BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie FERTILIZACE A EMBRYOGENÉZE RNDr. Jakub Neradil, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU EVROPSKÁ UNIE MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ. MLÁDEŽE A TELOVÝCHOVY pro konkurenceschopnost INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Program přednášky: • meióza a gametogeneze • mechanismy fertilizace • časná embryogeneze • hybridi a chiméry BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. Způsoby rozmnožování eukaryot Nepohlavní rozmnožování • potomstvo geneticky identické s rodičovským organismem Pohlavní rozmnožování • původní kombinace genů zanikají a vznikají nové -> každý organismus je geneticky jedinečný • kompetitivní selekční výhoda pro organismy v nepředvídatelně variabilním prostředí BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. "^Ina^ r7> MEIOZA DIPLOIDIE HAPLOIDIE FUZE GAMET BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. "^Ina^ MEIÓZA BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. "^Ina^ MEIOZA • dvě po sobě jdoucí dělení: L meiotické (heterotypické, redukční) II. meiotické (homeotypické, ekvační) Geneticky vyznám meiózy: • redukce počtu chromozomů při tvorbě pohlavních buněk • náhodná segregace chromozomů - v gametách 2n (223 = 8.388.608) možných kombinací chromosomů • párování homologických chromosomů, které umožňuje crossing-over a tím i rekombinaci genů .^||Rjj\ _f [Ml I BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. ^T%^ diploid parents I I MEIOSIS © 3 haploid egg haploid sperm FERTILIZATION • diploid zygote MITOSIS diploid organism diploid parents mother father haploid egg haploid sperm FERTILIZATION diploid zygote I MITOSIS maternal chromosome paternal chromosome diploid organism Bi8120 Aplikovanä bunecnä biologie - jam 2014 - 04 / 10.3. > y. S/J tři páry homologních chromosomů _možné gamety BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. diploid germ-cell precursor | DMA REPLICATION (PAIRING OF HOMOLOGOUS DUPLICATED CHROMOSOMES I CHROMOSOME CROSSING-OVER \ (RECOMBINATION) Stádia meiotického dělení Premeiotická interfáze Meióza I: profáze I: (A) o r i PACHYTENE eptotene zygotene pachytene diplotene diakineze metafáze I, anafáze I, telofáze I Meióza II: profáze II, metafáze II, anafáze II, telofáze II MOUSE LEPTOTENE ZYGOTENE DIPLOTENE + DIAKINESIS completion -of meiosis I and entire meiosis II (A) Metaphase plate In mitosis: (6) Metaphase plate In meiosis homologous chromosomes act homologous chromosomes pair Independently BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. Tvorba bivalentů a crossing-over centromere Chromatidy v průběhu l.profáze paternal sister chromatids maternal sister chromatids chromatid chromatid 2 chromatid 3 chromatid 4 INTERPHASE ZYGOTENE DIPLOTENE FOLLOWED BY DIAKINESIS BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. '^h^é m Synaptonemální komplex Transverse Transverse filament filament SYCP (synaptonemal complex protein ) 1 - 3 ^RS/\ BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. Svnaptonemälni komplex MEIOSIS NORMAL CELL DIVISION o 55 > 5 u o CO > O u paternal homologue maternal homologue DNA REPLICATION PAIRING OF HOMOLOGOUS CHROMOSOMES AND CROSSING-OVER HOMOLOGOUS PAIRS OF DUPLICATED CHROMOSOMES LINE UP ON THE SPINDLE AND SEPARATE | DNA REPLICATION DUPLICATED CHROMOSOMES LINE UP INDIVIDUALLY ON THE SPINDLE CELL DIVISION Bi8120 Aplikovanä bunecnä biologie - jam 2014 - 04 / 10.3. > y. S/J Poruchy meiózy a jejich genetické důsledky a) Nerovnoměrný crossing-over • v profázi I • důsledek: ztráta (delece) v jedné a zdvojení (duplikace) ve druhé zúčastněné Chromatide Poruchy meiózy a jejich genetické důsledky b) Neoddělení (nondisjunkce) • chromozomy v anafázi I nebo chromatidy v anafázi II • porucha centromer nebo porucha mitotického aparátu • důsledek: aneuploidie NONDISJUNCTION AT FIRST DIVISION First division Second division n - i n 1 m - 1 NONDISJUNCTION AT SECOND DIVISION n 1 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. > y. m GAMETOGENEZE BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. "^Ina^ Spcmjlogomum Crowľi Mjlurjlio i Mciont II firrt pol.