1 Bi8120 A lik á b ěč á bi l i 17 2 2014Bi8120 A lik á b ěč á bi l i 17 2 2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie – 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie – 17.2.2014 Studium buněk v podmínkách in vitro Studium buněk v podmínkách in vitrov podmínkách in vitrov podmínkách in vitro doc. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU doc. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MUPřírodovědecká fakulta MUPřírodovědecká fakulta MU 2 22 10 m10 m fibroblasty v buněčné kultuřefibroblasty v buněčné kultuře Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 3 33 Program přednášky:Program přednášky: • vývoj kultivací buněk in vitro• vývoj kultivací buněk in vitro Program přednášky:Program přednášky: vývoj kultivací buněk in vitro • podmínky kultivace savčích/lidských buněk in vitro vývoj kultivací buněk in vitro • podmínky kultivace savčích/lidských buněk in vitroin vitro • typy kultivací (terminologie) • vlastnosti normálních a transformovaných in vitro • typy kultivací (terminologie) • vlastnosti normálních a transformovaných• vlastnosti normálních a transformovaných buněčných linií • praktické aplikace • vlastnosti normálních a transformovaných buněčných linií • praktické aplikace• praktické aplikace • archivace, sbírková pracoviště • praktické aplikace • archivace, sbírková pracoviště Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 4 44 VÝVOJ KULTIVACÍ BUNĚK IN VITRO VÝVOJ KULTIVACÍ BUNĚK IN VITROBUNĚK IN VITROBUNĚK IN VITRO Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 5 55 • 1907: kultivace nervových vláken izolovaných• 1907: kultivace nervových vláken izolovaných• 1907: kultivace nervových vláken izolovaných z žabích embryí (Harrison) • 1912: explantáty kuřecí pojivové tkáně a • 1907: kultivace nervových vláken izolovaných z žabích embryí (Harrison) • 1912: explantáty kuřecí pojivové tkáně a1912: explantáty kuřecí pojivové tkáně a srdeční svaloviny (Carrel; Burrows) • 1916: trypsinizace a pasážování (Rous & Jones) 1912: explantáty kuřecí pojivové tkáně a srdeční svaloviny (Carrel; Burrows) • 1916: trypsinizace a pasážování (Rous & Jones)yp p ( ) • 1943: stabilizace první buněčné linie -myší fibroblasty: L-cells (Earle et al.) yp p ( ) • 1943: stabilizace první buněčné linie -myší fibroblasty: L-cells (Earle et al.)y ( ) • 1948: první buněčný klon - L929 (Sanford et al.) • 1952: stabilizace první lidské linie - karcinom y ( ) • 1948: první buněčný klon - L929 (Sanford et al.) • 1952: stabilizace první lidské linie - karcinom• 1952: stabilizace první lidské linie - karcinom děložního krčku: HeLa (Gey et al.) • 1952: stabilizace první lidské linie - karcinom děložního krčku: HeLa (Gey et al.) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 6 66 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 7 77 1952 - stabilizace první lidské linie HeLa (Gey et al.) k děl ž íh k čk 1952 - stabilizace první lidské linie HeLa (Gey et al.) k děl ž íh k čk• karcinom děložního krčku • Henrietta Lacks (1920-1951) Johns Hopkins University Hospital (Baltimore USA) • karcinom děložního krčku • Henrietta Lacks (1920-1951) Johns Hopkins University Hospital (Baltimore USA)• Johns Hopkins University Hospital (Baltimore, USA)• Johns Hopkins University Hospital (Baltimore, USA) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 8 88 Linie HeLa:Linie HeLa: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 9 99 Linie HeLa:Linie HeLa: mikrotubuly (anti-Tu) mikrofilamenta (phalloidin) mikrotubuly (anti-Tu) mikrofilamenta (phalloidin) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 mikrofilamenta (phalloidin) jádra (DAPI) mikrofilamenta (phalloidin) jádra (DAPI) 10 1010 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 11 1111 KULTIVAČNÍ PODMÍNKYKULTIVAČNÍ PODMÍNKYKULTIVAČNÍ PODMÍNKYKULTIVAČNÍ PODMÍNKY Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 12 1212 Kultivační podmínky pro savčí a lidské buňkyKultivační podmínky pro savčí a lidské buňky • co