Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie – 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie – 17.2.2014 Studium buněkStudium buněkStudium buněk v podmínkách in vitro Studium buněk v podmínkách in vitrov podmínkách in vitrov podmínkách in vitro doc. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc. Ústav experimentální biologie doc. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc. Ústav experimentální biologieÚstav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU 22 10 m10 m fibroblasty v buněčné kultuřefibroblasty v buněčné kultuře Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 33 P ř d áškP ř d áškProgram přednášky:Program přednášky: • vývoj kultivací buněk in vitro d í k k lti čí h/lid ký h b ěk • vývoj kultivací buněk in vitro d í k k lti čí h/lid ký h b ěk• podmínky kultivace savčích/lidských buněk in vitro • podmínky kultivace savčích/lidských buněk in vitro • typy kultivací (terminologie) l t ti ál í h t f ý h • typy kultivací (terminologie) l t ti ál í h t f ý h• vlastnosti normálních a transformovaných buněčných linií • vlastnosti normálních a transformovaných buněčných liniíý • praktické aplikace hi bí k á iště ý • praktické aplikace hi bí k á iště• archivace, sbírková pracoviště• archivace, sbírková pracoviště Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 44 VÝVOJ KULTIVACÍVÝVOJ KULTIVACÍVÝVOJ KULTIVACÍ BUNĚK IN VITRO VÝVOJ KULTIVACÍ BUNĚK IN VITROBUNĚK IN VITROBUNĚK IN VITRO Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 55 ý á ýý á ý• 1907: kultivace nervových vláken izolovaných z žabích embryí (Harrison) • 1907: kultivace nervových vláken izolovaných z žabích embryí (Harrison) • 1912: explantáty kuřecí pojivové tkáně a srdeční svaloviny (Carrel; Burrows) • 1912: explantáty kuřecí pojivové tkáně a srdeční svaloviny (Carrel; Burrows)srdeční svaloviny (Carrel; Burrows) • 1916: trypsinizace a pasážování (Rous & Jones) srdeční svaloviny (Carrel; Burrows) • 1916: trypsinizace a pasážování (Rous & Jones) • 1943: stabilizace první buněčné linie -myší fibroblasty: L-cells (Earle et al ) • 1943: stabilizace první buněčné linie -myší fibroblasty: L-cells (Earle et al )fibroblasty: L cells (Earle et al.) • 1948: první buněčný klon - L929 (Sanford et al.) fibroblasty: L cells (Earle et al.) • 1948: první buněčný klon - L929 (Sanford et al.) • 1952: stabilizace první lidské linie - karcinom děložního krčku: HeLa (Gey et al ) • 1952: stabilizace první lidské linie - karcinom děložního krčku: HeLa (Gey et al )děložního krčku: HeLa (Gey et al.)děložního krčku: HeLa (Gey et al.) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 66 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 77 1952 - stabilizace první lidské linie HeLa (Gey et al.)1952 - stabilizace první lidské linie HeLa (Gey et al.) • karcinom děložního krčku • Henrietta Lacks (1920 1951) • karcinom děložního krčku • Henrietta Lacks (1920 1951)• Henrietta Lacks (1920-1951) • Johns Hopkins University Hospital (Baltimore, USA) • Henrietta Lacks (1920-1951) • Johns Hopkins University Hospital (Baltimore, USA) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 88 Linie HeLa:Linie HeLa: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 99 Linie HeLa:Linie HeLa: mikrotubuly (anti-Tu) mikrofilamenta (phalloidin) jádra (DAPI) mikrotubuly (anti-Tu) mikrofilamenta (phalloidin) jádra (DAPI) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 jádra (DAPI)jádra (DAPI) 1010 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 1111 KULTIVAČNÍ PODMÍNKYKULTIVAČNÍ PODMÍNKYKULTIVAČNÍ PODMÍNKYKULTIVAČNÍ PODMÍNKY Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 1212 Kultivační podmínky pro savčí a lidské buňkyKultivační podmínky pro savčí a lidské buňkyKultivační podmínky pro savčí a lidské buňkyKultivační podmínky pro savčí a lidské buňky • co nejpodobnější podmínkám v původním• co nejpodobnější podmínkám v původnímjp j p p organismu:  teplota 37oC jp j p p organismu:  teplota 37oC teplota 37 C,  maximální vlhkost vzduchu, 5% CO2  neutrální pH (6,8 až 7,2)  teplota 37 C,  maximální vlhkost vzduchu, 