likvidujte způsobem dle pokynů
vyučujícího. Nikdy je nevylévejte bez porady do výlevky a neodhazuje do koše.
Kontaminovanou půdu ukládejte do určených nádob.
 Co nejdříve po práci umyjte veškeré používané sklo náležitým způsobem = detergent
(lázeň + štětka, horká voda, destilovaná voda, sušárna) a vraťte je na své místo.
Plasty dle pokynů vyučujícího buď vyhazujte do odpadů, nebo umývejte. Stejně tak
další materiál a pomůcky po práci vracejte na své místo.
 Při úrazu jste povinni jej nahlásit vyučujícímu.
 S přístroji zacházejte opatrně a podobně také se sklem - vždy lépe pomalu a
promyšleně, než rychle a bez uvážení.
 Manipulace s tlakovými lahvemi a redukčními ventily je povolena jen v přítomnosti a
pod dozorem vedoucího praktika.
 Při potřísnění kůže žíravými látkami co nejdřív začněte oplachovat postižené místo
dostatkem teplé vody (asi 30 - 35º C) po dobu 10 – 15 min. Informujte vyučujícího.
 Při zasažení očí chemickými látkami, zejména žíravými, vyplachujte oči 10 – 15 min
proudem vody či fyziologického roztoku. V laboratoři jsou k dispozici oční sprchy pro
tento případ nehody. Informujte vyučujícího.
 Při náhodném požití chemikálií vyvolejte zvracení, vypijte dostatečné množství vody a
opět vyvolejte zvracení (nesmí se použít při požití žíravin či tenzidů). Následně užijte
aktivní uhlí z lékárničky – použijte desetinásobek předpokládaného požitého množství
chemikálie. Informujte vyučujícího.
Potvrzuji svým podpisem, že jsem porozuměl(a) školené tématice, že jsem
absolvoval(a) předmět C7777 maximálně před 12 měsíci a že je mi známa
odpovědnost za případné nedodržení či vědomé porušování uvedených pravidel.
Jméno a příjmení UČO Podpis
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
6
3 Materiál a pomůcky
 destilovaná voda
 sada mikropipet různých objemů
 váhy s přesností 0,1 g; třepačky; sušárna; centrifuga; exsikátor; olejová vývěva;
mikrodestičkový spektrofotometr; byreta; dávkovače kyselin
 inkubátor; lednice; mrazák
 plynový chromatograf s teplotně vodivostním detektorem, kolonou GasPro a mobilní
fází He; chromatografická stanice Clarity; injekční stříkačka 1 ml s jehlou; systém na
měření respirace od firmy Labicom
 infuzní láhve objemů 120 či 150 ml; pryžové zátky
 běžné laboratorní sklo - odměrné baňky, válce a kádinky různých objemů; nálevky;
uzavíratelné sklenice různých objemů
 polypropylenové zkumavky 15 ml s víčky; mikrodestičky
 filtrační papíry archy a kruhové výseče FILTRAK 391 (či analogické); laboratorní
papírové ubrousky
 běžné laboratorní pomůcky – lžičky, kopistky, váženky, alobal, potravinářská fólie,
parafilm, špičky na pipety; pasteurky; fixy, lepicí páska, nůžky, střičky s vodou a lihem
 pryžové rukavice – latexové a vinylové; respirátory
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
7
4 Organizace cvičení
Filosofií praktika je maximálně samostatná práce studentů. Pro úsporu času při
cvičení je však kontaminovaná půda je připravena vyučujícím (viz další kapitola) a
také většina roztoků a činidel je již dopředu připravena. Pro cvičení je vytvořen
časový harmonogram, který je předán studentům na začátku praktika. Harmonogram
se může lišit podle počtu dnů praktika a počtu skupin studentů. Metody jsou
rozděleny na logické kroky. Skupiny studentů by měly jednotlivé kroky provádět
efektivně a co nejrychleji, aby neblokovaly ostatní skupiny. V případě, že vzniká
prodleva mezi dvěmi kroky metody (např. inkubace vzorků definovaný čas), využívá
skupina tento čas na práci na jiné metodě (takto je navržen i harmonogram).
Podobně tak, pokud je blokován nějaký přístroj jinou skupinou, využívá čekající
skupina čas na realizaci úkolů dalších metod.