nejpodobnější podmínkám v původním organismu: • co nejpodobnější podmínkám v původním organismu:  teplota 37oC,  maximální vlhkost vzduchu, 5% CO2  neutrální pH (6 8 až 7 2)  teplota 37oC,  maximální vlhkost vzduchu, 5% CO2  neutrální pH (6 8 až 7 2) neutrální pH (6,8 až 7,2)  živiny • sterilní prostředí  neutrální pH (6,8 až 7,2)  živiny • sterilní prostředísterilní prostředísterilní prostředí Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 13 1313 Stabilní prostředí pro kultivacep p CO2 inkubátoryCO2 inkubátoryCO2 inkubátory • definovaná stabilní teplota (37oC) • maximální vlhkost vzduchu CO2 inkubátory • definovaná stabilní teplota (37oC) • maximální vlhkost vzduchu • definovaný stabilní obsah CO2 (5%), příp. i O2 (řízená hypoxie) • definovaný stabilní obsah CO2 (5%), příp. i O2 (řízená hypoxie) • vodní nebo vzduchový plášť • vnitřní povrch: měď nebo nerez • připojení tlakových lahví přes redukční ventily • vodní nebo vzduchový plášť • vnitřní povrch: měď nebo nerez • připojení tlakových lahví přes redukční ventily• připojení tlakových lahví přes redukční ventily• připojení tlakových lahví přes redukční ventily Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 14 1414 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 15 1515 ŽIVNÉ MÉDIUM Bazální médiumBazální médiumBazální médium • tekuté nebo práškové • soli, aminokyseliny, vitamíny, lipidy, zdroj Bazální médium • tekuté nebo práškové • soli, aminokyseliny, vitamíny, lipidy, zdrojy y y p y j energie, indikátor pH + krevní sérum / růstové faktory y y y p y j energie, indikátor pH + krevní sérum / růstové faktory+ krevní sérum / růstové faktory+ krevní sérum / růstové faktory Kompletní médiumKompletní médium Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 16 1616 SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA: Voda pro tkáňové kultury:Voda pro tkáňové kultury: • ultrapure type I - resistivita < 18 MΩ/cm • TOC (total organic carbon) < 10 ppb (parts per bilion) • ultrapure type I - resistivita < 18 MΩ/cm • TOC (total organic carbon) < 10 ppb (parts per bilion)(parts per bilion) Úprava vody pro tkáňové kultury: (parts per bilion) Úprava vody pro tkáňové kultury: • reverzní osmóza • absorbce na aktivní uhlík • iontoměniče • reverzní osmóza • absorbce na aktivní uhlík • iontoměniče• iontoměniče • elektrodeionizace • UV záření • iontoměniče • elektrodeionizace • UV záření Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 17 1717 SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA: Vyvážené solné roztoky (BSS, balanced salt solutions): • udržování pH a osmolality d ž á í b á éh t iál b ěk Vyvážené solné roztoky (BSS, balanced salt solutions): • udržování pH a osmolality d ž á í b á éh t iál b ěk• udržování membránového potenciálu buněk • kofaktory enzymů • tvorba fokálních adhezí (růst na pevném substrátu) • udržování membránového potenciálu buněk • kofaktory enzymů • tvorba fokálních adhezí (růst na pevném substrátu)( p ) • ionty: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO4 2-, PO4 3-, HCO3 • stopové prvky: Fe, Zn, Cu, Se … ( p ) • ionty: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO4 2-, PO4 3-, HCO3 • stopové prvky: Fe, Zn, Cu, Se … Hlavní typy BSS: DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) HBSS (Hank's balanced salt solution) Hlavní typy BSS: DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) HBSS (Hank's balanced salt solution)HBSS (Hank s balanced salt solution) EBSS (Earle's balanced salt solution) ESSS (Eagle's spinner salt solution) HBSS (Hank s balanced salt solution) EBSS (Earle's balanced salt solution) ESSS (Eagle's spinner salt solution) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 ( g p )( g p ) 18 1818 SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA: Pufrovací systém: • NaHCO3, HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2Pufrovací systém: • NaHCO3, HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-NaHCO3, HEPES (N 2 hydroxyethylpiperazine N 