5% CO2  neutrální pH (6,8 až 7,2)neutrální pH (6,8 až 7,2)  živiny • sterilní prostředí neutrální pH (6,8 až 7,2)  živiny • sterilní prostředí• sterilní prostředí• sterilní prostředí Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 1313 Stabilní prostředí pro kultivaceStabilní prostředí pro kultivace CO2 inkubátory d fi á t bil í t l t (37oC) CO2 inkubátory d fi á t bil í t l t (37oC)• definovaná stabilní teplota (37oC) • maximální vlhkost vzduchu definovaný stabilní obsah CO (5%) • definovaná stabilní teplota (37oC) • maximální vlhkost vzduchu definovaný stabilní obsah CO (5%)• definovaný stabilní obsah CO2 (5%), příp. i O2 (řízená hypoxie) • definovaný stabilní obsah CO2 (5%), příp. i O2 (řízená hypoxie) • vodní nebo vzduchový plášť • vnitřní povrch: měď nebo nerez • vodní nebo vzduchový plášť • vnitřní povrch: měď nebo nerez• vnitřní povrch: měď nebo nerez • připojení tlakových lahví přes redukční ventily • vnitřní povrch: měď nebo nerez • připojení tlakových lahví přes redukční ventily Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 1414 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 1515 ŽIVNÉ MÉDIUMŽIVNÉ MÉDIUM Bazální médium t k té b ášk é Bazální médium t k té b ášk é• tekuté nebo práškové • soli, aminokyseliny, vitamíny, lipidy, zdroj energie indikátor pH • tekuté nebo práškové • soli, aminokyseliny, vitamíny, lipidy, zdroj energie indikátor pHenergie, indikátor pH + k í é / ů t é f kt energie, indikátor pH + k í é / ů t é f kt+ krevní sérum / růstové faktory+ krevní sérum / růstové faktory Kompletní médiumKompletní médiumpp Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 1616 SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA: V d tkáň é k ltV d tkáň é k lt SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA: Voda pro tkáňové kultury: • ultrapure type I - resistivita < 18 MΩ/cm Voda pro tkáňové kultury: • ultrapure type I - resistivita < 18 MΩ/cmp yp / • TOC (total organic carbon) < 10 ppb (parts per bilion) p yp / • TOC (total organic carbon) < 10 ppb (parts per bilion)(parts per bilion) Úprava vody pro tkáňové kultury: (parts per bilion) Úprava vody pro tkáňové kultury:p y p y • reverzní osmóza • absorbce na aktivní uhlík p y p y • reverzní osmóza • absorbce na aktivní uhlíkabsorbce na aktivní uhlík • iontoměniče • elektrodeionizace absorbce na aktivní uhlík • iontoměniče • elektrodeionizace • UV záření• UV záření Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 1717 SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA: Vyvážené solné roztoky (BSS, balanced salt solutions):Vyvážené solné roztoky (BSS, balanced salt solutions): SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA: • udržování pH a osmolality • udržování membránového potenciálu buněk ů • udržování pH a osmolality • udržování membránového potenciálu buněk ů• kofaktory enzymů • tvorba fokálních adhezí (růst na pevném substrátu) • kofaktory enzymů • tvorba fokálních adhezí (růst na pevném substrátu) • ionty: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO4 2-, PO4 3-, HCO3 • stopové prvky: Fe, Zn, Cu, Se … • ionty: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO4 2-, PO4 3-, HCO3 • stopové prvky: Fe, Zn, Cu, Se …p p y , , , Hlavní typy BSS: DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) p p y , , , Hlavní typy BSS: DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)DPBS (Dulbecco s phosphate-buffered saline) HBSS (Hank's balanced salt solution) EBSS (Earle's balanced salt solution) DPBS (Dulbecco s phosphate-buffered saline) HBSS (Hank's balanced salt solution) EBSS (Earle's balanced salt solution)EBSS (Earle s balanced salt solution) ESSS (Eagle's spinner salt solution) EBSS (Earle s balanced salt solution) ESSS (Eagle's spinner salt solution) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 1818 SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA: Pufrovací systém:Pufrovací systém:y • NaHCO3, HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulphonic acid) y • NaHCO3, HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulphonic acid)p ) Aminokyseliny: • esenciální resp vzácné (člověk myš): p ) Aminokyseliny: • esenciální resp vzácné (člověk myš):• esenciální, resp. vzácné (člověk, myš): arginin, histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin threonin tryptofan valin • esenciální, resp. vzácné (člověk, myš): arginin, histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin threonin tryptofan valinfenylalanin, threonin, tryptofan, valin • in vivo syntetizované ve specifických orgánech (ját l d i ) fenylalanin, threonin, tryptofan, valin • in vivo syntetizované ve specifických orgánech (ját l d i )(játra, resp. ledviny): cystein, glutamin, tyrosin (játra, resp. ledviny): cystein, glutamin, tyrosin • lze nahradit hydrolyzátem z proteinů (krátké peptidy) • lze nahradit hydrolyzátem z proteinů (krátké peptidy) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 p p y)p p y) 1919 SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIASLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA dd SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA: • voda • anorganické sloučeniny (ionty, stopové prvky) • voda • anorganické sloučeniny (ionty, stopové prvky) • aminokyseliny ---------------------------------------------------------------- • aminokyseliny ---------------------------------------------------------------- • vitamíny (zejména skupina B) • lipidy (esenciální mastné kyseliny cholesterol ) • vitamíny (zejména skupina B) • lipidy (esenciální mastné kyseliny cholesterol )• lipidy (esenciální mastné kyseliny, cholesterol…) • hormony, růstové faktory (inzulín, hydrokortizol) glukóza (zdroj energie) • lipidy (esenciální mastné kyseliny, cholesterol…) • hormony, růstové faktory (inzulín, hydrokortizol) glukóza (zdroj energie)• glukóza (zdroj energie) • fenolová červeň (indikátor pH) • glukóza (zdroj energie) • fenolová červeň (indikátor pH) • antibiotika (penicilin + streptomycin)• antibiotika (penicilin + streptomycin) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 2020 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 2121Krevní sérum: • fetální telecí/hovězí FCS/FBS koňské lidské Krevní sérum: • fetální telecí/hovězí FCS/FBS koňské lidské• fetální telecí/hovězí - FCS/FBS, koňské, lidské... • nedefinovaná směs růstových faktorů a dalších složek • fetální telecí/hovězí - FCS/FBS, koňské, lidské... • nedefinovaná směs růstových faktorů a dalších složeksložek • obsah v médiu 5 - 20% podle typu buněk složek • obsah v médiu 5 - 20% podle typu buněk • bezsérová média pro speciální aplikace (definovaná směs růstových faktorů - tzv. serum • bezsérová média pro speciální aplikace (definovaná směs růstových faktorů - tzv. serum replacement) Nejdůležitější látky obsažené v séru: replacement) Nejdůležitější látky obsažené v séru:Nejdůležitější látky obsažené v séru: • růstové faktory • albumin Nejdůležitější látky obsažené v séru: • růstové faktory • albumin• albumin • transferrin • anti-proteázy (antitrypsin, macroglobulin) • albumin • transferrin • anti-proteázy (antitrypsin, macroglobulin)anti proteázy (antitrypsin, macroglobulin) • attachment factors (fibronectin, laminin, fetuin) anti proteázy (antitrypsin, macroglobulin) • attachment factors (fibronectin, laminin, fetuin) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 fetuin)fetuin) 2222 Výhody použití séra: ě ů ž ě ší ů ř ží á í Výhody použití séra: ě ů ž ě ší ů ř ží á í• směs nejdůležitějších faktorů pro přežívání a proliferaci buněk • směs nejdůležitějších faktorů pro přežívání a proliferaci buněk • univerzální použití pro kultivaci většiny buněčných typů • univerzální použití pro kultivaci většiny buněčných typůyp • ochrana buněčné kultury před výkyvy prostředí a toxickými vlivy (změny pH, ionty těžkých kovů, yp • ochrana buněčné kultury před výkyvy prostředí a toxickými vlivy (změny pH, ionty těžkých kovů,ý y ( y p , y ý , endotoxiny, proteolytické enzymy) Nevýhody použití séra : ý y ( y p , y ý , endotoxiny, proteolytické enzymy) Nevýhody použití séra :Nevýhody použití séra : • potíže s reprodukovatelností (původ zvířat, krmení roční doba ) Nevýhody použití séra : • potíže