BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie
BUNECNASMRT
RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU
EVROPSKÁ UNIE
MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, I
MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY      pro konkuroncwchopnwt
INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ
Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky
„For every cell,
there is a time to live and a time to die/'
Program přednášky:
• typy buněčné smrti
• nekróza
• autofagie
• apoptóza
• metodické přístupy ke studiu apoptózy
• apoptóza a medicínské aspekty
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
TYPY BUNĚČNÉ SMRTI
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Původní dělení způsobů buněčné smrti:
• smrt v důsledku působení škodlivého vnějšího faktoru:
náhodná (accidental) buněčná smrt = nekrózo
• smrt jako indukovaná sebevražda: programovaná (programmed) buněčná smrt = opoptóza
hodnocení podle morfologických změn
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Buněčná smrt:
• katastrofická buněčná smrt
> nekróza
• fyziologická buněčná smrt
> apoptóza
(programmed cell death type I, PCDI)
• kaspáza-dependentní
• kaspáza-independentní
> autofagie
(programmed cell death type II, PCDII)
hodnocení podle biochemických změn
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Kdy je buňka mrtvá?
• rozrušení plasmatické membrány (důkaz např. inkorporace Pl in vitro)
• rozpad buňky včetně jádra na fragmenty (apobodies)
• fragmenty jsou pohlceny jinými buňkami (in vivo)
rozdíl mezi mrtvou a umírající buňkou
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3. "^Ina^
m
Programmed cell death pathways
•
i
TT
APOPTOSIS
Caspase activation Inhibition of mRNA tansiaüon
Condensation or cell and organelles
Chromatin condensation DNA fragmentation
Loss of membrane asymmetry
Membrane remains impermeable
Cell falls apart into apoptotic bodies
NECROSIS
Pro-inflammatory signaling and cytokine production
Swelling of the cell and organelles
Mottled chromatin condensation
Loss of membrane asymmetry
Rapid loss of membrane permeability
Cell-membrane explodes Remains stay together
i
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Junctions *f—Mitochondria
' 9 r ♦T#
Cells and organelles swell Chromatin condenses Membranes compromised: fluid rushes In —H20
Necrosis
Dissolution of cellular structures
\
Cell lysis
invasion of phagocytic cells Inflammation
© Elsevier. Pollard et al: Cell Biology 2e - www.studentconsult.com
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
m
Apoptosis
/     J I Junctions
Mitochondria Nucleus
Microvilli contract Intercellular junctions break Chromatin begins to condense
Cell shrinks
Chromatin condenses around nuclear periphery
am
© Elsevier. Pollard et al: Cell Biology 2e - www.studentconsult.com
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3
KATASTROFICKÁ (NEPROGRAMOVANÁ) BUNĚČNÁ SMRT
NEKRÓZA
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3. "^Ina^
Indukce nekrózy
a) rozsáhlé poškození, při němž už nemohou být aktivovány mechanismy apoptózy
b) působení stresových faktorů
• změny koncentrace iontů, pH...
• vyčerpání zdrojů energie
• změny teploty
• poškození buňky nebo jejích organel
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Příznaky a průběh nekrózy:
• poškození mitochondriální membrány
• pronikání iontů Ca2+ do mitochondrií
• zakulacení a prasknutí mitochondrií
• ztráta regulace transportu iontů
• zakulacení buňky (swelling)
• lýze buňky
• vznik nekrotického ložiska
• invaze makrofágů
• zánětlivá reakce
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
nekrotické ložisko ve tkáni
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
FYZIOLOGICKÁ (PROGRAMOVANÁ) BUNĚČNÁ SMRT
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3. "^Ina^
PROGRAMOVANÁ BUNĚČNÁ SMRT (Programmed Cell Death, PCD)
• indukovaný, regulovaný a selektivní proces pro vyřazování určitých buněk
Apoptóza (apoptosis, type I PCD)
• kaspázy
• kalpainy, katepsiny, granzymy
Autofagie (autophagy, type II PCD)
• autofagozomy/autolysozomy (lysozomální proteázy)
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
DEVELOPMENT AND PATTERNS OF CELL DEATH
cytotoxic death signals hormonal death signal
APQPTQ3IS
no
inflammation
no
inflammation
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
>
(/i
jmi
AUTOFAGIE (PCDII)
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Průběh autofagie
1. indukce (starvace)
2. vytvoření autofagosomu (nejasný původ, ER?)