2 -ethanesulphonic acid) Aminokyseliny: iál í á é (čl ěk š) NaHCO3, HEPES (N 2 hydroxyethylpiperazine N 2 -ethanesulphonic acid) Aminokyseliny: iál í á é (čl ěk š)• esenciální, resp. vzácné (člověk, myš): arginin, histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin threonin tryptofan valin • esenciální, resp. vzácné (člověk, myš): arginin, histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin threonin tryptofan valinfenylalanin, threonin, tryptofan, valin • in vivo syntetizované ve specifických orgánech (játra, resp. ledviny): fenylalanin, threonin, tryptofan, valin • in vivo syntetizované ve specifických orgánech (játra, resp. ledviny): cystein, glutamin, tyrosin • lze nahradit hydrolyzátem z proteinů (krátké peptidy) cystein, glutamin, tyrosin • lze nahradit hydrolyzátem z proteinů (krátké peptidy) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 peptidy)peptidy) 19 1919 SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA: • voda i ké l č i (i t t é k ) • voda i ké l č i (i t t é k ) SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA: • anorganické sloučeniny (ionty, stopové prvky) • aminokyseliny ---------------------------------------------------------------- • anorganické sloučeniny (ionty, stopové prvky) • aminokyseliny -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- • vitamíny (zejména skupina B) • lipidy (esenciální mastné kyseliny, cholesterol…) ---------------------------------------------------------------- • vitamíny (zejména skupina B) • lipidy (esenciální mastné kyseliny, cholesterol…)p y ( y y, ) • hormony, růstové faktory (inzulín, hydrokortizol) • glukóza (zdroj energie) á č ň á p y ( y y, ) • hormony, růstové faktory (inzulín, hydrokortizol) • glukóza (zdroj energie) á č ň á• fenolová červeň (indikátor pH) • antibiotika (penicilin + streptomycin) • fenolová červeň (indikátor pH) • antibiotika (penicilin + streptomycin) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 20 2020 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 21 2121Krevní sérum: • fetální telecí/hovězí - FCS/FBS, koňské, lidské... Krevní sérum: • fetální telecí/hovězí - FCS/FBS, koňské, lidské... • nedefinovaná směs růstových faktorů a dalších složek b h édi 5 20% dl t b ěk • nedefinovaná směs růstových faktorů a dalších složek b h édi 5 20% dl t b ěk• obsah v médiu 5 - 20% podle typu buněk • bezsérová média pro speciální aplikace (definovaná směs růstových faktorů - tzv. serum • obsah v médiu 5 - 20% podle typu buněk • bezsérová média pro speciální aplikace (definovaná směs růstových faktorů - tzv. serum(definovaná směs růstových faktorů tzv. serum replacement) Nejdůležitější látky obsažené v séru: (definovaná směs růstových faktorů tzv. serum replacement) Nejdůležitější látky obsažené v séru:Nejdůležitější látky obsažené v séru: • růstové faktory • albumin • transferrin Nejdůležitější látky obsažené v séru: • růstové faktory • albumin • transferrin• transferrin • anti-proteázy (antitrypsin, macroglobulin) • attachment factors (fibronectin, laminin, f t i ) • transferrin • anti-proteázy (antitrypsin, macroglobulin) • attachment factors (fibronectin, laminin, f t i ) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 fetuin)fetuin) 22 2222 Výhody použití séra: • směs nejdůležitějších faktorů pro přežívání a Výhody použití séra: • směs nejdůležitějších faktorů pro přežívání a• směs nejdůležitějších faktorů pro přežívání a proliferaci buněk • univerzální použití pro kultivaci většiny buněčných ů • směs nejdůležitějších faktorů pro přežívání a proliferaci buněk • univerzální použití pro kultivaci většiny buněčných ůtypů • ochrana buněčné kultury před výkyvy prostředí a toxickými vlivy (změny pH ionty těžkých kovů typů • ochrana buněčné kultury před výkyvy prostředí a toxickými vlivy (změny pH ionty těžkých kovůtoxickými vlivy (změny pH, ionty těžkých kovů, endotoxiny, proteolytické enzymy) Nevýhody použití séra : toxickými vlivy (změny pH, ionty těžkých kovů, endotoxiny, proteolytické