s reprodukovatelností (původ zvířat, krmení roční doba )krmení, roční doba…) • riziko kontaminace • dostupnost a cena krmení, roční doba…) • riziko kontaminace • dostupnost a cena• dostupnost a cena • vliv na produkci proteinů do média • dostupnost a cena • vliv na produkci proteinů do média Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 2323 Typy médií pro savčí buňky:Typy médií pro savčí buňky:Typy médií pro savčí buňky: • Eagleovo médium (BME) a jeho modifikace ( ř EMEM AMEM DMEM GMEM JMEM) Typy médií pro savčí buňky: • Eagleovo médium (BME) a jeho modifikace ( ř EMEM AMEM DMEM GMEM JMEM)(např. EMEM, AMEM, DMEM, GMEM, JMEM) • RPMI média (např. EMEM, AMEM, DMEM, GMEM, JMEM) • RPMI médiaRPMI média (např. RPMI 1629, RPMI 1630, RPMI 1640) d lší édi ží á é RPMI média (např. RPMI 1629, RPMI 1630, RPMI 1640) d lší édi ží á é• další média užívaná se sérem (např. Fischerovo, Williamsovo) • další média užívaná se sérem (např. Fischerovo, Williamsovo) • média užívaná bez séra (TC199, MCDB) • média užívaná bez séra (TC199, MCDB)(TC199, MCDB)(TC199, MCDB) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 2424 Sterilní prostředíSterilní prostředíSterilní prostředí • práce v tzv. laminárních boxech (HEPA filtry) Sterilní prostředí • práce v tzv. laminárních boxech (HEPA filtry)práce v tzv. laminárních boxech (HEPA filtry) - typ podle úrovně Biosafety Level (BSL) jednorázový plastik práce v tzv. laminárních boxech (HEPA filtry) - typ podle úrovně Biosafety Level (BSL) jednorázový plastik• jednorázový plastik (sterilizováno radiací) • jednorázový plastik (sterilizováno radiací)( ) • sterilní sklo, nástroje a roztoky ( ) • sterilní sklo, nástroje a roztoky (horkovzdušná sterilizace, autoklávování) antibiotika (horkovzdušná sterilizace, autoklávování) antibiotika• antibiotika (běžně směs Pen/Str, případně gentamycin, • antibiotika (běžně směs Pen/Str, případně gentamycin,(běžně směs Pen/Str, případně gentamycin, amphotericin, nystatin) (běžně směs Pen/Str, případně gentamycin, amphotericin, nystatin) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 2525 ÚROVNĚ BIOLOGICKÉHO RIZIKA = BIOSAFETY LEVELS (BSLs) BSL-1 é ů í ě í BSL-1 é ů í ě í• mikroorganismy, které nezpůsobují onemocnění u zdravých dospělých; standardizované lidské a ži čiš é b ěč é li i • mikroorganismy, které nezpůsobují onemocnění u zdravých dospělých; standardizované lidské a ži čiš é b ěč é li iživočišné buněčné linie BSL 2 živočišné buněčné linie BSL 2BSL-2 • běžné patogeny středního rizika, mohou způsobovat různě závažná onemocnění která lze BSL-2 • běžné patogeny středního rizika, mohou způsobovat různě závažná onemocnění která lzezpůsobovat různě závažná onemocnění, která lze dobře léčit (HBV, Salmonella, Toxoplasma, klinický materiál - krev tělní tekutiny tkáně; některé způsobovat různě závažná onemocnění, která lze dobře léčit (HBV, Salmonella, Toxoplasma, klinický materiál - krev tělní tekutiny tkáně; některémateriál krev, tělní tekutiny, tkáně; některé sbírkové linie - např. HeLa) materiál krev, tělní tekutiny, tkáně; některé sbírkové linie - např. HeLa) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 2626 Laminární box - biohazard třída I horizontálníhorizontální vertikálnívertikální Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 2727 Laminární box - biohazard třída II HEPA filtry (částice > 0,3 mm) HEPA filtry (částice > 0,3 mm) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 2828 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 2929 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 3030 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 3131 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 3232 ÚROVNĚ BIOLOGICKÉHO RIZIKA = BIOSAFETY LEVELS (BSLs) BSL-3 • lokální nebo exotické patogeny vysokého rizika, BSL-3 • lokální nebo exotické patogeny vysokého rizika,p g y y , respiračně přenosné, způsobují závažná a potenciálně letální onemocnění, která jsou obtížně p g y y , respiračně přenosné, způsobují závažná a potenciálně letální onemocnění, která jsou obtížněp , j léčitelná • Mycobacterium tuberculosis, virus