Každá skupina vypracuje protokoly pro všechny metody obsahující stručný
popis cíle úlohy, popis případných odchylek postupu od návodů, přehledné
výsledky včetně grafické podoby, komentář výsledků, odpovědi na stanovené
otázky.
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
8
5 Použitá půda
Pro účely cvičení je použita travní půda ze sadu, která není kontaminovaná a
vykazuje optimální hladiny mikrobiální biomasy i jejích aktivit.
Tato půda má maximální vodní kapacitu 0,69 ml/gsuš.
Půda byla odebrána na jaře 2014. Byla přesáta přes síto 2 mm. Tři týdny před
cvičením byla půda ovlhčena na 60% maximální vodní kapacity půdy a to buď
destilovanou vodou (varianta kontrolní – K) nebo roztoky CdCl2 v destilované vodě
tak, aby finální koncentrace kadmia v půdě byla 100 či 1000 mg/gsuš. (varianty Cd100
a Cd1000). Po přídavku vody či roztoků kadmia byla půda velmi důkladně
promíchána, přičemž byla do půdy také vmíchána mletá vojtěška jako zdroj C a N a
to v množství odpovídajícím 1 mg uhlíku vojtěšky na 1 gsuš. půdy. Takto bylo
připraveno 450 gramů půdy od každé varianty. Půda byla skladována v uzavřených 2
litrových lahvích ve 22 °C a pravidelně provětrávána.
Tato půda s vlhkostí na 60% maximální vodní kapacity má hmotnostní podíl sušiny
69%. Pokud je navážka na metody 10 g sušiny, odpovídá to 14,5 g ovlhčené půdy ze
zásobních sklenic. Pro ovlhčení 14,5 g půdy na 80% maximální vodní kapacity je
potřeba přidat ještě 1,5 ml vody. V případě metody substrátem indukované respirace
(SIR) je v tomto množství zároveň přidána glukóza v množství odpovídajícím 5 mg
uhlíku glukózy na 1 gsuš. půdy (například roztok glukózy o koncentraci 8,34 g / 100
ml).
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
9
Stanovení mikrobiální biomasy - Cbio
Potřebné chemikálie a roztoky:
- 0,5M K2SO4 (87,15 g/L)
- chloroform zbavený ethanolu – pozor výpary, pracovat v digestoři se staženým oknem
- 0,4N (0,0667M) K2Cr2O7 (1,9622 g/100 ml) – pozor toxická látka, karcinogen
- H2SO4 – pozor žíravina, pracovat velmi opatrně
- H3PO4 – pozor žíravina, pracovat velmi opatrně
- 0,1M (NH4)2Fe(SO4)2 - Mohrova sůl (39,21 g/L, každý litr obsahuje také 20 ml H2SO4)
- indikátor difenylamin (0,5 g + 20 ml dH2O + 100 ml H2SO4) – pozor toxická látka + žíravina
Postup:
1. Navažte 6 opakování po 14,5 g půdy od každé varianty do 120 ml infúzek. Tři
repliky od každé varianty popište fixou a na tři nalepte popis psaný tužkou.
2. Do 3 infúzek z každé varianty + do 2 prázdných infúzek (kontrola - KNF) ihned
přidejte 40 ml 0,5 M K2SO4, uzavřete pryžovými zátkami, důkladně protřepte a
nechte na třepačkách 30 min (200 rpm). Během třepání si nachystejte nálevky,
filtráky a infúzky na jímání extraktu, které popište a také označte jako NF.
3. Po třepání filtrujte do nových popsaných infúzek přes kvantitativní papír FILTRAK
391 (či analogie) po dobu 30 min. Filtráty uzavřete zátkami a umístěte do ledničky
do druhého dne.
4. Tři infúzky od každé varianty vložte do čistého exsikátoru, v němž je na dně vlhký
filtrační papír a nádobka s cca 60 ml chloroformu. Na styčné plochy mísy a víka
exsikátoru naneste malé množství Ramsay tuku (nesmí se dostat do exsikátoru!)
a uzavřete víkem. Exsikátor evakuujte olejovou vývěvou tak, aby chloroform vřel
asi 2 min. Exsikátor umístěte v temnu a laboratorní teplotě.
