Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie
RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
DIFERENCIACE BUNĚK
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
• diferenciační potenciál buněk
• diferenciační dráhy
• růstové faktory
• indukovaná diferenciace
Program přednášky:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Vývoj mnohobuněčného organismu
• identický genom ve všech buňkách
• kontrola na úrovni genové exprese
1. buněčná proliferace
2. diferenciace buněk
3. buněčné interakce
4. pohyb buněk
5. buněčná smrt
Lidský organismus:
1 zygota → 1013 buněk (250 různých typů)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
DIFERENCIAČNÍ POTENCIÁL BUNĚK
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Časná embryogeneze u savců:
• zygota
• morula (8, resp. 16 buněk = blastomery)
• blastocysta (~ 64 buněk)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Blastocysta:
• trofoektoderm →
extraembryonální tkáně (placenta)
• inner cell mass (ICM) →
embryo
Gastrulace → 3 zárodečné listy:
• ektoderm (neurální a epidermální buňky)
• mesoderm (svalová a pojivová tkáň)
• endoderm (epitel vnitřních orgánů)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Ektoderm
• CNS
• sítnice a čočky
• lebeční a senzorická ganglia a nervy
• pigmentové buňky
• pojivová tkáň hlavy
• epidermis
• vlasy, ochlupení
• prsní žlázy
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Mesoderm
• lebka a kostra
• svalová tkáň (lebka i kosterní svalstvo)
• dermis
• pojivová tkáň
• urogenitální systém
• střevní svalovina
• srdce
• krevní a lymfatické buňky
• slezina
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Endoderm
• žaludek
• tračník
• játra
• slinivka
• močový měchýř
• epiteliální výstelka průdušnice, plic, hltanu,
štítné žlázy, střev
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Totipotence
• nelimitovaný diferenciační potenciál
• schopnost tvořit embryonální i extraembryonální
tkáně
• časná stádia rýhování zygoty (1-4 dny)
Pluripotence
• schopnost tvořit buňky všech 3 zárodečných listů
• buňky ICM (embryonální kmenové buňky, 5-14dní)
Multipotence
• schopnost tvořit buňky příslušného typu tkáně
• např. hematopoetické kmenové buňky, neuronální
kmenové buňky…
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
totipotentní buňka
(zygota, blastomery)
pluripotentní buňky
(embryonální kmenové)
multipotentní buňky
(hematopetické kmenové)
progenitorové buňky
terminálně diferencované
buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Rozdíl v diferenciačním
potenciálu kmenových a
progenitorových buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Eukaryontní buňka:
• 5000 různých bílkovin (109 - 1010 molekul)
• každý buněčný typ vytváří asi 100 specifických
proteinů
• housekeeping genes:
exprimovány konstitutivně na relativně nízké
úrovni ve všech buňkách organismu
• housekeeping proteins:
esenciální metabolické enzymy, buněčné
komponenty
• exprese různých genů závisí na typu buňky, fázi
buněčného cyklu atd.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Příčiny diferenciace:
• postupné změny v aktivitě genů
(programovány v genomu)
• odpověď na molekulární signály vysílané
ostatními buňkami
• odpověď na fyzikální kontakt s ostatními
buňkami
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Signály regulující diferenciaci
 Solubilní regulátory
• Hormony (glukagon, hydrokortison, tyroxin,…)
• Růstové faktory (TGF-transformující růstový faktor,
FGF-fibroblastový růstový faktor, interleukiny, …)
• Vitaminy (D, A …)
• Ionty (Ca2+, …)
 Fyzické kontakty mezi buňkami (gap junctions)
 Kontakt buněk s mezibuněčnou matrix (kolagen, laminin, …)
 Polarita a tvar buněk
 Fyzikální parametry prostředí (teplota, parciální tlak O2, …)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Molekulární mechanismy diferenciace
• nejdůležitějším místem regulace je iniciace
transkripce
• vazba regulačních proteinů na specifické sekvence
DNA (regulační oblasti)
• relativně malý počet strukturních motivů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Molekulární mechanismy diferenciace
• 2 základní mechanismy účinku regulačních proteinů:
a) ovlivnění vazby RNA polymerázy a transkripčních
faktorů na promotor
b) lokální modifikace struktury chromatinu v oblasti
promotoru
• kombinace regulačních proteinů
• u člověka asi 3000 TFs
• ±5 TFs působí společně a reguluje transkripci jednoho
genu
• jeden TF reguluje více genů (pozitivně i negativně)
• tkáňová specifita
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Zachování exprese genů po rozdělení buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
DIFERENCIAČNÍ DRÁHY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Diferenciace
buňky směřovány do určitého vývojového směru (linie) – tento
stav nelze měnit (například buňky erytroidní linie „nepřeskočí“ do
linie myeloidní)
Dediferenciace