-r t>xl> \ \ \ ) \ ] n # 4| ^ £ ä d d d Oi y. n ^na^ GAMETOGENEZE: SPERMATOGENEZE • primordiální zárodečná buňka -> spermatogonie (46, soustavně se mitoticky dělí) • spermatocyt I. řádu (46, probíhá meióza I.) • spermatocyt II. řádu (23, probíhá meióza II.) • spermatida (23, dozrává bez dalšího dělení) • spermie (23, uvolňují se do lumina semenných kanálků) 1 spermatogonie -► 4 haploidní rovnocenné spermie BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. basal lamina spermatogonium primary spermatocyte secondary spermatocyte spermatid differentiating spermatid spermatozoon in lumen > y. Seminiferous tubule (cross section) Primordial germ cell Spermatogonium (diploid) Mitotic division P Primary spermatocyte (diploid) (in prophase of meiosis I) / \ } First meiotic division Secondary spermatoc *U (haploid) J \ / \ } Second meiotic division 3? 2 (ft 5s Spermatids Spermatids-^— (haploid) (at two stages of differentiation) Sertoli cell Sperm cells (haploid) Průběh spermatogeneze BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. > ^4NA** Syncytia v průběhu spermatogeneze • spojení cytoplasmatickými můstky • synchronizované dělení • spermatogonia typu A = kmenové b. • další typy jsou „committed" • vznik spermatocytů- regulace GDNF (glial derived neurotrofic factor), sekrece Sertoliho b. n|/C = diferenciace /hc= self-renewal clones of human 975.) Type A i spermatogonia Type A2 spermatogonia Type A3 spermatogonia spermatogonia Type A4 spermatogonia Intermediate spermatogonia Type B spermatogonia Spermatids Secondary spermatocytes (2nd meiotic division) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. Morfologie spermie Acrosomal granule Acrosomal vesicle §^Ks^- Golgi Centnoles Mitochondrion 5 um End piece Acrosomal cap Acrosome Principal piece Middle piece Head BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. > (/i jmi GAMETOGENEZE: OOGENEZE • primordiální zárodečná buňka (46, mitotické dělení) • oogonium (46, mitóza, ve 3.měsíci po oplození vývoj v oocyty) GAMETOGENEZE: OOGENEZE • oocyt I. řádu (46, začne meióza I, zastavení v profázi ještě před narozením, při dozrávání se dělící vřeténko přesunuje k periferii buňky-nerovnoměrné dělení) • oocyt II. řádu (+ pólocyt) (23, vstupuje do meiózy II, zastavení v metafázi II.) • ovum (+ pólocyt) (23, meióza dokončena v případě oplození) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. > y. jmi Průběh oogeneze Oogenesis (Figure 42.14) Primordial germ cells I Oogonium (diploid) Primary oocyte First Resting state----/-----\----} meiotic division ft Secondary oocyte x First polar body / —■ — \ I Second meiotic division Second polar body Ootid (haploid) Ovum (haploid) Corpus luteum Primary oocyte Ruptured follicle T - Prima rv follicle Secondary oocyte -Ovary Mature follnle Ovulation (b) 1 ooRonium -► 1 zralé vajíčko + 2-3 póloevtv BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. Stádia folikulu Figuře 5.6 Schematic diagram of stages in follicle development. BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. REGULACE OOGENEZE 1. regulační bod = diplotene meiózy I dlouhodobé zablokování buněčného cyklu (u člověka až 50 let); u některých živočišných druhů až do fertilizace dekondenzace chromosomů, počet = 4n transkripční aktivita -> akumulace materiálu pro časnou embryogenezi, růst oocytu Diplotme * .11 r. -I Hormon.il stitnuUlinn (. omplHiori ol UMMOsis I if r.