encefalitidy St. p , j léčitelná • Mycobacterium tuberculosis, virus encefalitidy St. Louis, antrax BSL-4 Louis, antrax BSL-4BSL 4 • extrémně rizikové patogeny, respiračně přenosné, způsobují letální onemocnění, proti nimž BSL 4 • extrémně rizikové patogeny, respiračně přenosné, způsobují letální onemocnění, proti nimžpůsobuj etá o e oc ě , p ot neexistuje léčba ani vakcinace • hemorrhagické viry (Ebola, Marburg) působuj etá o e oc ě , p ot neexistuje léčba ani vakcinace • hemorrhagické viry (Ebola, Marburg) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 g y ( , g)g y ( , g) 3333 BIOSAFETY LEVEL 3 (BSL-3) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 3434 BIOSAFETY LEVEL 4 (BSL-4) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 3535 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 3636 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 3737 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 3838 Typy kontaminacíTypy kontaminací • mykoplazmata • viry • mykoplazmata • viryy • bakterie, plísně, kvasinky • kontaminace jinou buněčnou linií y • bakterie, plísně, kvasinky • kontaminace jinou buněčnou linií (cross-contamination)(cross-contamination) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 3939 Kontaminace – mykoplazmataKontaminace – mykoplazmatay p Detekce mykoplazmat: y p Detekce mykoplazmat:y p a) fluorescencenční mikroskopie (značení DNA) y p a) fluorescencenční mikroskopie (značení DNA)(značení DNA) b) PCR (značení DNA) b) PCR Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 4040 KULTIVAČNÍ POSTUPYKULTIVAČNÍ POSTUPY Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 4141 i t ý ik ki t ý ik kinvertovaný mikroskopinvertovaný mikroskop Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 4242 Ě Í ĚĚ Í ĚDĚLENÍ BUNĚK V PODMÍNKÁCH IN VITRO: DĚLENÍ BUNĚK V PODMÍNKÁCH IN VITRO:V PODMÍNKÁCH IN VITRO:V PODMÍNKÁCH IN VITRO: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 4343 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 4444 T b ěč ý h k ltT b ěč ý h k ltTypy buněčných kultur: • adherované: Typy buněčných kultur: • adherované: rostou přichycené na pevném podkladu s spen ní rostou přichycené na pevném podkladu s spen ní• suspenzní: rostou volně v médiu • suspenzní: rostou volně v médiu Kultivace na živné vrstvě (feeder layer):Kultivace na živné vrstvě (feeder layer):Kultivace na živné vrstvě (feeder-layer): • obvykle inaktivované myší buňky (fibroblasty, it ál í k fá ) Kultivace na živné vrstvě (feeder-layer): • obvykle inaktivované myší buňky (fibroblasty, it ál í k fá )peritoneální makrofágy) • hybridomy, embryonální kmenové buňky peritoneální makrofágy) • hybridomy, embryonální kmenové buňkyy y, y yy y, y y Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 4545 SUBKULTIVACE (PASÁŽOVÁNÍ) Suspenzní kultury • odstranění starého média centrifugací Suspenzní kultury • odstranění starého média centrifugacíg • naředění buněk v čerstvém médiu • přenesení do nové kultivační lahvičky/misky č ý éd g • naředění buněk v čerstvém médiu • přenesení do nové kultivační lahvičky/misky č ý éds čerstvým médiem Adherované buňky s čerstvým médiem Adherované buňkyAdherované buňky • odstranění starého média, oplach v pufru • uvolnění buněk z podkladu proteolýzou fokálních Adherované buňky • odstranění starého média, oplach v pufru • uvolnění buněk z podkladu proteolýzou fokálníchp p ý adhezí (trypsin) • inaktivace trypsinu přidáním séra p p ý adhezí (trypsin) • inaktivace trypsinu přidáním sérayp p • alternativa: mechanické uvolnění (škrabky) • centrifugace, naředění buněk v čerstvém médiu ř í é č í č yp p • alternativa: mechanické uvolnění (škrabky) • centrifugace, naředění buněk v čerstvém médiu ř í é č í č• přenesení do nové kultivační lahvičky/misky s čerstvým médiem • přenesení do nové kultivační lahvičky/misky s čerstvým médiem Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 4646 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 4747 TYPY KULTIVACÍTYPY KULTIVACÍTYPY KULTIVACÍ (TERMINOLOGIE) TYPY KULTIVACÍ (TERMINOLOGIE)(TERMINOLOGIE)(TERMINOLOGIE) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 