ztráta diferencovaného fenotypu
• je obvyklá in vitro (adaptace na kultivační podmínky)
• in vivo u nižších živočichů (regenerace obojživelníků)
• experimentálně – příprava iPS cells
Transdiferenciace
schopnost určitých buněk určité tkáně (včetně SCs nebo
progenitorů) diferencovat do buněk typických pro jiné orgány
nebo tkáně (např. hematopoetické)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Epigenetic landscape: H.C. Waddington (1957)
Epigenetic landscape: T. Graf & T. Enver (2009)
- role transkripčních faktorů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Indukovaná transdiferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Diferenciační
potenciál
hematopoetických
kmenových buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Diferenciace
krevních buněk
- vliv růstových
faktorů a jiných
cytokinů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Vliv TFs na diferenciaci
krevních buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Porucha diferenciace krevních buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Průběh neuronální diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Regulace neuronální
diferenciace
TGF- superfamily
• TGF-  (1-3)
(transforming/tumor growth factor)
• BMPs
(bone morphogenetic proteins)
• nodal
• activin
Růstové faktory
• FGF
• LIF
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Neuronální diferenciace
Kmenová buňka:
• nestin
• GFAP
• DNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Neuronální
diferenciace
Progenitorová
buňka:
• -tubulin III
• GFAP
• DNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Neuronální diferenciace
Neurony:
• -tubulin III
• DNA
Gliové buňky:
• GFAP
• DNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Diferenciace příčně pruhované svaloviny
diferenciaci doprovází
• zástava buněčného cyklu
• změna morfologie
• fůze v syncytia
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Diferenciace příčně pruhované svaloviny
• svalové prekurzory exprimují TF: mrf4, myf5 a myoD
• in vitro: po odstanění růstových faktorů se spustí diferenciace
• exprese svalově specifických proteinů:
myogenin, svalový aktin, myosin II, tropomyosin ...
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
RŮSTOVÉ FAKTORY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Růstové faktory (Growth Factors)
• vazba na příslušný membránový receptor
• aktivace specifické intracelulární signální dráhy
• stimulace přežívání a růstu buněk (metabolismus,
zvyšování objemu, antiapoptotické)
• některé fungují i jako mitogeny (např. PDGF), resp.
induktory diferenciace
• např. cytokiny, hormony (insulin), ... růstové faktory
Cytokiny
• signální proteiny ovlivňující buněčnou proliferaci,
diferenciaci a imunitní odpověď
(interleukiny, INFs, G-CSF, GM-CSF, chemokiny...)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Příklady růstových faktorů
EGF (Epidermal Growth Factor)
• specifická vazba na EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)
→ aktivace RTK kaskády
FGF Family (Fibroblast Growth Factor)
• 22 molekul
• FGF2 = bFGF (basic fibroblast growth factor)
• receptory FGFR1-4
VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)
• stimulace vaskulárních endotelií → angiogeneze
• v případě hypoxie - exprese HIF -> VEGF
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
TGF (Transforming/Tumor Growth Factor)
• up-regulace u některých typů nádorů
• schopnost indukovat nádorovou transformaci v
podmínkách in vitro (krysí fibroblasty ledvin)
• TGF-α (makrofágy, mozkové buňky, keratinocyty):
vývoj epitelu - příbuznost s EGF, vazba na EGFR
• TGF- - isoformy  1,  2,  3: diferenciace buněk,
vývoj embrya, regulace imunitního systému, apoptóza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Neurotrofiny (Neurotrophins)
• produkovány cílovou tkání → přežívání neuronů,
neuronální diferenciace
• receptory:
p75, Trk receptory (A,B,C)
• NGF (nerve growth factor)
• BDNF (brain-derived
neurotrophic factor)
• NT-3 (neutrophin-3)
• NT-4 (neutrophin-4)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Pleiotropní efekt BDNF
Hematopoetic Precursor Cell
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
BDNF-indukovaná neovaskularizace
HPCs- hematopoietic precursor cells, MCs - mural cell, ECs endothelial cells
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Příklady cytokinů
EPO (Erythropoietin)
• produkce v ledvinách
• stimulace tvorby erytrocytů
• rekombinantní EPO
TPO (Thrombopoietin)
• produkce ve slezině a v ledvinách
• stimulace tvorby megakaryocytů, krevních destiček
G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor)
• stimulace tvorby granulocytů/neutrofilů
GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating
Factor)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
RECEPTOROVÉ TYROZIN-KINÁZY
funkce: regulace proliferace, diferenciace, metabolismu, aj.