enzymy) Nevýhody použití séra :Nevýhody použití séra : • potíže s reprodukovatelností (původ zvířat, krmení, roční doba…) • riziko kontaminace Nevýhody použití séra : • potíže s reprodukovatelností (původ zvířat, krmení, roční doba…) • riziko kontaminace• riziko kontaminace • dostupnost a cena • vliv na produkci proteinů do média • riziko kontaminace • dostupnost a cena • vliv na produkci proteinů do média Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 23 2323 Typy médií pro savčí buňky: • Eagleovo médium (BME) a jeho modifikace Typy médií pro savčí buňky: • Eagleovo médium (BME) a jeho modifikace• Eagleovo médium (BME) a jeho modifikace (např. EMEM, AMEM, DMEM, GMEM, JMEM) • RPMI média • Eagleovo médium (BME) a jeho modifikace (např. EMEM, AMEM, DMEM, GMEM, JMEM) • RPMI média• RPMI média (např. RPMI 1629, RPMI 1630, RPMI 1640) • další média užívaná se sérem • RPMI média (např. RPMI 1629, RPMI 1630, RPMI 1640) • další média užívaná se sérem• další média užívaná se sérem (např. Fischerovo, Williamsovo) • média užívaná bez séra • další média užívaná se sérem (např. Fischerovo, Williamsovo) • média užívaná bez séra• média užívaná bez séra (TC199, MCDB) • média užívaná bez séra (TC199, MCDB) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 24 2424 Sterilní prostředíSterilní prostředíp • práce v tzv. laminárních boxech (HEPA filtry) - typ podle úrovně Biosafety Level (BSL) p • práce v tzv. laminárních boxech (HEPA filtry) - typ podle úrovně Biosafety Level (BSL) • jednorázový plastik (sterilizováno radiací) • jednorázový plastik (sterilizováno radiací)(sterilizováno radiací) • sterilní sklo, nástroje a roztoky š á á á í (sterilizováno radiací) • sterilní sklo, nástroje a roztoky š á á á í(horkovzdušná sterilizace, autoklávování) • antibiotika (horkovzdušná sterilizace, autoklávování) • antibiotika (běžně směs Pen/Str, případně gentamycin, amphotericin, nystatin) (běžně směs Pen/Str, případně gentamycin, amphotericin, nystatin) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 25 2525 ÚROVNĚ BIOLOGICKÉHO RIZIKA BIOSAFETY LEVELS (BSL ) BSL 1BSL 1 = BIOSAFETY LEVELS (BSLs) BSL-1 • mikroorganismy, které nezpůsobují onemocnění u zdravých dospělých; standardizované lidské a BSL-1 • mikroorganismy, které nezpůsobují onemocnění u zdravých dospělých; standardizované lidské aý p ý ; živočišné buněčné linie BSL-2 ý p ý ; živočišné buněčné linie BSL-2BSL 2 • běžné patogeny středního rizika, mohou způsobovat různě závažná onemocnění, která lze dobře léčit (HBV Salmonella Toxoplasma klinický BSL 2 • běžné patogeny středního rizika, mohou způsobovat různě závažná onemocnění, která lze dobře léčit (HBV Salmonella Toxoplasma klinickýdobře léčit (HBV, Salmonella, Toxoplasma, klinický materiál - krev, tělní tekutiny, tkáně; některé sbírkové linie - např. HeLa) dobře léčit (HBV, Salmonella, Toxoplasma, klinický materiál - krev, tělní tekutiny, tkáně; některé sbírkové linie - např. HeLa) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 26 2626 Laminární box - biohazard třída I horizontálníhorizontální vertikálnívertikální Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 27 2727 Laminární box - biohazard třída II HEPA filtry (částice > 0 3 mm) HEPA filtry (částice > 0 3 mm) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 (částice > 0,3 mm)(částice > 0,3 mm) 28 2828 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 29 2929 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 30 3030 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 31 3131 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 32 3232 ÚROVNĚ BIOLOGICKÉHO RIZIKA = BIOSAFETY LEVELS (BSLs) BSL-3BSL-3 = BIOSAFETY LEVELS (BSLs) • lokální nebo exotické patogeny vysokého rizika, respiračně přenosné, způsobují závažná a potenciálně letální onemocnění která jsou obtížně • lokální nebo exotické patogeny vysokého rizika, respiračně přenosné, způsobují závažná a potenciálně letální onemocnění která jsou obtížněpotenciálně letální