-vt > BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. \ REGULACE OOGENEZE 1. regulační bod = diplotene meiózy I • hormonální stimulace (LH) -> Cdkl/cyklin B (MPF = maturation promoting factor) -> kondenzace chromosomů, rozpad jaderné membrány, formování spindlu • pouze částečná deaktivace Cdkl, přetrvávající M-fáze (kondenzovaný chromatin, bez jaderné membrány) • anaphase - promoting complex -> spouští anafázi Hormone stimulation Cytokinesis Metaphase II arrest BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. REGULACE OOGENEZE 2. regulační bod = metafáze meiózy II u většiny obratlovců až do fertilizace po cytokinezi I.meiózy - zvýšení aktivity MPF anaphase-promoting komplex syntetizován až po fertilizaci (do té doby blokován) MPF act vi ty' Ca2*-induced cyclin degradation i—Interphase -Mataphase arrest a a 1st polar body mal» and 2nd polar body pronuclei e-C3 © © © zvýšení fluidity) • změna membránového potenciálu (efflux K+) • influx Ca+ a HC03" -> aktivace adenylátcyklázy -> syntéza cAMP -> indukce kapacitace • zvýšení metabolismu a pohyblivosti spermie Kontakt spermie a oocytu • 300 miliónů spermií v ejakulátu -> 200 spermií v místě fertilizace ve vejcovodu • termotaxe, změna teploty až o +2°C • chemoatraktanty uvolňované folikulárními buňka _ (Ml BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. ^T%^ Zona pellucida • extracelulární matrix oocytu (specifické složení) • 3 typy glykoproteinů (ZP2+ZP3, ZP1) • bariéra mezidruhové fertilizace • ZP3 - receptor druhově specifické vazby, na něj se váže GalT (galaktosyl transferáza) spermie Akrosomální reakce • obsah akrosomu uvolněn exocytózou • vazba na ZP3 - indukuje zvýšení koncentrace Ca2+ v cytoplazmě spermií -> exocytóza • hydrolytické enzymy -> průchod zónou pellucidou • vazba proteinů vnitřní akrozomální membrány spermie na ZP2 Zona pellucida Egg plasma membrane — Cortical granule O Q o O O (a) Hyaluronidase helps sperm penetrate the matrix GalT ZP3 o 0 o o o o (b) Binding of sperm to zona o o o o o o° '"Acrosinf. o o o o ° o o (c) Acrosome reaction Mechanismus fúze spermie a oocvtu • u většiny druhů nejasný • u myši: vazba proteinů ADAM na intergriny oocytu • Fertiliny (a, (3) - patří do skupiny ADAM, transmembránové proteiny spermií s vazebnou doménou pro integriny oocytu • CD9 nutný pro fúzi plazmatických membrán (CD9 KO- nefúzuje) • po fúzi exocytóza kortikálních granulí O O (d) Sperm-egg adhesion (e) Cell fusion (/Pronucleus Proteases and glycosidases (f) Cortical granule exocytosis BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. ŕ- y. imi l/i Průběh fertilizace vznik polárního tělíska zmena kone. Ca2+ BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. Fúze prvoiader • u nižších živočichů ihned po fúzi gamet • u savců pouze prostorové přiblížení prvojader • dekondenzace chromatinu, replikace DNA • přiblížení prvojader pomocí MT z centriolu spermie • rozpad jaderných membrán po|ar bodies pronuclei BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. • navázání chromozomů na spindl tvořený z centriolu spermie až při prvním mitotickém dělení zygoty Fúze prvojader haploid egg pronucleus CYTOSOL chromosomes centrosome matrix haploid sperm pronucleus NUCLEAR ENVELOPES INTERDIGITATE; CHROMOSOMES HAVE DUPLICATED REPLICATION OF CENTROSOME. FOLLOWED BY NUCLEAR ENVELOPE BREAKDOWN CHROMOSOMES FROM EGG AND SPERM ALIGN ON A SINGLE METAPHASE SPINDLE DIVISION TO PRODUCE TWO DIPLOID CELLS OY - (Ml BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. > y. Mechanismy blokující polyspermii • primární blok: depolarizace plazmatické membrány oocytu po fúzi s první spermií • sekundární blok - kortikální reakce oocytu: uvolnění obsahu kortikálních granulí -> enzymy měnící vlastnosti zony pellucidy (štěpení ZP2, hydrolýza cukerných zbytků na ZP3) • intracelulární zvýšení koncentrace Ca2+ (vede k dokončení II. meiotického dělení) Důsledky Polyspermie: více centriolů -> multipolární spindl -> porucha segregace chromosomů -> nondisjunkce -> aneuploidie -> zástava vývoje éfíffífr BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. ^v^í^ ČASNÁ EMBRYOGENÉZE BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. Časná embryogenéze u obojživelníků: • velmi krátky buněčný cyklus (30 min) • zmenšování objemu dceřinných buněk Časná embryogenéze u obojživelníků: 3 fáze vývoje: rýhování, gastrulace, neurulace celkem 24h 1. a 2. dělení vertikálně, 3. ekvatoriálně 5. dělení = 32 buněk = blastula 12. dělení = ±4000 buněk = midblastula dělení už nejsou synchronizována, zpomalují se Animal pole Ventral Dorsal Vegetal pole (a) Nomenclature of blastomeres Urrf*rtib7*d *gg Animal Pigmented hemisphere cortical cytoplasm Fertilized egg Midblastula Early ge«truta < 4.000 cells. 