3. vazba a fúze s lysosomem
4. rozpad autolysosomálního veziklu
• účast savčích homologů genů Atg (kvasinky) Typy autofagie:
• mikroautofagie (transfer do lysosomu přímou invaginací)
• makroautofagie (vznik autofagosomu)
• chaperon-mediated autofagie (CMA) - selektivní
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Starvation or other stresses
Cell survival
i
Autophagy induction
Isolation membrane
i
Docking and fusion   Amino acids  Fatty acids
Vesicle nucleation
Vesicle elongation \^/ & retrieval
Degradation
Autophagosome
Can. J. Physiol. Pharmacol. 88: 285-295 (2010)
Autolysosome
Autophagic cell death
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
mitochondrie v autofagosomu
(Ml
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3. ^bPjF
APOPTÓZA (PCDI)
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H., Currie, A.R.
Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide ranging
implications in tissue kinetics.
British Journal of Cancer (1972) 26, 239.
aTTOTTTCDGlC
Apoptosis Publications/Year _
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3. \^U^T
2002 - Nobelova cena za fyziologii a lékařství:
Sydney Brenner
John E. Sulston
H. Robert Horvitz
za výzkum genetické regulace vývoje orgánů a
programované buněčné smrti
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
>
(/i
jmi
i/i
Coenorhobditis elegons
• 959 somatických buněk = dospělý hermafrodit,
navíc 131 podléhá apoptóze
• regulace apoptózy -14 genů Ced: Ced-3, Ced-4 - indukce
Ced-9 - represe
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
$k_HP
m.
Soraofy naives, and naives that communca» between aanaery ana muscle nerves
Shirt*« coverng
Gonad
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
(Ml
>
Příčiny apoptózy
1. Apoptóza je nezbytná pro řádný vývoj organismu:
• resorpce ocásku během metamorfózy pulce v žábu
• odstranění tkáně mezi prsty během embryogenéze
• odstranění nadbytečných neuronů při vytváření synapsí v mozku
uvolňování endometria na počátku menstruace
_ IMJ
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3. ^T%^
odstranění nadbytečných neuronů při vytváření synapsí v mozku
nerve cells
o
nerve cell axon
CELL DEATH MATCHES NUMBER OF NERVE CELLS TO NUMBER OF CELLS
«*>^ľl«      TO NUMBER OF .&!';
O O O........T4™ o o o
target cells
survival factor released by target cells
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
syndaktylie (defekt apoptózy)
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
>
(/i
jmi
Příčiny apoptózy
2. Apoptóza je nezbytná pro likvidaci buněk, které představují ohrožení integrity organismu
• buňky infikované viry
• efektorové buňky imunitního systému po odeznění imunitní odpovědi
• buňky s poškozením DNA
zvýšená produkce proteinu p53 (induktor apoptózy)
• nádorově transformované buňky
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Morphology
Apoptosis and Cell Proliferation in Tissue Homeostasis
Proliferation
Apoptosis
Proliferation
Apoptosis
Proliferation
Apoptosis
Proliferation
Apoptosis
Proliferation
Apoptosis
proliferation of colls nooplasia
rogonoration of colls nooplasia
equilibrium
dystrophy
dystrophy
Indukce apoptózy
Odstranění pozitivního signálu
• růstové faktory - neurony
• Interleukin 2 (IL-2) - lymfocyty
activated gene regulatory protein
Indukce apoptózy
Přijetí negativního signálu
• zvýšení hladiny oxidačních látek v buňce
• poškození DNA (volné radikály, UVR, gama záření, chemoterapeutika)
• molekuly (death activators), které se napojují na specifické receptory (death receptors)
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Průběh apoptózy
normální smršťování rozpad apoptotická
buňka (fragmentace) tělíska
(apo-bodies)
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
>
y.