onemocnění, která jsou obtížně léčitelná • Mycobacterium tuberculosis, virus encefalitidy St. Louis antrax potenciálně letální onemocnění, která jsou obtížně léčitelná • Mycobacterium tuberculosis, virus encefalitidy St. Louis antraxLouis, antrax BSL-4 • extrémně rizikové patogeny respiračně přenosné Louis, antrax BSL-4 • extrémně rizikové patogeny respiračně přenosné• extrémně rizikové patogeny, respiračně přenosné, způsobují letální onemocnění, proti nimž neexistuje léčba ani vakcinace hemorrhagické viry (Ebola Marburg) • extrémně rizikové patogeny, respiračně přenosné, způsobují letální onemocnění, proti nimž neexistuje léčba ani vakcinace hemorrhagické viry (Ebola Marburg) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 • hemorrhagické viry (Ebola, Marburg)• hemorrhagické viry (Ebola, Marburg) 33 3333 BIOSAFETY LEVEL 3 (BSL-3) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 34 3434 BIOSAFETY LEVEL 4 (BSL-4) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 35 3535 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 36 3636 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 37 3737 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 38 3838 Typy kontaminací • mykoplazmata Typy kontaminací • mykoplazmata• mykoplazmata • viry • bakterie, plísně, kvasinky k t i ji b ěč li ií • mykoplazmata • viry • bakterie, plísně, kvasinky k t i ji b ěč li ií• kontaminace jinou buněčnou linií (cross-contamination) • kontaminace jinou buněčnou linií (cross-contamination) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 39 3939 Kontaminace – mykoplazmataKontaminace – mykoplazmata Detekce mykoplazmat: a) fluorescencenční mikroskopie Detekce mykoplazmat: a) fluorescencenční mikroskopie) p (značení DNA) b) PCR ) p (značení DNA) b) PCR Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 40 4040 KULTIVAČNÍ POSTUPYKULTIVAČNÍ POSTUPYKULTIVAČNÍ POSTUPYKULTIVAČNÍ POSTUPY Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 41 4141 invertovaný mikroskopinvertovaný mikroskop Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 42 4242 DĚLENÍ BUNĚKDĚLENÍ BUNĚKDĚLENÍ BUNĚK V PODMÍNKÁCH IN VITRO: DĚLENÍ BUNĚK V PODMÍNKÁCH IN VITRO: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 43 4343 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 44 4444 Typy buněčných kultur:Typy buněčných kultur:Typy buněčných kultur: • adherované: rostou přichycené na pevném podkladu Typy buněčných kultur: • adherované: rostou přichycené na pevném podkladurostou přichycené na pevném podkladu • suspenzní: rostou volně v médiu rostou přichycené na pevném podkladu • suspenzní: rostou volně v médiurostou volně v médiu Kultivace na živné vrstvě (feeder-layer): rostou volně v médiu Kultivace na živné vrstvě (feeder-layer):Kultivace na živné vrstvě (feeder layer): • obvykle inaktivované myší buňky (fibroblasty, peritoneální makrofágy) Kultivace na živné vrstvě (feeder layer): • obvykle inaktivované myší buňky (fibroblasty, peritoneální makrofágy) • hybridomy, embryonální kmenové buňky• hybridomy, embryonální kmenové buňky Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 45 4545 Suspenzní kulturySuspenzní kultury SUBKULTIVACE (PASÁŽOVÁNÍ) Suspenzní kultury • odstranění starého média centrifugací • naředění buněk v čerstvém médiu ř í d é k lti č í l h ičk / i k Suspenzní kultury • odstranění starého média centrifugací • naředění buněk v čerstvém médiu ř í d é k lti č í l h ičk / i k• přenesení do nové kultivační lahvičky/misky s čerstvým médiem Adherované buňky • přenesení do nové kultivační lahvičky/misky s čerstvým médiem Adherované buňkyAdherované buňky • odstranění starého média, oplach v pufru • uvolnění buněk z podkladu proteolýzou fokálních dh í (t i ) Adherované buňky • odstranění starého média, oplach v pufru • uvolnění buněk z podkladu proteolýzou fokálních dh í (t i )adhezí (trypsin) • inaktivace trypsinu přidáním séra • alternativa: mechanické uvolnění (škrabky) adhezí (trypsin) • inaktivace trypsinu přidáním séra • alternativa: mechanické uvolnění (škrabky)( y) • centrifugace, naředění buněk v čerstvém médiu • přenesení do nové kultivační lahvičky/misky s čerstvým médiem ( y) • centrifugace, naředění buněk v čerstvém médiu • přenesení do nové kultivační lahvičky/misky s čerstvým médiem Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 s čerstvým médiems čerstvým médiem 46 4646 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 47 4747 TYPY KULTIVACÍ (TERMINOLOGIE) TYPY KULTIVACÍ (TERMINOLOGIE)(TERMINOLOGIE)(TERMINOLOGIE) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 48 4848 TKÁŇOVÉ KULTURY / CELL CULTURESTKÁŇOVÉ KULTURY / CELL CULTURES// • orgánová/tkáňová kultura (organ/tissue culture)• orgánová/tkáňová kultura (organ/tissue culture) trojrozměrná kultura nerozvolněné tkáně, která si uchovává histologické znaky a vlastnosti původní tkáně v prostředí in vivo trojrozměrná kultura nerozvolněné tkáně, která si uchovává histologické znaky a vlastnosti původní tkáně v prostředí in vivopůvodní tkáně v prostředí in vivo • buněčná kultura (cell culture) kultura odvozená z jednotlivých buněk, které už původní tkáně v prostředí in vivo • buněčná kultura (cell culture) kultura odvozená z jednotlivých buněk, které užkultura odvozená z jednotlivých buněk, které už nejsou spojeny do struktury tkáně • primokultura / primární kultura (primary culture) kultura odvozená z jednotlivých buněk, které už nejsou spojeny do struktury tkáně • primokultura / primární kultura (primary culture) buňky v kultuře jsou získány přímo z původní tkáně nebo fragmentu orgánu buňky v kultuře jsou získány přímo z původní tkáně nebo fragmentu orgánu Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 49 4949primokultura multiformního glioblastomu - 5. denprimokultura multiformního glioblastomu - 5. den Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 50 5050primokultura multiformního glioblastomu - 12. denprimokultura multiformního glioblastomu - 12. den Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 51 5151primokultura multiformního glioblastomu - 12. denprimokultura multiformního glioblastomu - 12. den Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 52 5252 Buněčná linieBuněčná linie • populace buněk odvozená z primokultury při první pasáži a dále udržovaná v podmínkách in vitro • populace buněk odvozená z primokultury při první pasáži a dále udržovaná v podmínkách in vitrovitro (pasáž = přenos buněk z jedné kultivační nádobky do nádobky nové) vitro (pasáž = přenos buněk z jedné kultivační nádobky do nádobky nové)y y ) • diploidní (normální nenádorové buňky) • stabilizovaná (nádorově transformované buňky) y y ) • diploidní (normální nenádorové buňky) • stabilizovaná (nádorově transformované buňky)• stabilizovaná (nádorově transformované buňky) • charakterizace buněčné linie: označení (název) druh organismu pohlaví věk • stabilizovaná (nádorově transformované buňky) • charakterizace buněčné linie: označení (název) druh organismu pohlaví věkoznačení (název), druh organismu, pohlaví, věk, výchozí orgán, typ kultury, počet pasáží, růstové parametry, morfologie, karyotyp, markery označení (název), druh organismu, pohlaví, věk, výchozí orgán, typ kultury, počet pasáží, růstové parametry, morfologie, karyotyp, markery Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 p y, g , y yp, yp y, g , y yp, y 53 5353 Buněčný kmenBuněčný kmenBuněčný kmen • buněčná populace, získaná subkultivací z původní linie vyselektována na základě Buněčný kmen • buněčná populace, získaná subkultivací z původní linie vyselektována na základěz původní linie - vyselektována na základě exprese určitého znaku z původní linie - vyselektována na základě exprese určitého znaku Buněčný klon • buněčná populace, vzniklá pomnožením jediné ň é ů í Buněčný klon • buněčná populace, vzniklá pomnožením jediné ň é ů íbuňky, izolované z původní linie • všechny buňky v buněčném klonu teoreticky id ti ké š k i čitý t ň buňky, izolované z původní linie • všechny buňky v buněčném