4848 TKÁŇOVÉ KULTURY / CELL CULTURESTKÁŇOVÉ KULTURY / CELL CULTURESTKÁŇOVÉ KULTURY / CELL CULTURESTKÁŇOVÉ KULTURY / CELL CULTURES • orgánová/tkáňová kultura (organ/tissue culture) trojrozměrná kultura nerozvolněné tkáně, která • orgánová/tkáňová kultura (organ/tissue culture) trojrozměrná kultura nerozvolněné tkáně, kterátrojrozměrná kultura nerozvolněné tkáně, která si uchovává histologické znaky a vlastnosti původní tkáně v prostředí in vivo trojrozměrná kultura nerozvolněné tkáně, která si uchovává histologické znaky a vlastnosti původní tkáně v prostředí in vivop p • buněčná kultura (cell culture) kultura odvozená z jednotlivých buněk které už p p • buněčná kultura (cell culture) kultura odvozená z jednotlivých buněk které užkultura odvozená z jednotlivých buněk, které už nejsou spojeny do struktury tkáně i k lt / i á í k lt ( i lt ) kultura odvozená z jednotlivých buněk, které už nejsou spojeny do struktury tkáně i k lt / i á í k lt ( i lt )• primokultura / primární kultura (primary culture) buňky v kultuře jsou získány přímo z původní á ě á • primokultura / primární kultura (primary culture) buňky v kultuře jsou získány přímo z původní á ě átkáně nebo fragmentu orgánutkáně nebo fragmentu orgánu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 4949primokultura multiformního glioblastomu - 5. denprimokultura multiformního glioblastomu - 5. den Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 5050primokultura multiformního glioblastomu - 12. denprimokultura multiformního glioblastomu - 12. den Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 5151primokultura multiformního glioblastomu - 12. denprimokultura multiformního glioblastomu - 12. den Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 5252 Buněčná linieBuněčná linieBuněčná linie • populace buněk odvozená z primokultury při první pasáži a dále udržovaná v podmínkách in Buněčná linie • populace buněk odvozená z primokultury při první pasáži a dále udržovaná v podmínkách inprvní pasáži a dále udržovaná v podmínkách in vitro ( áž ř b ěk j d é k l i č í první pasáži a dále udržovaná v podmínkách in vitro ( áž ř b ěk j d é k l i č í(pasáž = přenos buněk z jedné kultivační nádobky do nádobky nové) (pasáž = přenos buněk z jedné kultivační nádobky do nádobky nové) • diploidní (normální nenádorové buňky) stabilizovaná (nádorově transformované buňky) • diploidní (normální nenádorové buňky) stabilizovaná (nádorově transformované buňky)• stabilizovaná (nádorově transformované buňky) • charakterizace buněčné linie: • stabilizovaná (nádorově transformované buňky) • charakterizace buněčné linie: označení (název), druh organismu, pohlaví, věk, výchozí orgán typ kultury počet pasáží růstové označení (název), druh organismu, pohlaví, věk, výchozí orgán typ kultury počet pasáží růstovévýchozí orgán, typ kultury, počet pasáží, růstové parametry, morfologie, karyotyp, markery výchozí orgán, typ kultury, počet pasáží, růstové parametry, morfologie, karyotyp, markery Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 5353 Buněčný kmen • buněčná populace získaná subkultivací Buněčný kmen • buněčná populace získaná subkultivací• buněčná populace, získaná subkultivací z původní linie - vyselektována na základě čitéh k • buněčná populace, získaná subkultivací z původní linie - vyselektována na základě čitéh kexprese určitého znaku B ěč ý kl exprese určitého znaku B ěč ý klBuněčný klon • buněčná populace, vzniklá pomnožením jediné Buněčný klon • buněčná populace, vzniklá pomnožením jedinép p , p j buňky, izolované z původní linie • všechny buňky v buněčném klonu teoreticky p p , p j buňky, izolované z původní linie • všechny buňky v buněčném klonu teoreticky• všechny buňky v buněčném klonu teoreticky identické, avšak v praxi určitý stupeň h t it • všechny buňky v buněčném klonu teoreticky identické, avšak v praxi určitý stupeň h t itheterogenityheterogenity Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 5454 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 5555 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 