n
Morfologické a biochemické příznaky apoptózy
1. zmenšení (smrštění) buňky
2. poruchy mitochondrií a uvolnění cyt-C
3. blebbing plazmatické membrány
4. změny v plazmatické membráně
5. kolaps jádra (degradace chromatinu)
6. zvýšená aktivita transglutaminázy
7. aktivace kaspáz, proteolytické štěpení
8. rozpad buňky na apoptotická tělíska
9. fagocytóza apoptotických tělísek
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Roche Molecular Biochemicals
Hallmarks of Apoptosis
A poptOS IS
Induction Receptor Activation
Cytochrome o / Apaf-1 Comdex Formation
Docrasmg Mitochondrial Potential
Activation of Caspasas
Phosphatidylsonno Exposure
Morphological Changes
DNA Fragmentation
120   Time (min)
on with Thfu / Acfcnomyon D
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Metodické aspekty studia apoptózy
morfologické příznaky (1972)
blebbing membrány, kondenzace chromatinu, kolaps jádra, vznik apo-bodies
fragmentace DNA (1987)
fragmenty: ladder, zlomy v řetězcích: TUNEL
aktivace proteolytické kaskády (1995)
produkty proteolytického štěpení
změny plazmatické membrány (1997)
externalizace fosfatidylserinu: annexin-V
změny mitochondrií (1998)
změny permeability mitochondriální
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
membrány, detekce Cytochomu C a AIF llil ''-
*9J
Blebbing plazmatické membrány
• degradace kortikálního cytoskeletu (fodrin, aktin)
Motoneuron disease: an apoptopic neuron seen by scanning electron microscopy
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
>
(/i
jmi
S/J
Změny v plazmatické membráně
• externalizace fosfatidylserinu („eat me" signal)
Phosphatidylserine "Flip''
m«mboni osymmttry
phctphoiidylt»rin« r»dňtnb«irk>n
ApoptOSiS Induced
1
b«for«
olt«r
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
>
y.
Ví
n
Změny v plazmatické membráně
• detekce fosfatidylserinu
• Annexin V + fluorochrom
Annexin V Conjugates
Flow Chart of the Annexin V Assay
Collect cells by centrifugatlon
Add annexin V conjugate in IX binding buffer
Incubate 5 min in the dark
Analyze by flow cytometry or fluoresence microscopy
ps> Annexin V ps> Annexin V
EGFP
► i
Cy5
j^^^^nnexn^
[w\ps> Annexin V
PE
_ (HI
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3. ^JLJ^F
Změny v plazmatické membráně
• detekce fosfatidylserinu - Annexinem V
• flow cytometrie
fsc-a     **m AnnexinVFITC
Legend. Jurkat T-cells were UV-B irradiated and incubated overnight. Cells were labelled with AnnexinVFITC for 15 min at RT with 5 uxj/ml PI. Annexin V pos itive-PI negative events are apoptotic (4.5%) with double positive events showing dead cells (9%) and double negative cells being Alive.Courtesy of the Flow Cytometry Core Facility, ICMS, 4 Newark Street, London E1 2AT.