5. Druhý den exsikátor otevřete, odstraňte chloroform i filtrační papír, zkontrolujte
popisky vzorků. Očistěte exsikátor od zbytků tuku uvnitř a obnovte namazání
styčných ploch. Vzorky opět umístěte do exsikátoru a ten 10 krát opakovaně
odsávejte: odsátí 3 minuty a 3 minuty nechat.
6. K fumigovaným vzorkům + do 2 prázdných infúzek (kontrola - KF) přidejte 40 ml
0,5 M K2SO4, uzavřete pryžovými zátkami, důkladně protřepte a nechte na
třepačkách 30 min (200 rpm). Během třepání si nachystejte nálevky, filtráky a
infúzky na jímání extraktu, které popište a také označte jako F.
7. Po třepání filtrujte do nových popsaných infúzek přes kvantitativní papír FILTRAK
391 po dobu 30 min.
8. Do popsaných (3 opakování F a 3 NF od každé varianty + kontroly)
erlenmayerových baněk napipetujte mikropipetou na kapku přesně 2 ml 0,0667M
K2Cr2O7, přidejte dávkovačem 5 ml H3PO4 a 10 ml H2SO4. Přidejte 8 ml vzorku
nebo kontroly a zamíchejte. Směs spalujte v sušárně s otevřenou ventilací při 125
°C po dobu 45 min (60 min včetně vyhřátí). Po spálení vzorky nechte vychladnout
a poté do nich přidejte 5 ml destilované vody.
9. Nachystejte si standardy pro titraci: do 3 erlenek napipetujte přesně 2 ml 0,0667M
K2Cr2O7, přidejte dávkovačem 5 ml H2SO4 a 23 ml destilované vody.
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
10
10.Ke spálenému vzorku (či kontrole) přidáme 2 - 3 kapky indikátoru, zamícháme a
ihned titrujeme (přechod z modré do zelené) pomocí automatické byrety. Faktor
titrace (f) určíme z poměru 8,004 (teoretická spotřeba MS) ku skutečné spotřebě
MS při titraci standardů.
11.Uhlík ve F i NF vzorcích vypočtěte dle vzorce:
CF(NF) (µg.gsuš.
-1
) = f × (K - Vz) × 0,1 × 1/6 × 3/2 × 12,011 × 40/8 × 1000 / suš.,
neboli
CF(NF) (µg.gsuš.
-1
) = f × (K - Vz) × 1501,375 / suš.,
kde K je průměrný objem MS spotřebovaný na titraci kontroly (F respektive NF) a
Vz je objem MS spotřebovaný na titraci vzorku. Uhlík imobilizovaný v biomase EC
- získáme randomizací (každý od každého) odečtu CNF od CF hodnot (průměr
a S.D. z 9 hodnot). Cbio lze pak spočítat jako: Cbio = 2,64 × EC.
Úkoly:
- Změřte pomocí FE metody Cbio zadaných vzorků půd.
- Odvoďte použitý vzorec pro výpočet CF(NF) - vysvětlete, kde se vzaly jednotlivá
čísla následující za proměnnou Vz. Tip: Použijte rovnice reakce, množství a
koncentrace chemikálií:
2K2Cr2O7 + 3C + 8H2SO4 => 2K2SO4 + 3CO2 + 2Cr2(SO4)3 + 8H2O
K2Cr2O7 + 7H2SO4+ 6(NH4)2Fe(SO4)2 => K2SO4 + Cr2(SO4)3 + Fe2(SO4)3 + 6(NH4)2SO4 + 7H2O
- Výsledky zpracujte do přehledných tabulek a grafů ve vztahu ke koncentraci
kadmia v půdě.
- Interpretujte výsledky.
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
11
6 Stanovení bazální respirace - BR
Postup:
1. Od každé varianty navažte 3 opakování po 14,5 g do 150 ml infúzek, popište je
fixem a uzavřete je v definovanou dobu pryžovými zátkami a kovovými vršky.
2. Po asi 24 hodinách (přesný interval zaznamenejte) změřte koncentraci CO2
v infúzkách pomocí plynové chromatografie
3. Systém, na kterém budete měřit, je GC 6850 s kolonou GasPRO, mobilní fází He,
detektorem TCD a SW Clarity. Vzorky budou testovány pomocí ručního nástřiku.