7 hours) 120.000 cells. 9 hours) Blastocoel cavity Lata gestruU (12 hours) Unpigmanted vegetal hemisphere lap of blastopore Mesoderm Blastopore BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. > Časná embryogeneze u savců: • zygota - 1. dělení po 24h, 2. a 3. po dalších 12h • vznik blastomer • morula - do 32 buněk • blastocysta - od 64 buněk, trofoektoderm (3/4), inner cell mass = ICM (1/4), blastocoel, zona pelucida Pronuclei Zona Polar bodies (a) Fertilized egg Polar body (b) 2 cells (c) 8 cells (d) Compaction Blastocoel Inner cell mass Trophectoderm (e) Blastocyst BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. > m Gustav Klimt- Danae (1908) Časná embryogenéze u savců: • diferenciace trofoektodermu a) polární část - přiléhá k ECM, proliferuje b) murální část - kolem blastocoelu, velké polyploidní b. • diferenciace ECM a) epiblast - základ pro 3 zárodečné vrstvy b) hypoblast - extraembryonální tkáň blastocyst zona pellucida • Hatching - opuštění zony pelucidy, v děloze, proteolytické enzymy produkované trofoblastem trophoblast Průběh časné embryogenéze u myši Průběh časné embryogenéze u člověka BBľCS Of Neuron Pigment O) Bra n CAN Cells Cardiac Skeletal Tubule Red Blood Smooth Muscle Muscle Ceiiof Ceils MuscJe CetS the Kidney on Gut) Endoderm — (Internal Layer) "PS Lung Čet Thyroid (Alveolar Ceil Cel) Pancreaťc Cell Inner cell mass Blastocyst Trophoblast Tvorba a umístění zárodečných listů u lidského embrya Epiblast EMBRYONIC TISSUES Embryonic ectoderm Embryonic epiblast Primitive streak Amnionic ectoderm ,, Extraembryonic Hypoblast-*■ endoderm -*■ Yolk sac Cytotrophoblast Syncytiotrophoblast Embryonic endoderm Embryonic mesoderm BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. > Zs Extraembryonic mesoderm EXTRAEM BRYONldJ TISSUES t/5 Inaktivace chromozomu X • v časné blastocystě inaktivace paternálního X • zůstává inaktivován v extraembryonálních tkáních • v ICM se inaktivace ztrácí - později náhodná inaktivace © Mature gametes BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. TVORBA HYBRIDŮ A CHIMÉR BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. "^Ina^ CH) HYBRID • z genetického pohledu potomek vzniklý pohlavním rozmnožováním dvou odlišných homozygotů stejného druhu =>heterozygot • z taxonomického pohledu potomek vzniklý z křížení mezi 2 jedinci odlišného taxonu ■ v rámci druhu (poddruhy)-tygr bengálsky x sibiřský ■ mezi druhy - tygr x lev (Panthera tigris x P. leo) ■ mezi rody - ovce x koza (Ovis x Capra) ■ mezi čeleděmi - výjimečně ■ mezi řády - u živočichů není známo BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. MEZIDRUHOVÝ HYBRID • křížení v rámci rodu • potomek fenotypově podobný rodičům • často infertilní (různý počet chromosomů) • odlišnosti v námluvních rituálech, páření a chování • jiná sezóna páření • antigenní reakce na spermie BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. mul, mezek (63 chr.) osel (62 chr.) x kůň (64 chr.) klisna x osel oslice x hřebec BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. ^j^^ zeedonk, zonkey osel (62 ehr.) x zebra (32- 46 ehr.) liger, tigon lev (38 chr.) xtygr (38 chr.) MEZIRODOVÝ HYBRID ■ v/ v / / I I o • knzeni odlišných rodu • přirozeně výjimečný výskyt (Toast of Botswana) • možnost (nutnost) asistované inseminace (cama) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. „Toast of Botswana" (57 chr.); popsán r.2000 ovce (54 ehr.) x koza (60 chr.) odliš Geep = chiméra cama velbloud (74 chr.) x lama (74 chr.) CHIMÉRA řecky