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Kolaps jádra (degradace chromatinu)
• kondenzace chromatinu na periferních oblastech jádra
• internukleosomální štěpení DNA - žebříček (ladder)
• fragmentace jádra
DNA fragmentation by CAD during apoptosis
CAD ICAO
ICAO
0
CAD
7
activation of ca spaseš
/
apoptotic stimuli
DNA fragmentatiofi
CAD - kaspázou aktivovaná Dnáza ICAD-inhibitor CAD
Detekce štěpení DNA:
TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling
1« Terminal transferase ♦ X-CN1P(■)
5
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Aktivace proteolytického štěpení
Kaspázy
• cysteinové proteázy, štěpící na karboxyskupině kyseliny asparagové
• caspases = cysteinyl-aspartic-acid-proteases
• 14 druhů kaspáz (u člověka):
iniciační (apikální - 8, 9,10 a 12) efektorové (exekuční - 3, 6 a 7) pro-inflamatorní
Katepsiny, kalpainy, granzymy
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Aktivace kaspáz, proteolytické štěpení
prokaspáza
kaspáza
aktivní kaspáza
32-53 kDa
pro-domam (3-24 kDa)
Q = active site
large subunit (17-21 kDa)
(cleavage J
V
small subunit (10-13 kDa)
>C
large subunit/small subumt heterodimers
active tetramer
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Aktivace proteolytického štěpení
Substráty kaspáz - proteiny
• „cell death" proteiny (Bcl-2,Bcl-XL, prokaspázy..)
• regulátory b. cyklu (MDM2, p21, Rb, cyklin A..)
• cytoskelet (aktin, fodrin, keratiny, laminy..)
• DNA metabolismus (ICAD, PARP..)
• RNA metabolismus
• signální dráhy
• transkripční faktory
• proteiny spojené s neurodegenerativními chorobami
_ (Ml
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3. ^T%^
Aktivace kaspáz - fluorescenční mikroskopie
a-tubulin / DAPI     aktivovaná kaspáza 3
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Aktivace kaspáz - detekce (WB)
Kaspáza-3
Full length Caspase-3
Cleaved : Caspase-3
1   5   2   1   05 .02 01  0 Staurosporine (pM)
Lamin A
76 57
46.5 37.5 28
Cleaved Lamin A (Asp230)
Lamin A
Cleaved Lamin A
♦ Staurosporine
Poly (ADP-ribose) polymerase
200 140
100 80
60
50
40
30
20
PAR P
Cleaved PARP (Asp214)
- Staurosporine
- EtoposkJe
♦ CHX/TNF-a
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Rozpad buňky na apoptotická tělíska
účast nově formované aktinové 3D struktury a nesvalového myosinu
apoptotická tělíska obsahují zbytky jádra, organely a části cytoplazmy
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
>
(/i
jmi
Fagocytóza apoptotických tělísek
• pohlcení apoptotických tělísek okolními buňkami (makrofágy, dendritické buňky)
• fagocytující buňky vylučují cytokiny, které
zabraňují zánětu ve tkáni
Apoptóza vyvolaná vnitřními signály:
• zdravá buňka exprimuje na vnější membráně mitochondrií BCL-2
- BCL-2 inhibuje oligomerizaci BAK a BAX
• při vnitřním poškození buňky (poškození DNA, Ca2+...)
- permeabilizace vnější membrány (póry z BAK, BAX proteinů)
- uvolnění cytochromu-c do cytoplasmy
• vzniká apoptosom:
APAF-1 Cytochrom C prokaspáza 9 (dATP)
• vzniká aktivní kaspáza 9 (iniciační), která štěpením aktivuje další
kaspázy (efektorové)
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3. "^InaV
First stage of apoptosome formation
Recruitment of procaspase-9
Death receptor pathway
Mitochondrial pathway
Cleaved substrates
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Změny mitochondrií