lidský genom : 59 genů (+alternativní sestřih) → 20 receptorových rodin
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
DOMÉNY :
• extracelulární (receptorová)
• transmembránová
• cytoplasmatická (tyrozin kinázová)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
AKTIVACE:
dimerizace vlivem růstových faktorů → cross-fosforylace
a) → konformační změna – stimulace katalytické aktivity
b) → tvorba vazebných míst pro domény adaptorových
proteinů (Grb-2)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
INDUKOVANÁ DIFERENCIACE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Indukovaná diferenciace
• induktory diferenciace (růstové faktory, vitamíny,
inhibitory kináz, změny v kultivaci, syntetické látky…)
• indukce příslušné diferenciační dráhy
• inhibice signálních drah pro „self-renewal“
Příklady induktorů diferenciace in vitro:
• kyselina all-trans retinová (ATRA)
• 1,25-dihydroxycholekalciferol (1,25(OH)2-D3)
• phorbol myristylacetát (PMA)
• trichostatin
• dimethylsulfoxid (DMSO)
• SU5402 (inhibitor FGFR1)...
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Kyselina all-trans retinová (ATRA)
jako induktor diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
1. vazba na jaderné receptory (RAR, RXR)
2. vazba komplexu na regulační oblast (RARE)
3. acetylace histonů  aktivace transkripce
Kyselina retinová (RA) jako modelový
induktor diferenciace (a morfogeneze)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Linie HL-60:
• induktory granulocytární diferenciace:
kyselina all-trans retinová (ATRA)
dimethylsulfoxid (DMSO)
• induktory monocyto/makrofágové diferenciace:
phorbolmyristyl acetát (PMA)
1,25-dihydroxyvitamin D3
• lidská myeloidní leukémie
• spontánní diferenciace:
asi 10 % buněk populace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Diferenciace linie HL-60 do stádia granulocytů:
Induktor: 1mM kyselina all-trans retinová
Marker: CD-66b (CD-67)
Detekce: anti-CD66b, SwAM-FITC
18,26%
33,25% 33,28%
Granulocytární diferenciace HL-60: flow cytometrie / CD66b
1mM ATRA 1mM ATRA + 13mM CA 1mM ATRA + 52mM CA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Diferenciace linie HL-60 do stádia makrofágů:
Induktor: 1,6 nM phorbolmyristyl acetát (PMA)
Marker: CD-14
Detekce: anti-CD14, SwAM-FITC
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Linie P19:
• myší embryonální karcinom
• 7denní embryo do testes
• „embryoid bodies“ (EB)
• induktory mesodermální diferenciace:
kyselina all-trans retinová (ATRA)
dimethylsulfoxid (DMSO)
• induktor neuronální diferenciace:
kyselina all-trans retinová (ATRA)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Schéma diferenciace buněk P19
metoda kultivace na
bakteriologických miskách
metoda „visících kapek“
(hanging drops)
Mesodermální diferenciace buněk P19:
Induktor: 0,8% DMSO
Marker: myosin II
Detekce: anti-skeletal myosin, SwAM-FITC
50 mm 100 mm
160 mm 50 mm
ATRA – 1.den DMSO – 2.den
ATRA – 4.den DMSO – 4.den
Neuronální diferenciace buněk P19:
Induktor: 1mM kyselina all-trans retinová (ATRA)
Marker: neurofilamin
Detekce: anti-neurofilament 160, SwAM-FITC
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Praktické využití indukované diferenciace:
• základní výzkum
• diferenciační terapie v onkologii
→ hematologické malignity (APL, AML)
→ vybrané typy solidních nádorů (neuroblastom)
• diferenciační terapie v dermatologii
→ akné
• příprava buněčných derivátů in vitro
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Retinoidy jako induktory diferenciace v klinické praxi:
Roaccutane
(isotretinoin, 13-cis-RA)
• akné, neuroblastom
Vesanoid
(tretinoin, all-trans-RA)
• akutní leukemie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
COMBAT
léčba solidních nádorů (meduloblastom , neuroblastom, sarkomy...)
celecoxib inhibitor cyclooxygenázy antiangiogenní účinek
etoposid inhibitor topomerázy II zástava b. cyklu
temozolomid alkylační činidlo apoptóza
kys. retinová diferenciační činidlo diferenciace/apoptóza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie - jaro 2014 - 07 / 31.3.
Teoretické modely diferenciční terapie
• přímá diferenciace nádorové buňky
• oprava onkogenního mechanismu vede k původní diferenciaci
• „přesměrování“ na prekurzor  jiná diferenciační dráha