4. Zapnutí GC: pustit stlačený vzduch a He, pustit GC, pustit Clarity SW a pomocí
přiloženého návodu vytvořit nový projekt, nakopírovat do něj metody, které budou
použity pro měření, chlazení a „standby“ metodu. Pokud je potřeba GC vypnout
(přes víkendy, či delší dobu nepoužíván), je třeba počkat, až teplota na koloně
bude 40-50°C („load cooling down method“). Pak lze GC vypnout a též všechny
plyny.
5. Kalibrace plynem z bomby s 1,01% CO2 v argonu bude provedená také pomocí
ručního nástřiku plynu pomocí injekční stříkačky.
6. Změřte také obsah CO2 ve vzduchu z místnosti (cca 5 ×).
7. Výslednou bazální respirační rychlost spočítejte ze vzorce:
BR (µg CO2-C.gsuš.
-1
.h-1
) = (Vz - In)/100×150×1,824×0,2729×1000/Suš/Čas,
kde:
Vz - procentuální obsah CO2 ve vzorku
In - procentuální obsah CO2 ve vzduchu v místnosti
Suš - množství sušiny ve vzorku (g)
Čas - časový interval od uzavření infúzek zátkami
8. Výsledek spočítejte jako průměr a směrodatnou odchylku ze tří opakování.
Úkoly:
- Po kalibraci změřte bazální respiraci ve všech testovaných variantách.
- Výsledky uveďte do tabulky a do grafu. Je BR pro Cd vyšší/nižší než pro K?
- Interpretujte a diskutujte výsledky.
- Jakmile budete znát SIR a Cbio vypočtěte a interpretujte koeficienty qCO2 a
SIR/BR.
- Vysvětlete, co znamenají čísla 1,824 a 0,2729 ve vzorci pro výpočet BR.
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
12
7 Substrátem indukovaná respirace – SIR
Potřebné chemikálie a roztoky:
- roztok glukózy o takové koncentraci, aby po doplnění vodní kapacity z 60% na 80% tímto
roztokem se do půdy dostalo i 5 mg Cglukóza/gsuš.
Postup:
1. Od každé varianty navažte 3 opakování po 14,5 g do 150 ml infúzek a popište je
fixem.
2. Povrch půdy se snažte rozvrstvit do rovnoměrné plochy na dně infúzek a poté na
něj rovnoměrně rozkapte objem roztoku glukózy potřebný pro doplnění vodní
kapacity z 60% na 80%.
3. Uzavřete infúzky v definovanou dobu pryžovými zátkami a kovovými vršky
v intervalech odpovídajících intervalu měření jednoho vzorku na plynovém
chromatografu (např. přibližně po 18 minutách).
4. Po 4 hodinách od uzavření první infúzky (přesný interval zaznamenejte) změřte
koncentraci CO2 postupně ve všech v infúzkách (ve stejném pořadí v jakém byly
vzorky uzavírány) pomocí plynové chromatografie (postup viz bazální respirace).
5. Změřte také obsah CO2 ve vzduchu z místnosti (cca 5 ×).
6. Výslednou substrátem indukovanou respirační rychlost spočítejte ze vzorce:
SIR (µg CO2-C.gsuš.
-1
.h-1
) = (Vz-In)/100 × 150 × 1,824 × 0,2729 × 1000/Suš/ Čas,
Vz - procentuální obsah CO2 ve vzorku
In - procentuální obsah CO2 ve vzduchu v místnosti
Suš - množství sušiny ve vzorku (g)
Čas - časový interval od uzavření infúzek zátkami
7. Respirační Výsledek spočítejte jako průměr a směrodatnou odchylku ze tří
opakování.
Úkoly:
- Určete SIR - potenciální respirační aktivitu půdy. Výsledky uveďte do tabulky a
do grafu. Jaký je vliv Cd na SIR? Vypočtěte indexy SIR/BR, SIR/Cbio a
interpretujte je.