změna permeability
mitochondriální
membrány
detekce cytochomu-C
- fl. mikroskopie
- flow-cytometrie
(A) CONTROL
cytochrome-c-GFP
(B) UV TREATED
cytochrome-c-GFP
Figure 18-7 Molecular Biology of the Cell
mitochondrial dye
I_I
10 |xm
anti-cytochrome c
I_I
25 fim
(ft Garland Science 2008)
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Apoptóza vyvolaná vnitřními signály, nezávislá na kaspázách
• probíhá i při aplikaci inhibitoru kaspáz
• průběh smrti je delší
• ztráta mitochondriálního transmembránového potenciálu
• inhibice respiračního řetězce
• štěpení DNA pomocí AIF a ENDOG (apoptosis inducingfactor, endonukleáza G)
PTPC
_ .    CYTC      DIABLO HTRA2
Pro-caspase-9   o © Qo     9<3 Q z> oC°C °°
APAF1
ApOpKMOdM
Procaspase-3
Caspase-3
CASPASE-DEPENDENT APOPTOSIS
Cytoskelelon
ATP SYNTHESIS CESSATION
EXCESS ROS
RESPIRATORY CHAIf INHIBITION
CASPASE-INDEPENDENT APOPTOSIS
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
>
i/i
Apoptóza vyvolaná vnějšími signály:
aktivační molekuly (death activators) se napojují na specifické receptory v plazmatické membráně (death receptors. DRl-5):
Tumor necrosis factor a (TNF-a) - TNF receptor Lymphotoxin (TNF-(3) - TNF receptor Fas-ligand (FasL) - Fas receptor (CD95)
přenos signálu do cytoplasmy aktivuje prokaspázu-8 (-10) (iniciační kapázy)
aktivovaná kaspáza-8 (-10) štěpením dalších prokaspáz spouští proteolytickou kaskádu
DISC
death-inducing signaling complex
• ligand
• receptor
• adaptorové proteiny
• prokaspáza-8
plamsa membrane
Death Domain
FADD-
Pro-caspase 8
JL
Apoptotic Signalling Pathway Pathway
TN Fa
TNFR1 receptors
TRADD
TRAF-2
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Death receptor pathway
Mitochondrial pathway
Cleaved substrates
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Apoptóza vyvolaná vnějšími signály:
dependence receptotors (např. DCC)
• rozdílná signalizace:
• při navázaném ligandu ->přežívání buňky
• po uvolnění ligandu -> aktivace kaspázové kaskády
MAPK activation (ERK-1/2)
GTPase activation (Rac-D
Survival Signal
Death Signal
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Současné rozdělení regulované buněčné smrti
a) autofagická buněčná smrt
b) apoptóza vyvolaná vnitřními signály, závislá na kaspázách
c) apoptóza vyvolaná vnitřními signály, nezávislá na kaspázách
d) apoptóza vyvolaná vnějšími signály, aktivací death receptors
e) apoptóza vyvolaná vnějšími signály, (de)aktivací dependence receptors
f) anoikis-smrt způsobená ztrátou kontaktu k podkladu nebo okolním buňkám (mechanismus vnitřní apoptózy)
g) cornification (keratinizace) - terminálni diferenciace epidermálních buněk, vznik vrstvy mrtvých keratinocytů (=stratum corneum)
h) entosis (buněčný kanibalismus) - pohlcení buňky stejným typem (ne fagocytem), postupná degradace ve fagozomu
Loss of integrin attachment
Anoikis
Loncrtn. proMaggnn. trtcnohyaln. invohjcfln. SPRs. S100A proteins
TG3.
1. -2e. -9.-10. 1. desmocofci-i
TG1JG5. deemogtein-2. -3. -4
Karabn-5. -14. TG2. BWVG1
8PAG2/coiagen.i7 Qfßj integrin. iammn-5
cornification
Invasion
Cell-rxell
Nature Reviews | Molecular Cell Biology
Cell death
entosis
Single cells (release)
Cel drvrscn
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407013943
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
>
y.