klonu teoreticky id ti ké š k i čitý t ňidentické, avšak v praxi určitý stupeň heterogenity identické, avšak v praxi určitý stupeň heterogenity Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 54 5454 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 55 5555 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 56 5656 NORMÁLNÍ A TRANSFORMOVANÉ BUNĚČNÉ LINIE NORMÁLNÍ A TRANSFORMOVANÉ BUNĚČNÉ LINIEBUNĚČNÉ LINIEBUNĚČNÉ LINIE Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 57 5757 Růstové parametry buněčných linií:Růstové parametry buněčných linií: • generační doba období mezi dvěma mitózami = délka b ěč éh kl • generační doba období mezi dvěma mitózami = délka b ěč éh klbuněčného cyklu • population doubling time (PDT) čas potřebný ke zdvojnásobení počtu buněk v buněčného cyklu • population doubling time (PDT) čas potřebný ke zdvojnásobení počtu buněk včas, potřebný ke zdvojnásobení počtu buněk v populaci • lifespan (délka života) čas, potřebný ke zdvojnásobení počtu buněk v populaci • lifespan (délka života)lifespan (délka života) geneticky naprogramovaný počet dělení buňky • kontaktní inhibice lifespan (délka života) geneticky naprogramovaný počet dělení buňky • kontaktní inhibice zástava proliferace po dosažení určité limitní saturační density zástava proliferace po dosažení určité limitní saturační density Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 58 5858 Kontaktní inhibiceKontaktní inhibice Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 59 5959 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 60 6060 Diploidní buněčné linie:Diploidní buněčné linie: • normální nenádorové buňky • omezená délka života in vitro • normální nenádorové buňky • omezená délka života in vitro • standardní karyotyp (diploidní) • obvykle anchorage-dependent • standardní karyotyp (diploidní) • obvykle anchorage-dependenty g p (vyžadují substrát k přichycení) • schopnost kontaktní inhibice y g p (vyžadují substrát k přichycení) • schopnost kontaktní inhibice • tzv. "stárnutí kultury" = změna morfologie a růstových parametrů se vzrůstající dobou v d í ká h i it • tzv. "stárnutí kultury" = změna morfologie a růstových parametrů se vzrůstající dobou v d í ká h i itpodmínkách in vitro • LEP (lidské embryonální plíce) HPLC (lidské lymfocyty periferní krve) podmínkách in vitro • LEP (lidské embryonální plíce) HPLC (lidské lymfocyty periferní krve) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 HPLC (lidské lymfocyty periferní krve)HPLC (lidské lymfocyty periferní krve) 61 6161 Stabilizované buněčné linie: nádorově transformované buňky Stabilizované buněčné linie: nádorově transformované buňky• nádorově transformované buňky • neomezený generační potenciál = nesmrtelnost v podmínkách in vitro • nádorově transformované buňky • neomezený generační potenciál = nesmrtelnost v podmínkách in vitrov podmínkách in vitro • kratší PDT, redukovaná závislost na podkladu b kl h t l id í l id í v podmínkách in vitro • kratší PDT, redukovaná závislost na podkladu b kl h t l id í l id í• obvykle heteroploidní, resp. aneuploidní • často bez schopnosti kontaktní inhibice • obvykle heteroploidní, resp. aneuploidní • často bez schopnosti kontaktní inhibice • lidské adherované: HeLa, A431, MCF-7, Saos-2… lidské suspenzní: HL-60, Jurkat, HeLa-S… L929, 3T3 (myší fribroblasty), • lidské adherované: HeLa, A431, MCF-7, Saos-2… lidské suspenzní: HL-60, Jurkat, HeLa-S… L929, 3T3 (myší fribroblasty),L929, 3T3 (myší fribroblasty), CHO (chinese hamster ovary) MDCK (Madine-Darby canine kidney) VERO (African green monkey kidney) L929, 3T3 (myší fribroblasty), CHO (chinese hamster ovary) MDCK (Madine-Darby canine kidney) VERO (African green monkey kidney) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 VERO (African green monkey kidney)VERO (African green monkey kidney) 62 6262 Rozdíl v počtu chromosomů během kultivaceRozdíl v počtu chromosomů během kultivace ál í b ňkál í b ňknormální buňky (gliové buňky) normální buňky (gliové