Xluaioot (Chĺmaira); latinsky Chimaera BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. CHIMÉRA organismus obsahující alespoň 2 geneticky odlišné buněčné populace původem z odlišných zygot Vznik: • ze 4 buněk- dvě zygoty (tetragametická ch.) • ze 3 buněk - (partenogenetická ch.) • transplantací kostní dřeně (přenos kmenových buněk) • spojením cévních oběhů (anastomózy) u dvojvaječných dvojčat • z časného embrya a diploidních buněk (fůzí, injekcí) Tetragametický chimerismus • vrozený chimerismus - u lidí výjimečně (běžné u primátů) • spojením dvou zygot (časných embryí) • riziko i při asistované reprodukci • organismus obsahuje dvě odlišné sady chomozomů • orgány a tkáně mají jiný původ • viditelné rozdíly: barva očí, vlasů, „Hitchhiker's thumb,, (AR), Blaschkovy linie, pohlaví může být hermafroditní (46,XX/46,XY), 2 populace krvinek (imunologická tolerance obou skupin) Hitchhiker's thumb Blaschkovy linie Tetragameticky chimerismus Zygote 2n=46 Partenogenetický chimerismus • oocyt podléhá partenogenezi a rozdělí se • vznik 2 haploidních buněk • oplozeny 2 spermiemi Zygote 2n=46 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. Androgenetický chimerismus • standardní fertilizace oocytu spermií (23,X) • vznik sekundárního polárního tělíska • endoreplikace parentálního prvojádra • vznik 1 diploidní buňky (46,XX) a lhaploidní (23,X) • haploidní buňka podléhá endoreplikaci ->androgenetická linie Diploidization of the paternal genome and mitotic division of the biparental cell BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. VYUŽITI CHIMÉR VE VÝZKUMU studium vývoje savčího embryogenéze ověření podílu kmenových buněk na vývoji embrya tvorba „nových druhů" medicínský význam příprava - agregačně - mjikacne BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. Embryo O Effbryo PS c*lt» 4 ► Embryo ES c»i» 4 MN •raoryo TSc.tey vEmbryo Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development Patrick P. L. Tarn1 and Jan*t Rossant2 'Embryology Unit. Cniktrens Medical Research Institute. University of Sydney. Westmead New South Wales. Australia -Samuel lunentetd Research institute. Mount Sinai Hospital. Toronto. Ontario. Canada frinai: otamconn uayd edu au and m—antQmaftri on ca MMM by TM Conwy ftdog** 2003 •MiWVMM Inner cell in.IV Primitive I 11(1.nil I 111 J Kpihlast II Trophectoderm dernatitcs _ Inner cell muss i H Kpihlast < I_is 6.0|/Kcloderm (da> 7.0) l'i iniiiiv. endoderm dcri\ati\es Mesoderm Definitive endoderm srdce chimérické myši I (toplacr ni.il cone I Ml .1-1 llll II V (Mil. ecloderm Parietal endoderm Visceral endoderm ] diploid {ECFP.) compartment diploid (EYFP+) compartmenl □ diploid (FP-) compartment BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. y. aitment A I Original Article L*ok*mi» (2006) 20, 857-869. doi:10.1038/sj.leu.2404171; published online 23 February 2006 A population of very small embryonic-like (VSEL) CXCR4+SSEA-l+Oct-4+ stem cells identified in adult bone marrow M Kucia1, R Reca1, F R Campbell1, E Zuba-Surma1, M Majka1, J Ratajczak1 and M 2 Ratajczak1 'stem Cell Biology Program at James Graham Brown Cancer Center, University of Louisville, Louisville, KY, USA Correspondence: Professor MZ Ratajczak, Stem Cell Biology Program, James Graham Brown Cancer Center, University of Louisville, Louisville, KY 40202, USA. E-mail: mzrata01t5llouisville.edu Received 29 January 2006; Accepted 10 February 2006; Published online 23 February 2006. počet: cca 0,02% BM MNC definice: Sca-1+ (stem cell antigen-marker HSC) lin" (lineage-negative) CD45" (Leukocyte Common Antigen) exprimují: SSEA-1, Oct-4, Nanog, Rex-1 velikost: 2-4 |im schopnost diferenciace do různých linií 3 zárodečných vrstev BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. Schéma experimentu VSEL(GFP+) Chiméry: tvorba „nových druhů'' geep (kovce?) chiméra kozy a ovce (ne hybrid) poprvé v roce 1978 Austrálie, Dr R.S. White Chiméry: medicínský význam Critical Reviews in ONCOLOGY/ HEMATOLOGY ns»vim v n mih. M Bl ISMI !»'