jmi
Současné rozdělení regulované buněčné smrti
i) mitotická katastrofa - iniciace navození smrti v M-fázi buněčného cyklu vlivem poškození mitotického aparátu
i) necroptosis (regulovaná nekróza) - smrt vyvolána aktivací death receptoru při současné inaktivaci kaspáz (8,10) ^ER
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
k) netosis - odvozeno od NET (Neutrophil Extracelular Trap) = mikrobicidní struktura složená z chromatinu, histonů a antimikrobiálních proteinů produkovaná granulocyty
smrt specifická pro granulocyty, nezávislá na kaspázách; silná vakuolizace cytoplazmy, dekondenzace chromatinu, rozpad membrány jádra a granulí -podobnosti s autofagií a regulovanou nekrózou
I) parthanatos - při nadměrné aktivaci PARP (poly ADP-riboza polymeráza), tvorba PAR, následná degradace chromatinu; popsánu u mrtvice, diabetu a neurodegenerativních chorob
m) pyroptosis - původně popsáno u makrofágů po infekci (S. tiphymurium), typickým příznakem aktivace kaspázy-l->aktivace pyrogenního IL-1B ^jers/7,
_imj
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3. ^T%^
Apoptóza a nádory
Chemo- a rádio- terapií indukovaná buněčná smrt strategie:
• zabránit neregulovanému buněčnému dělení nádorových buněk
• ovlivnění buněčného cyklu a DNA syntézy u rychle se dělících buněk
- antimetabolity j
- genotoxické látky
- mitotické inhibitory
defekty v apo dráhách negativně ovlivňují léčbu
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Chemo- a rádio- terapií indukovaná buněčná smrt - signalizace
• indukce poškození DNA - (DNA damage signál)
• přenos z DNA vazebných proteinů na kinázy PI3K rodiny (ATM, ATR) - funkce v kontrolních uzlech
• fosforylují efektorové kinázy (Chkl, Chk2 a c-Abl)
• fosforylace TF - p53, p73, E2R.
• zvýšení exprese genů - skupiny reparace DNA, zástava buněčného cyklu a apoptóza
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Vztah p53 a apoptózy
aktivuje mitochondriální apopotickou dráhu
- upregulace proapoptotických genů (Bax, Bid, Noxa, Puma)
- downregulace antiapoptotických genů (Bcl-2, Mcl-1)
aktivuje receptorovou apoptotickou dráhu upregulace death receptoru (Fas, DR4, DR5)
nezávisle na transkripci
translokace p53 do mitochondrií a vazba na Bcl-2 a Bcl-XL
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3. "^Ina^
Apoptóza a nádory
Inhibice apoptózy nádorových buněk bez účasti virů:
narušení apoptózy aktivované receptory u nádorových buněk (např.)
a) nedostatečná aktivita inicičních kaspáz (8,10) - z důvodu metylace promotoru, delece nebo mutace genu pro kaspázu-8 (neuroblastom, plieni karcinom, Ewingův sarkom, melanomy)
b) sekrece „decoy" molekuly, která se váže na FasLa brání její vazbě na FasR (nádory plic a střeva)
c) sekrece FasL nádorovými buňkami indukuje apoptózu cytotoxických lymfocytů
•    narušení apoptózy spouštěné mitochondriemi u nádorových buněk (např.)
a) delece a/nebo metylace genu pro Apaf-1 (melanom)
b) nedostatečná aktivita iniciční kaspázy 9 (nádory ovaria)
c) overexprese Bcl-2 z důvodu translokace (leukémie) ^j^JI
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3. ^*w^
Apoptóza a nádory
Viry, inhibující apoptózu transformovaných buněk:
tvorba proteinů blokujících apoptózu na různých úrovních
• receptorová apoptóza
• mitochondriální apoptóza
• p53
• podpora proliferačních signálních drah
• Human papilloma virus (HPV):
exprese proteinu E6 - inaktivátor proteinu p53
• Epstein-Barrové virus (EBV): produkuje protein, podobný proteinu Bcl-2
Cellular ligands bind to death receptors
vFLIP
(herpesvirus, L poxvirus)
CrmB/C/D (poxvirus) M-T2 (myxomavirus)
vBcl-2
(herpesvirus,
ASFV, ^adenovirus)v
RID	
(adenovirus).	
BH3: Bid, Bad.
Caspase-8
I
IAP (baculovirus)] /    | Caspase^3
CrmA (poxvirus)
I
P35 (baculovirus)
Cleaved: Öid.Bad, Bcl-xL,etc.
Apoptosome: Cytc + Caspase-9 -fApaf-1
Cellular growth factor receptor receives survival signal
Signaling: PI3K,Akt, PAK
h.