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
13
8 Potenciální oxidace amoniaku – PAO
Potřebné chemikálie a roztoky:
- 4 M KCl (149,12 g / 500 ml)
- 2 M KCl (74,56 g / 500 ml)
- 0,2 M dihydrogenfosforečnan draselný - KH2PO4 (2,72 g / 100 ml)
- 0,2 M hydrogenfosforečnan draselný - K2HPO4 (3,48 g / 100 ml)
- roztok A – fosfátový pufr: 28 ml 0,2 M KH2PO4 + 72 ml 0,2 M K2HPO4
- roztok B – roztok pro inkubaci: 1000 ml obsahuje 10 ml roztoku fosforečnanů (A), 15 ml
roztoku 1M NaClO3 (10,6 g / 100 ml) a 0,5 g (NH4)2SO4; pH by mělo být cca 7,2
- reakční roztok C: 0,19 M NH4Cl (10 g / 1000 ml) se upraví na pH 8,7 - 8,8 pomocí několika ml
6% roztoku NH4OH
- reakční roztok D: 200 ml obsahuje 2 g sulfanilamidu, 0,1 g Griess-Ilosvayova činidla (N-(1naftyl)ethylen-diamin
dihydrochlorid) a 20 ml H3PO4 – pozor toxické látky
- sada kalibračních roztoků 0,1 - 2 µg NO2
-N
/ ml připravená z NaNO2
Postup:
1. Do infúzních lahví 150 ml navážte z každé varianty 3 x 14,5 g půdy.
2. Ke vzorkům půd přidejte 20 ml roztoku B pro inkubaci a uzavřete parafilmem, do
kterého udělejte několik otvorů nebo zátkou s trubičkou (= aerobní prostředí,
přístup vzduchu, po celou dobu inkubace). Promíchejte a dejte třepat na
horizontální třepačku při amplitudě 180.
3. Na začátku před inkubací (čas 0) a po 4 hodinách (přesný časový interval od
založení zaznamenejte) odeberte z každého vzorku 2 ml suspenze pomocí
automatické pipety se špičkou s odříznutým koncem (hned poté co suspenzi
rychle promícháte, aby odběr byl velmi reprezentativní). Suspenzi pipetujte do 15
ml zkumavek a přidejte 2 ml roztoku 4M KCl. Promíchejte a hned centrifugujte 5
min při 4000 rpm.
4. V supernatantu stanovte dusitanové ionty spektrofotometricky v 96-ti jamkové
mikrodestičce. V prvních třech sloupcích mikrodestičky proveďte stanovení blanku
(čistý 1M KCl) a kalibračních roztoků (0,1 – 2 µg NO2
-N
/ ml). Další část
mikrodestičky si rozvrhněte na jednotlivé varianty půdy.
5. Do příslušných jamek mikrodestičky napipetujte multikanálovou mikropipetou 210
µl reakčního roztoku C a přidejte 60 µl vzorku či kalibračního roztoku či kontroly.
Přidejte 30 µl roztoku Griess-Illosvayova činidla – reakčního roztoku D. Z každého
vzorku pipetujte jedno opakování do příslušné jamky, pro kontrolu a kalibrační
roztoky však udělejte tři opakování. Nechte reagovat a po 15 min změřte
absorbanci při 540 nm.
6. Z absorbancí kalibračních roztoků pro dusitanové ionty a kontroly (tj. koncentrace
0) sestrojte kalibrační přímku se vzorcem pro přepočet absorbance na
koncentraci NO2
-N
v roztoku.
7. Z absorbancí pro vzorky půd spočítejte pomocí kalibrační přímky koncentraci
NO2
-N
v extraktech a spočítejte množství iontů v půdě jako µg NO2
-N
/ gsuš. (pro
přepočet uvažujte množství sušiny v navážce, objem inkubačního roztoku a
ředění přidaným 4M KCl).
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
14
8. Potenciální nitrifikaci PAO vyjádřete jako produkci NO2
-N
za jednu hodinu
vztaženou na množství sušiny půdy. Výsledek uveďte jako průměr a S.D. pro tři
opakování.
Úkoly:
- Výsledky (včetně kalibrační přímky) uveďte v přehledných tabulkách a také
v grafech.
- Interpretujte a diskutujte výsledky. Mělo kadmium vliv na potenciální nitrifikaci?
- Zjistěte z literatury, zda vyšší koncentrace některých kovů nemohou
interferovat s analytickými metodami pro stanovení iontů NO2
-
.