5656 NORMÁLNÍ A TRANSFORMOVANÉNORMÁLNÍ A TRANSFORMOVANÉNORMÁLNÍ A TRANSFORMOVANÉ BUNĚČNÉ LINIE NORMÁLNÍ A TRANSFORMOVANÉ BUNĚČNÉ LINIEBUNĚČNÉ LINIEBUNĚČNÉ LINIE Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 5757 Růstové parametry buněčných linií:Růstové parametry buněčných linií:p y ý • generační doba p y ý • generační doba období mezi dvěma mitózami = délka buněčného cyklu období mezi dvěma mitózami = délka buněčného cykluy • population doubling time (PDT) čas potřebný ke zdvojnásobení počtu buněk v y • population doubling time (PDT) čas potřebný ke zdvojnásobení počtu buněk včas, potřebný ke zdvojnásobení počtu buněk v populaci • lifespan (délka života) čas, potřebný ke zdvojnásobení počtu buněk v populaci • lifespan (délka života)• lifespan (délka života) geneticky naprogramovaný počet dělení buňky k k í i hibi • lifespan (délka života) geneticky naprogramovaný počet dělení buňky k k í i hibi• kontaktní inhibice zástava proliferace po dosažení určité limitní • kontaktní inhibice zástava proliferace po dosažení určité limitníp p saturační density p p saturační density Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 5858 Kontaktní inhibiceKontaktní inhibice Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 5959 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 6060 Diploidní buněčné linie:Diploidní buněčné linie:Diploidní buněčné linie: • normální nenádorové buňky Diploidní buněčné linie: • normální nenádorové buňky • omezená délka života in vitro • standardní karyotyp (diploidní) • omezená délka života in vitro • standardní karyotyp (diploidní)• standardní karyotyp (diploidní) • obvykle anchorage-dependent ( ž d jí b t át k ři h í) • standardní karyotyp (diploidní) • obvykle anchorage-dependent ( ž d jí b t át k ři h í)(vyžadují substrát k přichycení) • schopnost kontaktní inhibice (vyžadují substrát k přichycení) • schopnost kontaktní inhibiceschopnost kontaktní inhibice • tzv. "stárnutí kultury" = změna morfologie a růstových parametrů se vzrůstající dobou v schopnost kontaktní inhibice • tzv. "stárnutí kultury" = změna morfologie a růstových parametrů se vzrůstající dobou vrůstových parametrů se vzrůstající dobou v podmínkách in vitro růstových parametrů se vzrůstající dobou v podmínkách in vitro • LEP (lidské embryonální plíce) HPLC (lidské lymfocyty periferní krve) • LEP (lidské embryonální plíce) HPLC (lidské lymfocyty periferní krve) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 ( y y y p )( y y y p ) 6161 Stabilizované buněčné linie:Stabilizované buněčné linie: • nádorově transformované buňky • neomezený generační potenciál nesmrtelnost • nádorově transformované buňky • neomezený generační potenciál nesmrtelnost• neomezený generační potenciál = nesmrtelnost v podmínkách in vitro • neomezený generační potenciál = nesmrtelnost v podmínkách in vitro • kratší PDT, redukovaná závislost na podkladu • obvykle heteroploidní resp aneuploidní • kratší PDT, redukovaná závislost na podkladu • obvykle heteroploidní resp aneuploidní• obvykle heteroploidní, resp. aneuploidní • často bez schopnosti kontaktní inhibice • obvykle heteroploidní, resp. aneuploidní • často bez schopnosti kontaktní inhibice • lidské adherované: HeLa, A431, MCF-7, Saos-2… lidské suspenzní: HL-60, Jurkat, HeLa-S… • lidské adherované: HeLa, A431, MCF-7, Saos-2… lidské suspenzní: HL-60, Jurkat, HeLa-S…lidské suspenzní: HL 60, Jurkat, HeLa S… L929, 3T3 (myší fribroblasty), CHO (chinese hamster ovary) lidské suspenzní: HL 60, Jurkat, HeLa S… L929, 3T3 (myší fribroblasty), CHO (chinese hamster ovary)( y) MDCK (Madine-Darby canine kidney) VERO (African green monkey kidney) ( y) MDCK (Madine-Darby canine kidney) VERO (African green monkey kidney) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 ( g y y)( g y y) 6262 Rozdíl v počtu chromosomů během kultivaceRozdíl v počtu chromosomů během kultivace normální buňkynormální buňky (gliové buňky)(gliové buňky) transformované buňkytransformované buňkytransformované buňky (maligní melanom) transformované buňky (maligní melanom) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 