buňky) transformované buňky (maligní melanom) transformované buňky (maligní melanom)(maligní melanom)(maligní melanom) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 63 6363 PRAKTICKÉ APLIKACEPRAKTICKÉ APLIKACEPRAKTICKÉ APLIKACEPRAKTICKÉ APLIKACE Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 64 6464 • základní výzkum (buněčná biologie, cytogenetika onkologie imunologie biochemie • základní výzkum (buněčná biologie, cytogenetika onkologie imunologie biochemiecytogenetika, onkologie, imunologie, biochemie, molekulární biologie, virologie…) • prenatální diagnostika cytogenetika, onkologie, imunologie, biochemie, molekulární biologie, virologie…) • prenatální diagnostikap g • toxikologie (testy léčiv, kosmetických přípravků, implantátů d kč í di í (IVF) p g • toxikologie (testy léčiv, kosmetických přípravků, implantátů d kč í di í (IVF)• reprodukční medicína (IVF) • klinická onkologie (typizace nádorů, testování multidrug resistance hodnocení markerů) • reprodukční medicína (IVF) • klinická onkologie (typizace nádorů, testování multidrug resistance hodnocení markerů)multidrug resistance, hodnocení markerů) • výroba očkovacích látek (virové vakcíny) • průmyslová výroba specifických buněčných multidrug resistance, hodnocení markerů) • výroba očkovacích látek (virové vakcíny) • průmyslová výroba specifických buněčnýchp y ý p ý ý produktů (transgenní linie) • příprava buněčných a tkáňových derivátů (např. kůže) p y ý p ý ý produktů (transgenní linie) • příprava buněčných a tkáňových derivátů (např. kůže) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 kůže)kůže) 65 6565 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 66 6666 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 67 6767 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 68 6868 KRYOKONZERVACE, ARCHIVACE, Í Á Š Ě KRYOKONZERVACE, ARCHIVACE, Í Á Š ĚSBÍRKOVÁ PRACOVIŠTĚSBÍRKOVÁ PRACOVIŠTĚ Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 69 6969 Kryokonzervace živočišných buněk • kultura v exponenciální fázi růstu Kryokonzervace živočišných buněk • kultura v exponenciální fázi růstu• kultura v exponenciální fázi růstu • po trypsinizaci resuspendování v zamražovací směsi: • kultura v exponenciální fázi růstu • po trypsinizaci resuspendování v zamražovací směsi: 90% sérum (FCS) + 10% kryoprotektivum (DMSO, glycerol) • dvoustupňové zamražování: 90% sérum (FCS) + 10% kryoprotektivum (DMSO, glycerol) • dvoustupňové zamražování:• dvoustupňové zamražování: "pomalý krok" (optimální pokles o 1oC za minutu) "rychlý krok" (přemístění kryoampulí z -8OoC do • dvoustupňové zamražování: "pomalý krok" (optimální pokles o 1oC za minutu) "rychlý krok" (přemístění kryoampulí z -8OoC do -yc ý o (p e stě yoa pu 8O C do 15OoC (hlubokomrazící boxy) nebo do -196oC (kontejnery s tekutým dusíkem) • rozmražování: yc ý o (p e stě yoa pu 8O C do 15OoC (hlubokomrazící boxy) nebo do -196oC (kontejnery s tekutým dusíkem) • rozmražování:• rozmražování: nejprve rychlé ohřátí (rozmražení směsi), pak pomalé přidávání vychlazeného média (cca 1ml za i ) • rozmražování: nejprve rychlé ohřátí (rozmražení směsi), pak pomalé přidávání vychlazeného média (cca 1ml za i ) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 minutu)minutu) 70 7070 PříkladyPříklady kryoprotektiv:kryoprotektiv: glyceroldimethylsulfoxid (DMSO) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 71 7171 ž á í ř ž í ěž á í ř ž í ěVliv rychlosti zamražování na přežití buněk:Vliv rychlosti zamražování na přežití buněk: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 72 7272 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 73 7373 American Type Culture Collection (ATCC)American Type Culture Collection (ATCC) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 74 7474 European Collection of Cell Cultures (ECACC)European Collection of Cell Cultures (ECACC) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014 75 7575 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 17.2.2014