. Kl l.\NI> Critical Review« in Oncology/Hematology IS (199?) 35-48 In utero transplantation of hematopoietic stem cells Alan W. Flake3, Esmail D. Zanjani*b "Department of Surgery. Division of Pediatric Surgery. Fetal Treatment Program. Universit v of California. San FrumiM» ami h Depu tment of Medicine. Veterans Affairs Medical Center. Reno. NV and Fetal Treatment Program. University of California. San Front isto. USA Výzkum krvetvorby a krevních chorob: • hematopoetické kmenové b. z lidských fetálních jater • intraperitoneální injekce do fetu ovce • lymfoidní prekurzory přetrvávaly až 3,5 roku po transplantaci BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. Ml Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep Graca Almeda-Porada. Christopher D. Porada, Jason Chamberlain, Ali Torabi, and Esmail D. Zanjani We took advantage of the proliferative and permissive environment of the developing preimmune fetus to develop a noninjury large animal model in sheep, in which the transplantation of defined populations of human hematopoietic stem cells resulted in the establishment of human hematopoiesis and led to the formation of significant numbers of long-lasting, functional human liver cells, with some animals exhibiting levels as high as 20% of donor (human) hepatocytes 11 months after transplantation. A direct correlation was found between hepatocyte activity and phenotype of transplanted cells, cell dose administered, source of cells used on a cell-pei-cell basis (bone marrow, cord blood, mobilized peripheral blood), and time after transplantation. Human hepatocytes generated in this model retained functional properties of normal hepatocytes, constituted hepatic functional units with the presence of human endothelial and biliary duct cells, and secreted human albumin that was detected in circulation. Transplanting popu- lations of hematopoietic stem cells can efficiently generate significant numbers of functional hepatic cells in this noninjury large animal model and thus could be a means of ameliorating or curing genetic diseases in which a deficiency of liver cells or their products threatens the life of the fetus or newborn. (Blood. 2004:104: 2582-2590) S 2004 by The American Society of Hematology Figure 1. Adult human HSCs generate significant numbers of hepatocytes in a noninjury fetal model. (A) Control sheep liver section (nontransp anted* stained with an antibody antihuman hepatocyte (clone OCH1E5) as described in 'Materials and methods" (B-C) Liver sections obtained at 3 weeks (B) and 4 months (C) after transplantation from sheep that received transplanted human BM CD34*Lin~ cells, stared with the same antibody showing a higher number of human hepatocytes in the latter (C). n Available online at wvvw.sciencedirect.com I Biology LLSliVI HR Development! Biology 295 (2006) 90 - 102 • oiinoi^oiiiiot- developmental » » » J. tin Iik'^c'v Jr>m Contribution of human embryonic stem cells to mouse blastocysts Daylon James , Scott A. Noggle , Tomasz Swigut, Ali 11. Brivanlou * /curatory of Uoieada- Embryolofy. The Kotkefeier UmAenity. 12 SO fcrf Ann**. New )bek NY 10021. USA K oca vol Uw publiokoa 18 imumy 2006. rcviioi 13 refcnury 2006. accepted 16 March 2006 AvaJahlc oeiix 12 June 2006 A jf^-r^ Oř , ■ c Merge - •* Oct 3/4 G CO ^ ^ GFP hESC - H Merge - 2 dny po injekci F 1 1 H OH ■ ^mm^Bmm mm Wv 9c afl G GFP hESC — D8,5 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 04 / 10.3. > y. Ví (Ml Generation of Chimeric Rhesus Monkeys Masahito Tachibana,1 Michelle Sparman,1 Cathy Ramsey,1 Hong Ma,1 Hyo-Sang Lee,1 Maria Cecilia T. Penedo,3 and Shoukhrat Mrtalipov1-2-* Cell 148, 285-295, January 20,2012 2012 - první primáti uměle vytvořená chiméra model: Makak rhesus vznik: agregace 6 x 4-buněčná zygota narození: Roku+Hex (dvojčata), Chiméro bez vývojových vad B I \ ■ Roku & Hex Chiméro Whole embryo aggregation