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
15
9 Amonifikace argininu – PAMO
Potřebné chemikálie a roztoky:
- 1M KCl (74,55 g/L)
- Reakční roztok A: 500 ml roztoku obsahuje 17 g salicylanu sodného (HOC6H4COONa), 12,5g
citronanu sodného (C6H5Na3O7), 12,5 g vínanu sodného (C4H4Na2O6) a 0,06 nitroprusidu
sodného (Na2[Fe(CN)5NO]) – pozor toxické látky
- Reakční roztok B: 100 ml roztoku obsahuje 7,5 g hydroxidu sodného a 10 ml chlornanu
sodného (NaClO) (výsledný obsah musí být 1,2% aktivního chloru)
- sada kalibračních roztoků 0,5 – 10 µg NH4
+
-N / ml připravená ze síranu amonného (NH4)2SO3
- roztok L-argininu (100 mg/ 50 ml) – pozor toxické látky
Postup:
1. Navažte 6 opakování po 2,9 g půdy od každé varianty do polypropylenových
zkumavek o objemu 15 ml a popište je fixem
2. Do "arg" varianty (3 opakování pro každou variantu) napipetujte 0,5 ml roztoku
argininu, protřepte na vortexu a dejte do 30 °C inkubovat. Do "ne-arg" varianty
(opět 3 zkumavky pro každou variantu) přidejte 0,5 ml destilované vody, protřepte
na vortexu a dejte do mrazáku (tuto sadu vytáhněte z mrazáku cca 30 minut před
koncem inkubace, aby rozmrzla!).
3. Po cca 3 hodinách (přesný čas zaznamenejte) inkubace přidejte do všech
zkumavek 10 ml 1M KCl, zadělejte víčkem a důkladně promíchejte na vortexu.
Třepejte na třepačkách (200 rpm) po dobu 45 minut.
4. Zkumavky dejte centrifugovat na 5 min při 2500 rpm (pozor na vyvážení
centrifugy!).
5. Množství amonných iontů v extraktu stanovte spektrofotometricky v 96-ti jamkové
mikrodestičce. V prvních třech sloupcích mikrodestičky proveďte stanovení blanku
(čistý 1M KCl) a kalibračních roztoků (0,5 – 10 µg NH4
+
-N / ml). Další část
mikrodestičky si rozvrhněte na jednotlivé varianty půdy a sady bez a s přídavkem
argininu.
6. Do příslušných jamek mikrodestičky napipetujte multikanálovou mikropipetou 175
µl reakčního roztoku A (salicylanu) a 35 µl vzorku či kalibračního roztoku či
blanku. Po 15 min přidejte 30 µl roztoku B (alkalického roztoku NaClO) a 40 µl 1M
KCl. Nechte reagovat do vybarvení cca 60 min při laboratorní teplotě. Poté změřte
absorbanci při 660 nm. Z každého extraktu pipetujte jedno opakování do
příslušné jamky, pro kontrolu a kalibrační roztoky však udělejte tři opakování.
7. Z absorbancí kalibračních roztoků pro amonné ionty a kontroly (tj. koncentrace 0)
sestrojte kalibrační přímku se vzorcem pro přepočet absorbance na koncentraci
NH4
+
-N v roztoku.
8. Z absorbancí pro vzorky půd spočítejte pomocí kalibrační přímky koncentraci
NH4
+
-N v extraktech a spočítejte v půdě ošetřené a neošetřené argininem
množství iontů jako µg NH4
+
-N / gsuš. (pro přepočet uvažujte množství sušiny v
navážce a objem extraktu).
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
16
9. Rychlost potenciální amonifikace PAMO vypočítejte jako randomizací (každý od
každého) odečtu „arg“ a „ne-arg“ varianty a dělením časem inkubace:
NH4
+
-N (µg.gsuš.
-1
.h-1
) = arg (NH4
+
-N µg/gsuš) – ne-arg (NH4
+
-N (µg/gsuš) / Čas
Úkoly:
- Výsledky (včetně kalibrační přímky) uveďte v přehledných tabulkách a také
v grafech.
- Interpretujte a diskutujte výsledky. Mělo kadmium vliv na potenciální
amonifikaci?
- Zjistěte z literatury, zda vyšší koncentrace některých kovů nemohou
interferovat s analytickými metodami pro stanovení iontů NH4
+
.