Mitochondria]
Granzyme B
Apoptosis
Middle T ag^
(Polyomavirus) Nef (HIV) Tat (HIV) ^HBx (hepatitis B virusy
L4-100K
(adenovirus)
Induce pro-death gene expression
M11L (myxomavirus) vMIA(herpesvirus CMV)
r Large T ag (SV40) ^ E1B-55K (adenovirus) E4orf4 (adenovirus) ^E6 (papilloma virus)
p53
When Cells Die II: R. A. Lockshin, Z. Zakeri
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
>
Apoptóza a imunitní systém
• nutnost odstranění aktivovaných lymfocytů
• produkují protilátky a cytokiny, jsou cytotoxické
Regulace apoptózy
• omezení růstových faktorů (IL-2)
pro T buňky reagující na vnější a přechodné antigény
• pomocí „death" molekul (Fas ligand)
pro T buňky reagující na vnitřní a trvalé antigény
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3. ^vS^
Apoptóza a imunitní systém
defekty v indukci apoptózy a autoimunitní choroby
• neschopnost navození apoptózy a přežívání auto-reaktivních lymfocytů
- mutace ve Fas receptoru (CD95) nebo Fas ligandu
-> lymfadenopatie (zvětšení uzlin), akumulace lymfocytů
• účast „death" receptoru a ligandů v poškození okolní tkáně místo lymfocytů
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Defekty v indukci apoptózy a autoimunitní choroby
systémový lupus erythematodes (SLE), lupenka,
revmatoidní artritída, Hashimotovo struma...
Pleural effusions
Heart problems
Butterfly rash
Lupus nephritis
r	£9
	
	- i
Symptoms of
systemic lupus
ArthHHc erythematosus Annntis   may vary w1(jely
with the individual
Raynaud's phenomenon
*Adam
systémový lupus erythematodes
- častěji u žen (90%)
- motýlový erytém na obličeji
- artritída
- zánět ledvin
- nedokrvení periferii
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
>
y.
jmi
i/i
Autoimunitní choroby: systémový lupus erythematodes
porucha funkce makrofágů vznik sekundární nekrózy uvolnění prozánětlivých látek vystavení autoantigenů
zánět
NHD
\
Sekondary necrosis
/Danger Signals
SLE
Antigen
Macrophage
■) Clearance of apoptotic cells by macrophages is efficient
Cells don't become secondary necrotic and danger signals are not released
No establishing of auto antigens and no inflammation
Tolerance
■> Clearance of apoptotic cells by Macrophages is impaired
■> Danger signals released by secondary necrotic cells
■> Accessibility of autoantigens and inflammation
Chronic Autoimmunity
Fig. "Defects jta tf» clearance of apoptotic cells is a possible pathway to autoimmune disease"
CRP -*C-reactive protein, PS -»phosphatidyfserine, IgM -* immunoglobulin M, R2GPI -»£ 2 glycoprotein I,
SLE -> systemic lupus erythematosus, NHD -* normal healthy donor
-=31
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
>
y.
Vi
m
Apoptóza a imunitní systém
AIDS:
pokles CD4+ T-lymfocytú
• pouze část infikována HIV, většina umírá apoptózou
• infikované buňky produkují virové proteiny (Tat, gpl20, Nef, Vpu),
• blokují Bcl-2, aktivují pro-kaspázu 8
• změny v expresi cytokinů     IL-4, IL-10; 4, IL-12, INF-y)
• viry a jejich proteiny v extracelulární prostoru aktivují apoptózu v okolních lymfocytech
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
Apoptóza a degenerativní onemocnění
Alzheimerova choroba Parkinsonova choroba Huntingtonova choroba
nejasné mechanismy indukce apoptózy:
• volné radikály
• nedostatečná hladina nervových růstových faktorů
• vysoká hladina neurotransmiterů
• vnitrobuněčná akumulace toxických proteinů
_ IM)
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3. ^T%^
BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 03 / 3.3.
>
y.
jmi