6363 PRAKTICKÉ APLIKACEPRAKTICKÉ APLIKACEPRAKTICKÉ APLIKACEPRAKTICKÉ APLIKACE Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 6464 • základní výzkum (buněčná biologie,• základní výzkum (buněčná biologie,ý ( g , cytogenetika, onkologie, imunologie, biochemie, molekulární biologie, virologie…) ý ( g , cytogenetika, onkologie, imunologie, biochemie, molekulární biologie, virologie…)g , g ) • prenatální diagnostika • toxikologie (testy léčiv kosmetických přípravků g , g ) • prenatální diagnostika • toxikologie (testy léčiv kosmetických přípravků• toxikologie (testy léčiv, kosmetických přípravků, implantátů • reprodukční medicína (IVF) • toxikologie (testy léčiv, kosmetických přípravků, implantátů • reprodukční medicína (IVF)• reprodukční medicína (IVF) • klinická onkologie (typizace nádorů, testování multidrug resistance hodnocení markerů) • reprodukční medicína (IVF) • klinická onkologie (typizace nádorů, testování multidrug resistance hodnocení markerů)multidrug resistance, hodnocení markerů) • výroba očkovacích látek (virové vakcíny) multidrug resistance, hodnocení markerů) • výroba očkovacích látek (virové vakcíny) • průmyslová výroba specifických buněčných produktů (transgenní linie) • průmyslová výroba specifických buněčných produktů (transgenní linie) • příprava buněčných a tkáňových derivátů (např. kůže) • příprava buněčných a tkáňových derivátů (např. kůže) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 )) 6565 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 6666 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 6767 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 6868 KRYOKONZERVACE, ARCHIVACE, SBÍRKOVÁ PRACOVIŠTĚ KRYOKONZERVACE, ARCHIVACE, SBÍRKOVÁ PRACOVIŠTĚSBÍRKOVÁ PRACOVIŠTĚSBÍRKOVÁ PRACOVIŠTĚ Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 6969 Kryokonzervace živočišných buněkKryokonzervace živočišných buněk • kultura v exponenciální fázi růstu • po trypsinizaci resuspendování v zamražovací • kultura v exponenciální fázi růstu • po trypsinizaci resuspendování v zamražovacípo trypsinizaci resuspendování v zamražovací směsi: 90% sérum (FCS) + 10% kryoprotektivum po trypsinizaci resuspendování v zamražovací směsi: 90% sérum (FCS) + 10% kryoprotektivum90% sérum (FCS) 10% kryoprotektivum (DMSO, glycerol) • dvoustupňové zamražování: 90% sérum (FCS) 10% kryoprotektivum (DMSO, glycerol) • dvoustupňové zamražování:dvoustupňové zamražování: "pomalý krok" (optimální pokles o 1oC za minutu) "rychlý krok" (přemístění kryoampulí z -8OoC do dvoustupňové zamražování: "pomalý krok" (optimální pokles o 1oC za minutu) "rychlý krok" (přemístění kryoampulí z -8OoC do -rychlý krok (přemístění kryoampulí z -8OoC do - 15OoC (hlubokomrazící boxy) nebo do -196oC (kontejnery s tekutým dusíkem) rychlý krok (přemístění kryoampulí z -8OoC do - 15OoC (hlubokomrazící boxy) nebo do -196oC (kontejnery s tekutým dusíkem)(kontejnery s tekutým dusíkem) • rozmražování: nejprve rychlé ohřátí (rozmražení směsi) pak (kontejnery s tekutým dusíkem) • rozmražování: nejprve rychlé ohřátí (rozmražení směsi) paknejprve rychlé ohřátí (rozmražení směsi), pak pomalé přidávání vychlazeného média (cca 1ml za minutu) nejprve rychlé ohřátí (rozmražení směsi), pak pomalé přidávání vychlazeného média (cca 1ml za minutu) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 minutu)minutu) 7070 PříkladyPříkladyPříklady kryoprotektiv: Příklady kryoprotektiv: l ldi th l lf id glyceroldimethylsulfoxid (DMSO) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 7171 Vliv rychlosti zamražování na přežití buněk:Vliv rychlosti zamražování na přežití buněk: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 7272 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 7373 American Type Culture Collection (ATCC)American Type Culture Collection (ATCC) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 7474 European Collection of Cell Cultures (ECACC)European Collection of Cell Cultures (ECACC) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 7575 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014