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
17
10 Návod na práci s SW Clarity
Click at icon “Clarity“on desktop
Log in to Clarity
User name: Administrator
Ok
The GC 6850 window will appear. Use command – file  Project ... to create new
folder in the clarity for new set of analysis
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
18
Enter the name of project. Enter the name of analyst in “description“
Copy all the methods you may need into your project folder. All the methods are in
C:\Clarity\!!New Methods 2010_11. Required methods (*.MET) for single analysis
are:
- 01_Cool down GC_2010_11_15 (apply before switch off GC)
- 01_STDBY_2010_11_15 (apply during short break of analysis)
- Manual (apply for single-manual injection analysis)
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
19
Required methods (*.MET) for automatic analysis are:
- 01_Cool down GC_2010_11_15 (apply before switch off GC)
- 01_STDBY_2010_11_15 (apply during short break of analysis)
- POZICE 01_NEW_2010_11_15, ..., POZICE 10_NEW_2010_11_15
- Manual (apply for calibration of ambient air and ambient air analysis) analysis)
- Kalibrace_2010_11_15 (apply for calibration of sample automatic analysis)
Paste into the project folder. You will notice 2 subfolders in the project folder.
1. Calib folder – keeps calibration file
2. Data folder – keeps raw data from GC analysis
Single analysis:
File  open Method
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
20
Choose “Manual.met“ method in your project folder
At GC 6850 window, click “single analysis“ icon
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
21
Enter the detail of sample analysis: Sample Id, Sample (ambient, calibration, sample)
Click “Send method“, OK
Check the status of GC from “Device Monitor“ icon (on GC 6850 window). The green
lights and “Ready“ status will be appeared, when all temperatures of the devices are
ready for analyse. Then, inject 1 ml sample into the injection syringe and press “Start“
button on the GC device.
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
22
Automatic analysis
At GC 6850 window, click “sequencing analysis“ icon.
Enter the detail of sample analysis: Sample Id, select the method from your folder
(rely on the position of the injector (1st-11th position). Then, save it in your folder and
run the sequence.
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
23
The GC will sample automatically but important is to enter correct method (position)
as the actual injector. The 12th position is set for cleaning the column after each
injection. So, it cannot be used for sample.
The actual analysis will be indicated with red mark. The red circle on the Sts. (status
bar) means that the sample will not be analyzed.
After injection, the peaks of actual analysis can be found at “data acquisition“ icon.
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
24
Data integration
Choose “Chromatogram window“. You will see
the peaks which have been analyse. If you
would like to integrate other peaks, use “open“
menu. The results (*.prm) are in your project
folder/subfolder Data.
Set the interval of the peak. Click “Lock“ icon, select the start and end point by click,
respectively.
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
25
Add base-line to the peak;
- zoom in by drag the mouse over the peak
- click “add positive“ icon
- select the start and end point of the base-line, respectively
The finished look of the modified peak should be as in the figure below.
Correct the base line;
- Click “start“ icon to set new start point of baseline
- Click “end“ icon to set new end point of baseline
Sta
rt
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
26
Intergrate with calibration peaks;
- At the lower part of “Chromatogram“ window, select the set of calibration
peaks (calibration file) you would like to apply with your data. (click “set“)
- The calibration set(*.cal) can be found in your project floder\sub folder Calib
- Enter “1.01“ at the amount(mg).
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
27
Calibration
- Use “Manual.met“ method for single injection analysis
- Don’t forget to descrip as “calibration“ (in “sample“) before send method
- All calibration peaks must be set base-line as normal data
Click “Calibration window“ on the GC 6850
window. Select “New“ to create new set of
calibration.
Select “open standard“
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
28
Choose the calibration peak (*.prm) in project folder\data folder
In “compound“ tab. Zoom in by drag the mouse over the peak. Click “add peak“ icon,
then click on the calibration peak.
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
29
Enter “1,2,3,...“ as the calibration peak level, respectively. Enter “1.01“ in the amount
of CO2.
All the calibration peaks in the set can be seen in the next tab (in this case is “peak
3.84“ tab which have retention time at 3.84 minutes). The figure shows 2 levels of
calibration peaks in the calibration set. You can select the similar calibration peaks to
be used in the set.
Laboratorní praktikum z ekotoxikologie mikroorganismů
30
**** Before switch off GC
- Click “Open method“ at the GC 6850 window
- Select “01_Cool down GC_2010_11_15.met“ method
- Send method
- Wait til the device status is ready then switch off GC and exit Clarity